单纯疱疹病毒2 gD基因的树突细胞疫苗免疫效应研究

【摘要】 目的 观察单纯疱疹病毒2 gD（HSV-2 gD）基因的树突细胞（DC）疫苗在动物实验中诱发特异性免疫应答情况。 方法 用腺病毒介导的、HSV-2 gD基因修饰的DC（pAdeno-HSV-2 gD-DC）疫苗免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后第10天检测小鼠血清中gD IgG水平;同时,分离小鼠脾淋巴细胞,用HSV-2gD蛋白刺激,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况、乳酸脱氢酶释放法测定细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性及ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中干扰素γ（IFN-γ）、白介素4（IL-4）水平。实验分为4组,pAdeno-DC组、pAdeno-HSV-2 gD-DC组、DC组、空白对照组,每组10只。 结果 pAdeno-HSV-2 gD-DC组小鼠血清内可检测到高滴度针对HSV-2gD蛋白的抗体（A450值为0.313 ± 0.034）,与pAdeno-DC组（0.034 ± 0.009）、DC组（0.028 ± 0.009）、空白对照组（0.026 ± 0.010）比较,差异有统计学意义（P < 0.05）。pAdeno-HSV-2 gD-DC可以诱导小鼠脾淋巴细胞增殖（刺激指数为1.600 ± 0.215）、有效杀伤靶细胞（CTL活性为37.1%）,与pAdeno-DC组（分别为1.063 ± 0.070和16.0%）、DC组（1.056 ± 0.063和14.9%）、空白对照组（1.020 ± 0.051和15.7%）比较,差异均有统计学意义（P < 0.05）。pAdeno-HSV-2 gD-DC组小鼠分离的脾细胞培养上清可以检测到高水平IFN-γ（A450值为0.568 ± 0.031）和IL-4（A450值为0.544 ± 0.043）,与pAdeno-DC组（0.266 ± 0.021和0.278 ± 0.037）、DC组（0.271 ± 0.023和0.275 ± 0.044）、空白对照组（0.252 ± 0.012和0.245 ± 0.051）比较,差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 构建的pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗可以在小鼠中产生较强的特异性免疫应答。     

单纯疱疹病毒II型CTL表位DNA疫苗的Th1/Th2免疫应答研究

目的探讨单纯疱疹病毒II型(HSV-2)CTL表位疫苗对小鼠Th1/Th2型免疫应答的影响。方法用构建的HSV-2pVAX-gD-CTL重组质粒免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后第4周检测小鼠血清中gDIgG水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中INF-γ,IL-4水平;流式细胞仪测定小鼠CD4+,CD8+T淋巴细胞亚群。结果HSV-2pVAX-gD-CTL疫苗免疫小鼠后可以诱导脾淋巴细胞增殖及分泌INF-γ和IL-4,诱导CD4+,CD8+T细胞百分比的升高;并能刺激血清HSV-2gD特异性抗体的产生。其中pVAX-gD-CTL组在脾淋巴细胞刺激指数及其分泌INF-γ水平、CD4+,CD8+T细胞百分比升高方面均显著高于pVAX-gD对照组。结论CTL表位对单纯疱疹II型重组DNA疫苗诱导的Th1型免疫应答有促进作用。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型CTL表位DNA疫苗的Th1/Th2免疫应答研究

目的探讨单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）CTL表位疫苗对小鼠Th1/Th2型免疫应答的影响。方法用构建的HSV-2pVAX-gD-CTL重组质粒免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后第4周检测小鼠血清中gDIgG水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中INF-γ,IL-4水平;流式细胞仪测定小鼠CD4^＋,CD8^＋T淋巴细胞亚群。结果HSV-2pVAX-gD-CTL疫苗免疫小鼠后可以诱导脾淋巴细胞增殖及分泌INF-γ和IL-4,诱导CD4^＋,CD8^＋T细胞百分比的升高;并能刺激血清HSV-2gD特异性抗体的产生。其中pVAX-gD-CTL组在脾淋巴细胞刺激指数及其分泌INF-γ水平、CD4^＋,CD8^＋T细胞百分比升高方面均显著高于pVAX-gD对照组。结论CTL表位对单纯疱疹Ⅱ型重组DNA疫苗诱导的Th1型免疫应答有促进作用。     

单纯疱疹病毒疫苗的研究进展

单纯疱疹病毒作为一个严重危害人类社会健康的重要病原,已逐渐受到重视,由于它易形成潜伏感染,易复发,因而预防及防复发治疗是关键,现综合近年来国外有关HSV疫苗,特别是几种新型疫苗的研究,并对各种疫苗的优缺点作一简要概述。     

脂质体转染对HSV-2多表位复合DNA疫苗诱导小鼠特异性免疫应答的影响

目的研究不同免疫方式对HSV-2多表位复合DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的影响,探索新型HSV-2DNA疫苗的有效免疫方式。方法利用真核表达质粒pcDNA3.1构建HSV-2糖蛋白gD,gB,gC和早期表达蛋白ICP 27的多表位复合DNA疫苗HV-pcDNA3.1。C57/BL6小鼠分为脂质体包裹pcDNA3.1空载体质粒对照组、脂质体包裹HV-pcDNA3.1质粒和裸质粒HV-pcDNA3.1肌肉注射免疫三组。ELISA检测小鼠血清HSV-2特异性IgG,IL-2和IFN-γ,乳酸脱氢酶法检测杀伤性T淋巴细胞(CTL)活性。结果与裸质粒免疫组相比,脂质体包裹HV-pcDNA3.1免疫组小鼠血清中HSV-2特异性IgG和IFN-γ表达明显增加,CTL活性增强。结论脂质体包裹质粒比裸质粒肌肉注射方式免疫小鼠能显著提高HSV-2多表位复合DNA疫苗的免疫活性。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型新型DNA疫苗的构建

目的：针对Ⅱ型单纯疱疹病毒（HSV-2）包膜糖蛋白gD以及包膜糖蛋白gB的CTL表位,构建重组真核表达质粒pVAX—gD—CTL。方法：根据GeneBank提供的HSV-2G株糖蛋白D基因（gD）序列设计PCR引物,以已构建好的pc—gD为模板,特异性扩增HSV-2gm片段,将其克隆于pVAX1载体中构建成质粒pVAX—gD,再将其双酶切后引入CTL片段构建重组真核表达质粒pVAX—gD—CTL。结果：将重组的pVAX—gD—CTL真核表达质粒转化大肠杆菌后,筛选阳性克隆进行酶切及测序鉴定。结论：初步构建HSV-2 pVAX—gD—CTL重组真核表达质粒。     

单纯疱疹病毒的致病特点及人体抗单纯疱疹病毒免疫

单纯疱疹病毒属双链DNA病毒,主要引起皮肤和黏膜损伤,表现为口唇疱疹、疱疹性皮炎、生殖器疱疹等.潜伏感染、周期性复发是单纯疱疹病毒的致病特性.单纯疱疹病毒感染人体后能激发人体固有和获得性免疫应答,包括固有免疫细胞、细胞因子和T淋巴细胞都参与病毒的清除;宿主细胞还可通过启动凋亡机制抑制单纯疱疹病毒的复制及扩散.但是在某些情况下,该病毒能通过潜伏感染和某些机制逃逸免疫细胞的清除,这也是单纯疱疹病毒不能根除的重要原因.为了减少病毒复发频率,已研究出一些可以作为疫苗的单纯疱疹病毒蛋白,但尚未应用于临床.因此,明确单纯疱疹病毒所诱发的机体免疫反应及其免疫逃逸机制对疾病的预防、治疗及新药研发具有重要意义.     

单纯疱疹病毒2 gD蛋白T细胞表位区的预测及克隆

目的预测并克隆单纯疱疹病毒2 gD蛋白T细胞抗原表位集中区。方法根据相关计算机软件和互联网服务器进行表位预测;提取单纯疱疹病毒2基因组,用特异性引物扩增预测的gD蛋白T细胞抗原表位集中区基因,酶切后将目的基因插入载体pGEX-4T-1,对重组载体酶切及测序鉴定。结果预测得到了单纯疱疹病毒2gD蛋白T细胞抗原表位集中区,构建成功重组载体pGEX-gD,经测序确认序列正确。结论单纯疱疹病毒2 gD蛋白T细胞表位集中区的成功预测及克隆可为今后单纯疱疹病毒疫苗的研究打下基础。     

信号肽序列修饰的单纯疱疹病毒-2多表位复合DNA疫苗构建

目的:构建经糖蛋白gD信号肽修饰的单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP 27的多表位复合DNA疫苗.方法:国内HSV-2野生株经测序与PCR鉴定后利用PCR技术从其基因组中扩增出HSV-2 ICP27 377-459、gD146-179、gD223-306、gB529-606、gC247-282、gD1-77 6个基因片段,PCR鉴定后按先后顺序,采用多基因片段一步酶切连接法获得HV融合基因片段,经pGEMT载体克隆后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1载体中,构建出重组真核表达质粒HV-pcDNA3.1,并对其进行酶切分析及测序鉴定.PCR扩增gD146-179信号肽片段,进一步酶切连接构建重组质粒gDs-HV-his-pcDNA3.1,并对其进行测序鉴定.结果:酶切重组质粒HV-pcDNA3.1,电泳可见两条带,分别为融合基因HV(1.3 kb)和线性质粒pcDNA3.1(5.4 kb).测序结果表明,克隆基因插入方向正确,重组质粒gDs-HV-his-pcDNA3.1与GenBank HSV-2中相关序列同源性达99.9%.结论:成功构建了经糖蛋白gD信号肽修饰的HSV-2多表位复合DNA疫苗.     

pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗阳离子脂质体的制备

目的制备pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗阳离子脂质体,为基因免疫和基因治疗寻找一种简单、经济、有效的DNA投递系统。方法采用逆向蒸发法,用卵磷脂、胆固醇、十八胺制备成阳离子脂质体包封pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗,在透射电镜下观察脂质体颗粒的大小,应用紫外分光光度计检测DNA疫苗的包封率,免疫组化检测其转染真核细胞的效果。结果制备的脂质体呈圆形、粒径大小较一致,平均粒径为580nm,DNA疫苗脂质体包封率达到50%~55%,能有效转染真核细胞。结论成功制备了pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗阳离子脂质体。该方法作为提高基因免疫效果的简单、经济、有效的手段之一,为其进一步的研究打下了基础。     

疱疹病毒gD基因多聚核苷酸疫苗的构建和表达

目的：构建疱疹病毒gD2基因多聚核苷酸疫苗并在实验动物中得到表达。方法: 将构建的pcDNA3－gD2的质粒DNA注射入豚鼠的舌肌中,每周1次,共3次,最后1次免疫48h后引颈处死豚鼠,并取其舌、肝、脾、肾、心脏及股四头肌,用免疫组化法（SP法）检测gD2抗原的表达。结果：重组质粒组gD2真核表达载体免疫接种后,均可在舌肌测到抗原表达,而对照组均为阴性。结论：重组质粒gD2真核表达载体可以在豚鼠舌肌中表达,对建立基因免疫防治疱疹病毒感染奠定一定基础。     

单纯疱疹病毒2型DNA疫苗对豚鼠抗病毒感染的研究

目的 探讨单纯疱疹病毒2型DNA疫苗的抗病毒感染效应.方法 重组DNA疫苗pcgD免疫雌性豚鼠,采用血清中和实验检测抗体,单纯疱疹病毒2型(HSV-2)sav株接种豚鼠,观察DNA疫苗保护动物抵抗HSV-2病毒感染的能力.结果 pc-gD免疫豚鼠产生的中和抗体效价远远高于对照组和生理盐水组,感染病毒后,表现出初发感染推迟,复发感染的严重程度下降.结论 DNA疫苗能有效地保护动物免受HSV-2病毒的攻击,延缓初发感染,减少复发感染.     

单纯疱疹病毒Ⅱ型细胞毒性T淋巴细胞表位重组DNA疫苗的构建表达及鉴定

目的：针对单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）包膜糖蛋白gD和gB的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）表位,构建重组真核表达质粒pVAX-gD-CTL。方法：用PCR方法从已构建好的pc-gD真核表达质粒中扩增gD片段,将其与CTL表位共同连接到pVAX1载体,构建重组真核表达质粒pVAX-gD-CTL。采用免疫组化和Western-blotting法鉴定重组质粒的表达情况,免疫BALB／c小鼠,进行CTL活性鉴定。结果：构建的重组质粒能在非洲绿猴肾细胞（COS-7细胞）内表达。该重组DNA疫苗免疫接种BALB／c小鼠后,其CTL活性增高。结论：成功构建HSV-2 pVAX-gD-CTL重组真核表达质粒,并能在真核细胞内表达,该DNA疫苗对细胞免疫有明显的促进作用。     

白介素2基因佐剂协同HSV-2多表位复合DNA疫苗诱导小鼠免疫应答

目的 研究白介素2(IL-2)cDNA协同HSV-2多表位复合DNA疫苗免疫对小鼠体液和细胞免疫应答的影响.方法 利用真核表达质粒pcDNA3.1分别构建HSV-2糖蛋白gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP27的多表位复合DNA疫苗HV-pcDNA3.1和IL-2的真核表达质粒IL-2-pcDNA3.1.15只C57/BL6小鼠分为3组,分别接受pcDNA3.1空载体注射、HV-pcDNA3.1单独免疫或HV-pcDNA3.1及IL-2-pcDNA3.1联合免疫.共免疫2次,间隔2周.末次免疫3周后.ELISA法检测小鼠血清HSV-2特异性IgG、IL-2和IFN-γ,淋巴细胞特异性增殖反应和乳酸脱氢酶法检测杀伤性T淋巴细胞(CTL)功能.结果 与HV-pcDNA3.1单独免疫组相比.IL-2-pcDNA3.1的协同免疫可以提高小鼠血清中和IFN-γ表达(1956.19±219.60ng/L,P<0.05),增强淋巴细胞特异性增殖反应(促细胞增殖率为2.75%±0.26%,P<0.05)和CTL活性(47.91%±15.09%,P<0.05).小鼠血清HSV-2特异性IL-2水平在协同免疫组为(1421.16±220.98)ng/L,HV-pcDNA3.1单独免疫组为(1246.84±157.02)ng/L.两组间差异无统计学意义.结论 IL-2cDNA的协同免疫可以显著提高HSV-2多表位复合DNA疫苗诱导的细胞免疫应答水平.     

用聚合酶链反应检测生殖器疱疹中单纯疱疹病毒DNA

用聚合酶链反应检测生殖器疱疹中单纯疱疹病毒ＤＮＡ袁钟岱胡春梅易来龙袁星颜小武周耀湘王康生（广东省东莞市慢性病防治院５１１７００）朱文元（指导）骆丹李晓捷（南京医科大学一附院皮肤科２１００２９）应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测单纯疱疹病毒ＤＮＡ，从分子水...     

单纯疱疹病毒2型抗原DNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达重组单纯疱疹病毒2型(HSV-2)抗原。方法：用PCR方法从单纯疱疹病毒中扩增HSV-2DNA片段，约500bp，克隆到pMD18T载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRI和BamHI消化pMD18T／HSV-2重组质粒，分离HSV-2片段，并插入质粒表达载体pBV220的相应限制酶位点，酶谱分析鉴定重组表达载体pBV220／HSV-2。转化菌株经42℃诱导，用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果：PCR扩增的DNA片段与HSV-2的目的片段大小一致。重组质粒pMD18T／HSV-2的DNA序列分析显示克隆的DNA序列与文献报道的HSV-2 DNA序列一致。SDS—PAGE表明重组蛋白相对分子量为18000，表达量达菌体总蛋白的20％左右，Western blot分析显示重组蛋白能特异地与抗HSV-2抗体结合。结论：已成功构建了表达具有功能的重组HSV-2抗原的工程菌株。     

单纯疱疹病毒2型感染血清流行病学研究进展

单纯疱疹病毒2型的发病率近年来不断上升，其与人类免疫缺陷病毒1型的感染有协同作用。单纯疱疹病毒2型引起的新生儿疱疹发病率也在上升。就单纯疱疹病毒2型的感染特点，流行病学状况以及单纯疱疹病毒2型血清型特异性诊断方法作一综述。     

单纯疱疹病毒DNA在多形红斑皮损中的表达

应用聚合酶链式反应方法，对26例多形红斑组织中的单纯疱疹病毒DNA进行检测。18例为阳性，阳性率为72％，对照组选择结节性红斑11例，固定性药疹8例，均为阴性。结果对研究单纯疱疹病毒在多形红斑发病中的意义和临床治疗有指导价值。     

务工人员单纯疱疹病毒2型感染状况分析

目的了解浙西地区农村外出务工人员单纯疱疹病毒2型(HSV-2)感染状况及相关危险因素。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测219例外出务工人员和155例健康对照血清中抗HSV-2IgG抗体。结果外出务工人员抗体检出率26.5%,对照组检出率17.4%,两组抗体检出率差异有显著性(P<0.05);按性别、年龄、教育程度、婚姻状况、不洁性行为等感染相关因素作性别分层分析,<25岁女性感染率最高,达41.2%,Logistic回归分析表明,不洁性行为是HSV-2感染的危险因素(P<0.01)。结论外出务工人员HSV-2感染率明显高于对照组,开展针对农村外出务工人员的性病知识健康教育和医疗保健活动势在必行。     

用聚合酶链反应检测多形红斑皮损中单纯疱疹病毒的DNA

用聚合酶链反应检测２３例多形红斑石蜡组织切块中ＨＳＶ－ＤＮＡ，１６例为阳性（６９．５６％），其中ＨＳＶ－Ⅰ型１３例（８１．２５％），ＨＳＶ－Ⅱ型３例（１８．７５％）。对照组为银屑病３例，大疱性类天疱疮５例，扁平苔藓３例均为阴性。对于探讨ＨＳＶ在多形红斑发病机理中的作用有重要意义。