pEgr-sHemopexin重组质粒的构建及体外辐射诱导表达

目的：克隆小鼠分泌型Hemopexin (sPEX) 编码区的cDNA序列,构建含Egr-1启动子的pEgr-sPEX真核表达载体,检测辐射诱导重组质粒在B16F10细胞中的表达。 方法：用RT-PCR从NIH3T3细胞中扩增出sPEX,经测序证实后,构建pEgr-sPEX重组质粒,以脂质体转染B16F10细胞,用Western blotting方法检测B16F10细胞上清中辐射诱导PEX的表达。 结果：测序表明扩增的sPEX cDNA序列与GenBank中登录的序列完全一致,sPEX cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1-Egr-1,转染入B16F10细胞内PEX基因在体外辐射诱导下成功获得表达。结论：成功地克隆了小鼠sPEX基因,并在体外证实了pEgr-sPEX具有辐射诱导表达特性。     

重组分泌型内皮抑素腺相关病毒的包装及在膀胱癌EJ细胞系中的表达

目的:包装重组分泌型内皮抑素腺相关病毒(rAAV-Endostatin)制备内皮抑素原位基因治疗膀胱癌的基因载体药物。方法:采用分子生物学方法构建腺相关病毒质粒载体(pAAV-IgG-Endostatin),酶切、测序鉴定;经质粒共转染方法包装rAAV-Endostatin,测定病毒颗粒滴度并电镜下鉴定;转染膀胱癌EJ细胞后,ELISA法测定重组内皮抑素的浓度。结果:pAAV-IgG-Endostatin的构建和rAAV-Endostatin的包装均获成功,病毒滴度达1.0×1012v.p/ml。感染EJ细胞后内皮抑素成功表达并分泌,上清液中浓度达54.09ng/ml。结论:rAAV-Endostatin载体的构建、包装与表达的成功为rAAV-Endostatin原位基因治疗膀胱癌的实验研究奠定了基础。     

小鼠Tim-３真核表达载体pTARGET-Tim-3的构建

目的 构建小鼠Tim-3真核表达载体,并在黑色素瘤细胞系B16中表达小鼠TIM-3。方法 以脾细胞RNA为模板,逆转录PCR扩增鼠Tim-3编码区基因,T-A克隆至真核表达载体pTARGET,构建重组质粒pTARGET-Tim-3,采用脂质体转染法转染黑色素瘤细胞系B16细胞,以逆转录PCR和Western blot验证Tim-3在B16细胞中的表达。结果 利用酶切和测序的方法,筛选、鉴定pTARGET-Tim-3真核表达载体,转染黑色素瘤细胞系B16细胞,经逆转录PCR和Western blot证实TIM-3高效表达。结论 成功构建小鼠Tim-3真核表达载体, Tim-3在转染的小鼠B16细胞系中高表达。     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的 :克隆小鼠血管抑素 (Angiostatin)cDNA ,构建其真核表达载体pCMV -Angiostatin重组质粒 ,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法 :根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列 ,用RT -PCR方法从鼠肝脏中扩增出AngiostatincDNA ,连接 pMD18T载体测序 ,经测序证实后 ,通过中间载体 pKS ,构建pCMV -Angiostatin重组质粒。结果 :测序表明扩增的AngiostatincDNA序列与报道基本一致 ,AngiostatincDNA正确插入表达载体。 结论 :成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建     

携带人分泌型内皮抑素基因重组腺病毒的制备和鉴定

目的制备包含人分泌型内皮抑素基因的重组腺病毒,为下一步探讨其在血管生成依赖性疾病的治疗研究中的应用提供基础。方法以T-Endostatin质粒为模板,通过PCR扩增回收hEndostatin,将hEndostatin连接到pShuttle2中,构建pShuttle2-hEndostatin表达质粒,将此表达质粒连接到缺陷型腺病毒载体,构建Ad-hEndo。其线性化后转染HEK293T细胞,纯化后的重组腺病毒Ad-hEndo在HEK293T细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,并测定其滴度。结果利用PCR反应进行鉴定,扩增得到的hEndostatin经酶切鉴定,DNA测序证实为重组腺病毒,测定病毒滴度为5.2×109PFU/ml。结论本实验成功构建了人分泌型内皮抑素重组腺病毒Ad-hEndo,可直接用于血管生成依赖性疾病基因治疗的实验研究。     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的：克隆小鼠血管抑素(Angiostatin)cDNA，构建其真核表达载体pCMV-Angiostatin重组质粒，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法：根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列，用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Angiostatin cDNA，连接pMD18T载体测序，经测序证实后，通过中间栽体pKS，构建pCMV-Angiostatin重组质粒。结果：测序表明扩增的Angiostatin cDNA序列与报道基本一致，Angiostatin cDNA正确插入表达载体。结论：成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建。     

携带内皮抑素基因的重组腺病毒的构建

目的 利用AdEasy-1系统,构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒,为后续的实验奠定基础.方法 以PshuttleEndostatin质粒为模版PCR扩增内皮抑素基因片断,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在AAV293细胞中包装并扩增.结果 重组腺病毒经测序、酶切鉴定正确,病毒滴度为2.06×1010 pfu/ml.结论 人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功.     

内皮抑素30肽基因真核表达载体的构建及实验研究

目的构建改构内皮抑素抗肿瘤相关肽(30肽)的真核表达载体pVAX1,检测该重组载体的生物学活性。方法在30肽基因的5′端加入胶原蛋白ⅩⅧ信号肽编码序列,通过PCR扩增获得目的基因30肽,并连接到质粒pVAX1中,构建表达分泌型内皮抑素的重组质粒pVAX1-30E,然后将重组质粒pVAX1-30E直接注入小鼠肿瘤组织。通过ELISA小鼠体内抑瘤实验检测目的基因的表达及其活性。结果ELISA实验表明构建的分泌型内皮抑素重组质粒pVAX1-30E能在肿瘤细胞中表达30肽,免疫组化结果表明瘤组织中表达的30肽能抑制肿瘤微血管的新生,而体内抑瘤实验表明在肿瘤部位直接注射重组质粒能抑制肿瘤生长,抑瘤率为28.19%。结论通过向瘤组织中直接注射分泌型内皮抑素重组质粒pVAX1-30E可以抑制小鼠体内肿瘤微血管新生和肿瘤生长而实现其抗肿瘤活性。     

内皮抑素重组腺病毒载体的构建及制备

目的 构建鼠源性内皮抑素(mEndostatin)重组腺病毒真核表达载体,为下一步研究其在体外表达及动物实验研究提供基础。方法 以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin,并在其5'端引入M-成瘤蛋白信号肽。将mEndostatin连接到腺病毒载体pCA13中,构建pCA13-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过Lipofectamine 2000共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo。纯化后重组腺病毒Ad-mEndo在293细胞大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度。结果 扩增得到的mEndostatin经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序证实为鼠源性内皮抑素,重组腺病毒Ad-mEndo的滴度为6.3×1010 pfu／ml。结论 该实验为今后研究重组腺病毒mEndostatin用于恶性肿瘤的基因治疗打下了基础。     

人内皮抑素基因转染原代成人黑色素瘤细胞

目的:研究人内皮抑素（human endostatin,hEndo）基因转染的原代黑色素瘤细胞的体外和体内生物学特性。方法:先构建重组人内皮抑素的真核表达载体pcDNA3.1-hEndo,将人内皮抑素基因导入原代成人黑色素瘤细胞,检测转基因细胞hEndo蛋白的表达、分泌和抑制细胞增殖活性,并验证转基因细胞在体外和裸鼠体内的生长特性。结果:载体pcDNA3.1-hEndo经酶切后获得5.4kb和624bp条带,电转后G418筛选获得克隆;RT-PCR检测到转染细胞表达hEndo mRNA,Western blot检测到转染细胞分泌hEndo蛋白,MTT表明转基因细胞上清可抑制细胞增殖;裸鼠体内生长实验显示转基因黑色素瘤生长速度明显低于对照组（P<0.05）,肿瘤组织RT-PCR示hEndo基因稳定表达。结论:转hEndo基因原代黑色素瘤细胞可有效、稳定地表达有生物学活性的hEndo,hEndo能抑制瘤细胞在动物体内的生长速度。     

pEgr-angiostatin基因辐射诱导表达特性及其抗肿瘤作用

目的 :检测 p Egr- angiostatin重组质粒在 B1 6细胞中的辐射诱导表达和观察 p Egr-angiostatin基因 -放射治疗的抗肿瘤作用。方法 :用 RT- PCR方法从小鼠肝脏中扩增出 angiostatinc DNA,经测序证实后 ,构建 p Egr- angiostatin重组质粒 ,脂质体介导的转染法转染小鼠 B1 6细胞 ,检测 B1 6细胞内 angiostatin m RNA的辐射诱导表达 ,体内观察 p Egr- angiostatin基因 -放射治疗的抑瘤作用。结果 :测序表明扩增的 angiostatin c DNA序列与报道基本一致 ,Egr- 1启动子和 angiostatinc DNA正确插入表达载体 pc DNA3.1 ,转染 B1 6细胞内 angiostatin m RNA的表达具有辐射诱导特性 ,p Egr- angiostatin基因 -放射治疗荷瘤小鼠具有明显的抑瘤作用。结论 :成功地克隆小鼠angiostatin基因 ,并证实 p Egr- angiostatin的辐射诱导表达规律及其基因 -放射治疗的抗肿瘤作用     

鼠内皮细胞抑制素的克隆及在COS-7细胞中的分泌表达

目的从小鼠肝脏中克隆出ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ并在ＣＯＳ－７细胞中分泌表达,为其在肿瘤抗血管基因治疗中的应用打下基础。方法用ＲＴ－ＰＣＲ从鼠肝脏扩增出内皮细胞抑制素ｃＤＮＡ并克隆入测序载体ＰＵＣ－Ｔ测序证实后,装入分泌表达载体ｐＳＥＣ－ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ,用ＤＥＡＥ－葡聚糖转染ＣＯＳ－７细胞,从ｍＲＮＡ水平及蛋白水平检测内皮细胞抑制素的表达。结果测序结果显示所克隆的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

小鼠内皮抑素基因克隆、测序及pEgr-IFNγ-mEndostatin 重组双基因表达质粒的构建

目的：克隆小鼠内皮抑素（mEndostatin）编码区cDNA序列并构建含Egr-1启动子的IFNγ和mEndostatin双基因表达载体。 方法：利用逆转录多聚酶链反应法（RT-PCR）,以小鼠肝细胞mRNA为模板,扩增获得全长mEndostatin,与pMD18T载体连接作全自动测序,并利用基因重组技术构建含Egr-1启动子的IFNγ和mEndostatin双基因表达质粒。 结果：经测序证实获得的mEndostatin序列与文献报道完全一致,并构建了含Egr-1启动子的IFNγ和mEndostatin双基因表达质粒pEgr-IFNγ-mEndostatin。 结论：利用RT-PCR法成功克隆了mEndostatin的cDNA序列,构建了pEgr-IFNγ-mEndostatin重组双基因表达质粒。     

小鼠Gtf2h2基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的:克隆小鼠Gtf2h2基因并使其在真核细胞HEK293中稳定表达?方法:采用小鼠卵母细胞cDNA为模板,经PCR扩增Gtf2h2后,利用新型In-Fusion分子克隆体系将该目的片段克隆至真核表达载体pCMV6-AC-3DDK和pCMV6-AN-mKate中?所得阳性克隆的质粒DNA在经限制性酶切电泳和测序鉴定克隆成功后,转染到HEK293细胞中进行表达?表达效果利用抗DDK和mKate标签的抗体通过免疫荧光以Western blot 的方法进行检测?结果:质粒DNA测序和酶切鉴定证明Gtf2h2基因克隆成功;Western blot 检测到GTF2H2-3DDK和GTF2H2-mKate融合蛋白在转染后的HEK293细胞内的表达;免疫荧光显示融合蛋白在转染后的HEK293细胞核内定位并呈颗粒状分布?结论:成功克隆了小鼠Gtf2h2基因并实现了其在真核细胞HEK293中的稳定表达,为进一步研究其功能和作用机制奠定了基础?     

宫颈癌细胞中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶及其选择性剪接亚型真核表达载体的构建和表达

目的:构建宫颈癌细胞中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)及选择性剪接亚型NRDRB1真核表达载体,并转染HeLa细胞表达融合蛋白和native蛋白。方法:分别以pDONR-NRDR、pDONR-NRDRB1载体为模板,用PCR方法扩增两端带有酶切位点的NRDR及NRDRB1编码区序列,酶切后连接到pCDNA3、pCMV-Myc真核表达载体上,经酶切、测序鉴定后,转染HeLa细胞16 h,Western blot检测蛋白表达情况,蛋白质谱分析鉴定表达蛋白。结果:成功构建NRDR、NRDRB1真核表达载体,转染HeLa细胞后,可表达带有Myc标签的蛋白和不带标签的native蛋白;质谱分析结果进一步证实所表达的蛋白为NRDR和NRDRB1。结论:获得了在真核细胞中表达的NRDR、NRDRB1蛋白,为进一步研究其功能提供了实验材料。     

以内部核糖体进入位点序列连接两个独立表达基因构建重组腺病毒双表达载体

目的:以内部核糖体进入位点(IRES)序列连接鼠TGF-β1和PLP-Ig 2基因,构建重组腺病毒双表达载体.方法:采用常规分子生物学方法,分别从Con A刺激的小鼠脾细胞和WT-1杂交瘤细胞抽提总RNA,克隆鼠TGF-β1基因和Ig重链Fc基因;将编码PLP139-151的DNA与信号肽设计在引物上,经过2次克隆,形成PLP-Ig.与TGF-β1以IRES序列相连接后,经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接,鉴定后在HEK 293细胞包装.获得高滴度病毒后,采用ELISA方法鉴定TGF-β1基因的表达;Western印迹鉴定PLP-Ig的表达.结果:该双表达重组腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;病毒感染细胞分别经ELISA和Western印迹检测后证实TGF-β1和PLP-Ig得到了独立表达.结论:构建的可调控性鼠TGF-β1和PLP-Ig重组腺病毒双表达载体的独立表达,为后续基因治疗研究奠定了基础.     

表达人血管内皮生长因子和血管生成素1的CHO细胞株的建立

目的：克隆人血管内皮生长因子(VEGFm)和血管生成素1(Ang1)基因，建立可分别表达VEGFm和Ang1的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)株。方法：用PCR技术，分别从人心脏cDNA库中扩增VEGF165和Ang1 cDNA，并定向克隆人真核表达载体pSecTag2B中。用Lipofectamine2000将重组质粒转化入CHO细胞中，用Zeocin筛选并维持已转化重组质粒的CHO细胞株。在大肠杆菌DH10B中扩增转化入CHO细胞中的重组质粒，行DNA测序鉴定。用Westem-blot鉴定CHO细胞中重组VEGFm和Ang1的表达。结果：从人心脏cDNA库中扩增出VEGFⅢ和Ang1 cDNA片段，酶切和测序结果显示，已正确构建重组质粒pSecTag-VEGF165和pSecTag-Ang1。用Zeocin筛选到候选的CHO细胞株，DNA测序结果表明，pSecTag-VEGF165和pSecTag-Ang1已分别成功转化入CHO细胞中。Western-blot结果显示，在CHO细胞中表达出可被VEGF和Ang1单抗识别的特异蛋白。结论：克隆了VEGFm和Ang1基因，并建立了表达VEGF165和Ang1的CHO细胞株。     

缺失内质网驻留信号肽的小鼠钙网蛋白在B16-F1细胞中的表达

目的：克隆无内质网驻留信号肽的钙网蛋白（CRT）,构建表达分泌性钙网蛋白的B16-F1肿瘤细胞株.方法：以前期构建的小鼠钙网蛋白真核表达质粒为模板,采用突变PCR技术获得无内质网驻留信号肽的钙网蛋白cDNA并克隆入真核表达载体中.以脂质体转染法将该质粒转染B16-F1细胞后,用G418筛选单克隆细胞株.分别以PCR,WesternBlot法鉴定成功转染和表达分泌型CRT的B16-F1细胞株.流式细胞术分析该细胞株的细胞周期.结果：成功获得无内质网驻留信号肽编码序列的小鼠CRT真核表达质粒.稳定转染并筛选出表达分泌性钙网蛋白的B16-F1细胞株,CRT在此细胞株中表达并分泌至培养基质中.稳定转染前后的B16-F1细胞株细胞周期没有明显变化.结论：删除CRT编码序列中内质网驻留信号肽（KDEL）后,CRT失去了驻留在细胞内质网中的能力从而以分泌蛋白的形式出现在细胞外培养基质中.本研究为CRT的细胞外转移提供了一条新的途径,同时为以CRT为基础的抗肿瘤免疫研究提供了新的研究工具.