荷载自体白血病抗原的DC-CIK细胞预防急性髓细胞性白血病自体造血干细胞移植后复发的临床研究

目的探讨荷载自体白血病抗原的树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)细胞对于预防急性髓细胞性白血病(AML)自体造血干细胞移植后复发的作用。方法实验组:选取初治AML CR1期、自愿接受自体造血干细胞移植联合荷载自体白血病抗原的DC-CIK细胞治疗的患者32名,采用常规预处理方案,于移植+5—+10 d将荷载自体白血病抗原的DC-CIK细胞回输患者,采用流式细胞术、ELISA等方法测定DC-CIK细胞各指标情况;对照组:选取同期未采用DC-CIK细胞治疗的AML CR1期移植患者21名;观察、比较2组患者造血恢复情况、移植相关不良反应,评估3年总生存率。结果实验组患者CIK经荷载自体白血病抗原的DC致敏后,CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞比例分别为(80.1±3.3)%和(37.1±4.5)%,较对照组[(56.1±3.8)%和(18.1±3.1)%]均有所上调(P<0.05),分泌IFN-γ的水平为(3 985.4±223.1)pg/ml,较对照组[(1 688.5±162.1)pg/ml]明显升高(P<0.05),除一过性发热、寒颤外,无其他不良反应。造血恢复情况、移植相关不良反应2组差异无统计学意义,自体造血干细胞移植后经DC-CIK细胞输注,3年的总生存率为75.0%(24/32),较同期未使用荷载白血病抗原DC-CIK细胞的自体造血干细胞移植患者的生存率明显提高。结论荷载自体白血病抗原的DC-CIK细胞用于预防AML自体造血干细胞移植后复发是安全和有效的。     

应用CD19修饰的嵌合抗原受体T细胞治疗淋巴细胞白血病

应用嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell,CAR T）治疗急性和慢性淋巴细胞白血病,在近期已取得了新进展。CAR T细胞是通过将T细胞受体基因和抗CD19抗体基因嵌合,转染至T细胞,在体外扩增以后输注给患者来治疗白血病的新型免疫治疗。经过基因改造后的CAR T细胞的表面具有特异性位点,可以识别淋巴细胞白血病中B细胞表面的CD19抗原。CD19抗原的持续刺激可使CAR T细胞不断增殖与活化,CAR T在患者体内可以增殖1000倍,有效杀伤急性和慢性淋巴细胞白血病细胞。本文就CAR T细胞及其对急性和慢性淋巴细胞白血病的疗效进行综述。     

CD3~+CD56~+NKT样细胞在急性白血病患者体内表达的研究

目的探讨CD3+CD56+NKT样细胞在急性白血病患者治疗前后体内的表达情况。方法分别取急性白血病(急性髓系白血病43例,急性淋巴细胞白血病12例,急性混合细胞白血病5例)及非恶性肿瘤(10例)患者骨髓血2ml送流式细胞仪检测,比较白血病患者治疗前后及非恶性肿瘤患者体内CD3+CD56+NKT样细胞的表达情况。结果急性白血病患者初治组与非恶性肿瘤患者对照组间比较,急性白血病患者骨髓中CD3+CD56+NKT样细胞比例明显比对照组低(P0.01);急性白血病患者治疗后骨髓中CD3+CD56+NKT样细胞比例明显比治疗前高(P0.01),且与缓解程度及时间呈正相关;急性白血病患者治疗后骨髓中CD3+CD56+NKT样细胞比例与非恶性肿瘤对照组比较无统计学意义(P0.05);不同类型白血病之间,急性早幼粒细胞白血病治疗后CD3+CD56+NKT样细胞比例明显较其他类型高(P0.05),急性髓系白血病(除M3外)与急性淋巴细胞白血病之间比较CD3+CD56+NKT样细胞比值结果比较无统计学意义(P0.05)。结论急性白血病患者CD3+CD56+NKT样细胞反映了机体的免疫功能,化疗后CD3+CD56+NKT样细胞明显增多可能是预后较好的标志之一。     

急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞亚群的检验分析

目的应用流式细胞学技术检测急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞亚群的变化分析,揭示急性髓细胞白血病中外周血淋巴细胞亚群的变化规律,为临床个体化治疗累积分子机制研究资料。方法应用流式细胞学技术检测80例急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞,应用相应的单克隆抗体检测CD3~+T淋巴细胞百分比、CD4~+T淋巴细胞百分比、CD4~+/CD8~+比值及CD16~+/CD56~+NK细胞百分比。同时通过CD45/SSC设门分析,分别测定多种CD分子的表达率,并通过配对检验分析不同高表达CD分子相关性。结果急性髓细胞白血病(AML)组患者CD3+T淋巴细胞百分比、CD4~+T淋巴细胞百分比、CD4~+/CD8~+比值及CD16~+/CD56~+NK细胞百分比显著低于健康对照组,CD33、CD15、Cyt-MPO和CD64阳性表达不仅比例高,而且表达量高。配对分析表明CD33/CD15和CD33/Cyt-MPO的抗原表达有差异性。结论 AML患者免疫系统低下,外周血CD33、CD15、CD64和Cyt-MPO的表达高。     

自体外周血干细胞治疗急性髓性白血病60例的护理

目的总结急性髓细胞白血病（Acute Myeloid Leuk Emia,AML）患者缓解期自体外周血干细胞移植的护理措施。方法回顾性分析60例急性髓细胞白血病患者缓解期自体外周血干细胞移植护理资料。结果 60例患者均顺利收集了足够干细胞植入的数量,并且较异基因移植相关毒性低,造血重建速度快。结论持续的心理护理、充分的技术准备、娴熟的操作技巧、严密的术中监测是确保急性髓细胞白血病自体外周血干细胞移植成功的关键。     

自体造血干细胞移植联合异体细胞因子诱导的杀伤细胞及白细胞介素2治疗高危急性髓系白血病2例

背景：自体造血干细胞移植治疗高危急性髓系白血病的复发率极高,如何降低移植后复发率至今仍是难点。目的：观察自体造血干细胞移植联合异体细胞因子活化杀伤（CIK）细胞及白细胞介素2治疗高危急性髓系白血病的临床效果。方法：2例高危急性髓系白血病患者,经诱导化疗及巩固强化治疗后,在第1次缓解期行自体造血干细胞移植,移植后1个月给予三四疗程异体CIK细胞输注,每隔半年1个疗程,每疗程分5次输注异体CIK细胞,每隔1日输注1次。每次输注CIK细胞前半小时内给予皮下注射白细胞介素2,第1次输注后隔日皮下注射白细胞介素2,半年后减为隔2日1次,1年后减为隔3日1次,1年半后减为1次/周,维持半年后结束,预防白血病复发。结果与结论：2例患者自体造血干细胞移植后输注异体CIK细胞及皮下注射白细胞介素2无发热、寒战、皮疹等不良反应,无骨髓抑制及移植物抗宿主反应,治疗安全。2例患者持续缓解时间分别为20个月及2年,目前仍无复发。首次得出对于无合适供者的高危急性髓系白血病患者,在缓解后可行自体造血干细胞移植联合异体CIK细胞及白细胞介素2治疗,有机会获得长期无病生存。     

CAR-T细胞治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病的临床观察——附3例报告

目的探索嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗复发/难治性急性B淋巴细胞白血病的效果。方法回顾性分析本院2015年4月-2016年1月3例复发/难治性急性B淋巴细胞白血病患者采用CAR-T细胞治疗的临床疗效。3例患者均为多次诱导化疗不能达到完全缓解,或复发后再次诱导治疗无效。均采集自体外周血T淋巴细胞进行转染、培养。回输前以氟达拉滨+环磷酰胺方案预处理,回输CAR-T细胞数量为0.97至1.0×106/kg。结果2例患者在CAR-T细胞输注后1月内达到完全缓解,1例患者无效。达到缓解的2例患者在CAR-T细胞治疗后的第3和第6个月复发。复发后的1例患者出现CD19阴性克隆复发;在整个治疗过程中,未发生严重的不良反应。结论 CAR-T细胞是治疗复发/难治CD19抗原阳性急性淋巴细胞白血病的有效方法,能够降低耐药患者体内肿瘤负荷,甚至达到完全缓解,但短期内复发较高且复发的白血病细胞可能出现CD19抗原缺失。因此,在临床的应用方法还需要进行临床研究,也可作为异基因造血干细胞移植前的桥接治疗。     

老年初诊急性髓细胞白血病患者CD4+CD25+调节性T细胞的表达

背景：研究证实,很多恶性肿瘤患者体内CD4+CD25+调节性T细胞存在高表达,近期也有研究发现,急性髓细胞白血病患者外周血CD4+CD25+目的：分析老年初诊急性髓细胞白血病患者CD4调节性T细胞同样表现出高比例表达。+CD25+方法：纳入初诊急性髓细胞白血病患者92例,将年龄在60岁以下者设为中青年组(n=22),年龄在60岁以上者设为老年观察组(n=70)。在老年观察组中,32例经规范化疗后完全缓解,设为完全缓解组;将余下38例设为老年组,依据FAB分型标准,分为M26例、M319例、M47例、M56例。另选择同期体检健康人群42名作为正常对照组。抽取受试者外周静脉血,检测CD4调节性T细胞的表达特点。+CD25+结果与结论：老年组、完全缓解组CD4调节性T细胞表达情况。+CD25highFOXP3+调节性T细胞比例高于正常对照组(P <0.01),并且老年组CD4+CD25highFOXP3+调节性T细胞比例高于完全缓解组(P <0.01)。老年组、完全缓解组CD4+FOXP3+T细胞比例高于正常对照组(P <0.01),并且老年组CD4+FOXP3+T细胞比例高于完全缓解组(P<0.01)。老年组CD4+CD25highFOXP3+调节性T细胞与CD4+ FOXP3+T细胞比例高于中青年组(P <0.01)。老年组不同分型间CD4+CD25high FOXP3+调节性T细胞和CD4+ FOXP3+T细胞比例比较差异均无显著性意义(P >0.05)。Pearson相关性检验结果显示,老年初诊急性髓细胞白血病患者外周血CD4+CD25high FOXP3+调节性T细胞比例和CD4+ FOXP3+T细胞比例呈正相关(r=0.87,P=0.019)。表明老年初诊急性髓细胞白血病患者CD4+CD25+调节性T细胞比例高于健康人群和中青年急性髓细胞白血病患者。     

Survivin致敏的树突状细胞疫苗激活抗白血病T细胞的实验研究

为研究survivin致敏树突状细胞（DC）疫苗对特异性T细胞的激活影响及对白血病细胞生长抑制作用，采用共聚焦显微镜及免疫沉淀-Western印迹等方法检测急性白血病细胞survivin表达；外周血单个核细胞体外培养，诱导DC细胞的形成；体外进行survivin抗原负载，制备survivin DC疫苗；survivin DC激发同基因型T细胞，用流式细胞术进一步分析T细胞表型；^3H-TdR法测定刺激指数（SI）；并用^51Cr释放法测定特异性的抗白血病CTL细胞毒活性。结果表明，检测19例初治急性白血病患survivin的表达率为84.2％；其荧光分布均在细胞胞浆内；免疫沉淀-Western印迹进一步分析证实其survivin蛋白表达；外周血单个核细胞体外诱导形成的DC细胞具有典型的DC的形态学特征；survivinDC可显刺激T细胞的活化增殖；survivin激活的T细胞中，CD4^ TH比例显较DC组高，DC激发的T细胞则以表达CD8和CD56为主；同时survivinDC显抑制白血病细胞的生长。结论：急性白血病细胞表达survivin抗原，利用survivinDC疫苗可有效地抑制白血病细胞的生长，为DC治疗白血病开辟了一条新途径。     

自体 CIK 细胞联合化疗治疗老年急性髓细胞白血病的临床研究简

本研究旨在评价自体CIK细胞联合化疗治疗老年人急性白血病的有效性和安全性.采集5例老年急性白血病患者外周血单个核细胞,在体外经干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、抗CD3单克隆抗体诱导成CIK细胞,回输至患者体内,28 d为1个疗程.观察治疗前后细胞免疫功能、感染发生、血红蛋白和输血依赖以及对自然病程的影响.结果表明：5例患者共接受46个周期的CIK细胞输注治疗,回输后所有患者均未出现不良反应;CIK细胞治疗后CD3＋、CD3＋ CD8＋、CD3＋ CD56＋细胞比例显著增高（P ＜0.05）;CIK细胞治疗可以有效减少AML患者的感染发生（P＜0.05）,缩短高热持续时间（P＜0.05）;在疾病稳定期,CIK细胞输注可以减少患者红细胞的输注量（P＜0.05）,稳定血红蛋白水平;CIK细胞输注虽不能改变病程的转归,但在患者疾病进展期以及终末期,采用化疗联合CIK治疗可使患者病情一度平稳,延长生存时间.结论：自体CIK细胞联合化疗对本组5例老年急性髓系白血病安全有效.     

热休克胃癌细胞负载DC-CIK细胞杀伤癌细胞活性的研究

目的研究负载相关抗原的树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞对胃癌细胞的杀伤作用。方法取健康人外周血并分离出外周血单个核细胞(PBMC),经不同细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,热休克方法处理胃癌MKN-28细胞株并制备肿瘤抗原用于负载DC,与CIK细胞共培养,以流式细胞术检测DC、CIK细胞表型,MTS法检测CIK细胞对MKN-28细胞的杀伤作用。结果 CIK与DC共培养后,与单纯CIK细胞相比较,增殖活性明显提高,CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞数增多并且具有更强的杀瘤活性,效靶比为20.0∶1时,负载MKN-28抗原的DC-CIK(Ag-DC-CIK)组对MKN-28的杀伤活性为(57.96±2.23)%,远大于未负载MKN-28抗原的DC-CIK组[(38.02±2.06)%]和单纯CIK组[(29.78±1.84)%],差异具有统计学意义(P<0.05)。结论以热休克凋亡肿瘤细胞抗原负载的DC能促进CIK细胞增殖分化,并提高其对胃癌细胞的杀伤活性。     

DC-CIK细胞的生物学活性及体外抗白血病作用的研究

本研究探讨树突状细胞（DC）对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平及抗白血病细胞的作用。健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK，将DC与CIK共培养，以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数，MTT法测定杀伤活性，流式细胞术分析免疫表型，ELISA双抗体夹心法测定干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL—12）的水平。结果表明：DC—CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞（P〈0．05）；DC、CIK细胞共培养后，CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞比率较相同条件下CIK细胞组显著增多（P〈0．05）；共培养3天，DC—CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ水平均比CIK细胞单独培养的水平高（P〈0．01，P〈0．05）；在5：1—40：1的效靶比范围内，DC—CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞（P〈0．05），且杀伤率与效靶比呈正相关。结论：DC增加CIK细胞的增殖能力和抗白血病活性，有可能作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗手段。     

Donor-derived b2a2-specific T cells for immunotherapy of patients with chronic myeloid leukemia

The BCR-ABL fusion proteins, b2a2 and b3a2, are potential targets for a beneficial graft-versus-leukemia (GVL) effect after allogeneic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia (CML). This study demonstrates that CD4+ T cells specific to the b2a2 peptide can be generated from a normal allogeneic stem cell transplant donor after stimulation with monocyte-derived dendritic cells (Mo-DC) using culture conditions applicable to clinical use. Stimulation of donor T-cell enriched mononuclear cells (MNC) with b2a2-pulsed Mo-DC produced approximately 3 x 10(9) b2a2-specific CD4+ T cells. The CD4+ T cells were HLA-DR7 restricted. These results confirm that the generation of donor derived b2a2-specific T cells for clinical use is feasible and warrants clinical testing after stem cell transplantation.     

Immunotherapy using autologous monocyte-derived dendritic cells pulsed with leukemic cell lysates for acute myeloid leukemia relapse after autologous peripheral blood stem cell transplantation

Although a second stem cell transplantation (SCT) can be used as salvage therapy in patients with relapsing leukemia after SCT, most of these patients have a poor outcome. We tried clinical vaccination using monocyte-derived dendritic cells (DCs) pulsed with leukemic lysates to treat relapsing acute myeloid leukemia (AML) after autologous SCT. To generate DCs, CD14+ cells isolated from peripheral blood stem cell products were cultured in AIM-V in the presence of GM-CSF and IL-4. Adding TNF-alpha on day 6 induced maturation of the DCs, which were harvested on day 8 or 9. The DCs were incubated with tumor lysate and KLH for 2 hr at 37 degrees C. After certifying the absence of microorganisms and endotoxins, the patients received four DC vaccinations at two- to three-week intervals. Two patients received four DC vaccinations with means of 7.8 x 10(6) and 9 x 10(6) DCs at two- to three-week intervals. The DC vaccinations were well tolerated with no apparent side effects. After the vaccinations, the patients showed immunological responses with positive delayed-type hypersensitivity skin reaction and increasing autologous T cells stimulatory capacity to the DCs; however, the BM blast percentage of the patients did not improve. The results suggest that DCs are a feasible cellular therapy for relapsing AML after autologous SCT.     

脐血树突状细胞对同源CIK细胞生物学活性及抗白血病作用影响的研究

本研究旨在探索脐血树突状细胞（DC）对同源细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞体外增殖、免疫表型、分泌细胞因子水平及其对白血病细胞细胞毒作用的影响。采集脐血单个核细胞诱导DC和CIK细胞。将DC和CIK细胞按1：5的比例混合培养,以脐血CIK细胞或外周血DC—CIK细胞为对照。用流式细胞术分析细胞表型,台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法检测效应细胞杀伤白血病细胞的活性,ELISA法测定分泌干扰素-γ（IFN—γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-12（IL—12）的水平。结果表明,脐血DC—CIK细胞增殖能力显著高于脐血CIK细胞和外周血DC-CIK细胞（P〈0．05、P〈0．05）;脐血DC、CIK细胞共培养后,CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞比例较相同奈件下CIK细胞明显增多（P〈0．05）;混合培养3天,脐血DC—CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ 、TNF—α含量均比单纯培养CIK细胞分泌含量高（P〈0．01、P〈0．05、P〈0．05）;在2．5：1—20：1的效靶比范围内,脐血DC—CIK细胞对各亚型急性白血病细胞的杀伤率明显高于CIK细胞（p〈0．05）,但对各亚型白血病细胞杀伤活性无显著性差异,与外周血DC—CIK细胞对白血病杀伤效应相类同。结论：脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗白血病效应。脐血DC。CIK细胞增殖能力比外周血DC—CIK细胞强,但两者在细胞毒方面无显著性差异。因脐血较易获得,且输注不易引起严重的排斥反应,因而DC—CIK细胞在免疫治疗方面具有更广泛的临床应用前景。     

A frameshift polymorphism in P2X5 elicits an allogeneic cytotoxic T lymphocyte response associated with remission of chronic myeloid leukemia

Minor histocompatibility antigens (mHAgs) constitute the targets of the graft-versus-leukemia response after HLA-identical allogeneic stem cell transplantation. Here, we have used genetic linkage analysis to identify a novel mHAg, designated lymphoid-restricted histocompatibility antigen-1 (LRH-1), which is encoded by the P2X5 gene and elicited an allogeneic CTL response in a patient with chronic myeloid leukemia after donor lymphocyte infusion. We demonstrate that immunogenicity for LRH-1 is due to differential protein expression in recipient and donor cells as a consequence of a homozygous frameshift polymorphism in the donor. Tetramer analysis showed that emergence of LRH-1-specific CD8+ cytotoxic T cells in peripheral blood and bone marrow correlated with complete remission of chronic myeloid leukemia. Furthermore, the restricted expression of LRH-1 in hematopoietic cells including leukemic CD34+ progenitor cells provides evidence of a role for LRH-1-specific CD8+ cytotoxic T cells in selective graft-versus-leukemia reactivity in the absence of severe graft-versus-host disease. These findings illustrate that the P2X5-encoded mHAg LRH-1 could be an attractive target for specific immunotherapy to treat hematological malignancies recurring after allogeneic stem cell transplantation.     

人脐血及骨髓淋巴细胞免疫表型的比较及其意义

为比较脐血和骨髓淋巴细胞及祖细胞分化抗原，通过流式细胞术（FCM）双标法对38份脐血及10份骨髓免疫细胞表型进行了分析研究。研究发现：（1）脐血及骨髓淋巴细胞中均测到稚淋巴细胞（CD3^-CD4^ )，且前中含量较多，但脐血细胞毒T细胞含量（CTL，CD3^ CD16^ 56^ )低于骨髓；（2）脐血中NK细胞（CD3^-CD16^ 56^ )比例高于骨髓；（3）脐血有核细胞中CD34^ 细胞的比值接近于骨髓，但脐血CD34^ 细胞中髓系祖细胞（CD34^ CD13^ ,CD34^ HLA-DR^ )及淋巴系祖细胞（CD34^ CD19^ )含量均低于骨髓，结论：（1）脐血免疫细胞具有不成熟性，这估计是脐血移植后GVHD程度轻的主要原因；（2）脐血淋巴细胞中NK细胞含量较高，推测脐血移植后移植物抗白血病效应（GVL）并不会降低；（3）脐血CD34^ 细胞中髓系祖细胞及淋巴系祖细胞比例均低于骨髓，可能是脐血移植后造血及免疫重建速度较慢的原因之一。     

急性白血病免疫治疗的研究现况和前景

要进一步延长急性白血病治疗后缓解期和消灭残余微量白血病细胞，重要方法之一是开展免疫治疗。在研究中的免疫治疗方法有4种：D单克隆抗体(单抗)，其中Mylotarg(抗CD33单抗接上细胞毒抗生素利东霉素)用于治疗复发和难治急性髓性白血病(AML)及急性早幼粒细胞白血病(APL)分子复发，取得良好效果；Campath—1H(抗CD52单抗)治疗幼淋细胞白血病(PLL)，美罗华治疗B—PLL，缓解率高。其他研究的单抗尚有IL-22单抗治疗急性T细胞白血病、抗220KD单抗6G7治疗急性白血痛、重组免疫毒素BL22(抗CD22)治疗毛细胞白血病以及一些用同位素标记的单抗治疗各种急性白血病；②过继性细胞免疫治疗，用细胞因子诱导的杀伤细胞、同种反应NK细胞、同种或自身白血病特异的CD8^ 细胞毒T淋巴细胞和其他免疫效应细胞；⑧细胞因子及其他免疫调节剂，诸如IL-2，IL-12，GM—CSF，CD40L,LT-3L，沙利度胺及其衍化物；④白血病疫苗，有抗原特异的、白血病细胞为基础的、负载白血病抗原的树突状细胞(DC)和白血病来源的DC疫苗等几种不同剂型，以后两者剂型更受重视。总之，到目前为止，急性白血病免疫治疗中最有效的方法是应用单抗，其他大多数方法也已显示应用前景，值得进一步研究.