重组人肿瘤坏死因子协同脐血CD3AK细胞诱导K562细胞凋亡的实验研究

ＴＮＦα能杀伤或抑制某些肿瘤细胞 ,低浓度ＴＮＦα的生物学活性主要为抗肿瘤、抗感染和引起炎症反应 ,若大量ＴＮＦα进入血流 ,可引起全身性反应。我们对ＴＮＦα、脐血ＣＤ3 ＡＫ细胞诱导Ｋ5 6 2细胞凋亡的作用进行了研究。材料和方法1　材料1.1　标本来源 :脐血来源于武汉大学中南医院妇产科正常分娩的胎儿脐血。1.2　试剂 :ｒＩＬ 2购自军事医学科学院 ;ＴＮＦα、ＣＤ3 单抗购自北京邦定生物医学公司 ;Ｋ5 6 2细胞购自武汉大学典型物培养中心 ;原位细胞凋亡试剂盒ＰＯＤ购自德国ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ公司。2　方法2 …     

肿瘤坏死因子α诱导人成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603凋亡的作用

目的：观察不同浓度重组肿瘤坏死因子α对于培养的人原代成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603的凋亡作用，并分析浓度效应。方法：实验于1998-04／2000—04在第二军医大学卫生毒理学教研室完成。在人成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603中，实验组加浓度为1，10，100，1000ng／L的肿瘤坏死因子α，对照组加等量的无肿瘤坏死因子培养基，培养后检测细胞活力应用噻唑兰法，检测细胞凋亡情况应用DNA梯形条带和透射电镜等方法。结果：①肿瘤坏死因子α对培养成骨细胞和HOS-8603细胞的作用（噻唑兰法）：肿瘤坏死因子α浓度为100和1000ng／L实验组均高于对照组[成骨细胞：（0．14&;#177;0．006），（0．10&;#177;0．010），（0．27&;#177;0．013）ng／L：HOS-8603细胞：（0．15&;#177;0．012），（0．09&;#177;0．015），（0．27&;#177;0．013）ng／L,P〈0．05]。②DNA梯形条带结果：凋亡细胞使DNA在核小体外降解。形成180～200bp或与之成倍的DNA片段。在琼脂糖凝胶电泳时呈现梯形结果。在肿瘤坏死因子α浓度为1000ng／L时，成骨细胞可检测到典型DNA梯形条带。③成骨细胞的凋亡情况：应用透射电镜检查。浓度为1000ng／L实验组较浓度为100ng／L实验组凋亡细胞多。肿瘤坏死因子α同样可以诱导HOS-8603的凋亡，未加肿瘤坏死因子α时，凋亡很少。加入100ng／L及1000ng／L肿瘤坏死因子α时，凋亡细胞数量明显增加。结论：肿瘤坏死因子α质量浓度达到100g／L时，可以引起体外培养的成骨细胞和成骨细胞系HOS-8603细胞凋亡，并随浓度加大出现凋亡细胞增多的剂量-效应关系，结果验证了肿瘤坏死因子能刺激成骨细胞凋亡的假说。     

重组人粒细胞集落刺激因子对阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡的影响

为了研究重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）对阿糖胞苷（Ara-C）诱导HL-60细胞凋亡的影响,体外培养HL-60细胞,加入rhG-CSF和（或）Ara-C,瑞氏染色观察细胞形态变化,吖啶橙/溴化乙锭双染色观察细胞凋亡情况,MTT实验检测细胞增殖活性.结果表明：加入rhG-CSF后Ara-C诱导的HL-60细胞的凋亡率升高（P＜0.01）,而MTT实验的OD值降低（P＜0.01）.结论：rhG-CSF有诱导HL-60细胞凋亡的作用,rhG-CSF可以促进Ara-c诱导HL-60细胞凋亡的作用.     

肿瘤坏死因子α诱导人成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603凋亡的作用

目的:观察不同浓度重组肿瘤坏死因子α对于培养的人原代成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603的凋亡作用,并分析浓度效应。方法:实验于1998-04/2000-04在第二军医大学卫生毒理学教研室完成。在人成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603中,实验组加浓度为1,10,100,1000ng/L的肿瘤坏死因子α,对照组加等量的无肿瘤坏死因子培养基,培养后检测细胞活力应用噻唑兰法,检测细胞凋亡情况应用DNA梯形条带和透射电镜等方法。结果:①肿瘤坏死因子α对培养成骨细胞和HOS-8603细胞的作用(噻唑兰法):肿瘤坏死因子α浓度为100和1000ng/L实验组均高于对照组犤成骨细胞:(0.14±0.006),(0.10±0.010),(0.27±0.013)ng/L;HOS-8603细胞:(0.15±0.012),(0.09±0.015),(0.27±0.013)ng/L,P<0.05犦。②DNA梯形条带结果:凋亡细胞使DNA在核小体外降解,形成180～200bp或与之成倍的DNA片段。在琼脂糖凝胶电泳时呈现梯形结果。在肿瘤坏死因子α浓度为1000ng/L时,成骨细胞可检测到典型DNA梯形条带。③成骨细胞的凋亡情况:应用透射电镜检查,浓度为1000ng/L实验组较浓度为100ng/L实验组凋亡细胞多。肿瘤坏死因子α同样可以诱导HOS-8603的凋亡,未加肿瘤坏死因子α时,凋亡很少,加入100ng/L及1000ng/L肿瘤坏死因子α时,凋亡细胞数量明显增加。结论:肿瘤坏死因子α质量浓度达到100g/L时,可以引起体外培养的成骨细胞和成骨细胞系HOS-8603细胞凋亡,并随浓度加大出现凋亡细胞增多的剂量-效应关系,结果验证了肿瘤坏死因子能刺激成骨细胞凋亡的假说。     

肿瘤坏死因子-α与胎膜早破

目的 探讨肿瘤坏死因子（TNF）-α在胎膜早破发病机制中的作用及意义。方法 采集无任何妊娠并发症、临产前要求剖宫产分娩的初产妇（包括19例足月胎膜早破、15例足月前胎膜早破和作对照的17例正常未破膜者）血、羊水及胎膜，用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法测定血清、羊水中TNF-α的浓度，胎膜常规苏木素-伊红染色后行组织病理学检查及TUNEL技术精确标记后细胞凋亡指数的测定。结果 ①胎膜早破组血清、羊水中TNF-α浓度明显高于对照组，差异有显著性（P〈0.05或〈0.01）；且胎膜早破组胎膜感染的发生率和胎膜的细胞凋亡指数也较对照组高，差异有显著性（P〈0.05或〈0.01）；但足月和足月前胎膜旱破两组间血清、羊水中TNF-α浓度、胎膜感染率和细胞凋亡指数差异均无显著性（P〉0.05）。②胎膜有感染组血清、羊水中TNF-α浓度及胎膜细胞凋亡指数明显高于无感染组，差异有显著性（P〈0.01）；在无感染组中胎膜早破的血清、羊水中TNF-α浓度及胎膜细胞凋亡指数也较对照组高，差异有显著性（P〈0．01）。③所有研究对象血清、羊水中TNF-α浓度呈明显正相关（r=0．386，P〈0.01）。结论 TNF-α在胎膜早破发病机制中有促炎、降解细胞外基质、诱导细胞凋亡等功效；神经内分泌免疫网络失衡所致的胎膜细胞凋亡增加可能是胎膜早破的又一发病机制。     

肿瘤坏死因子-α在缺血再灌注肝损伤中的作用

组织缺血再灌注损伤的发生、发展是个多因素协同作用的过程。大量文献报道其发生可能与氧自由基、钙超载、中性粒细胞等因素有关。近年来，肿瘤坏死因子（tumor nccrosis factor，TNF）吨在组织缺血再灌注损伤过程中特别是在细胞凋亡中的作用越来越引起人们的关注，现就TNF-α在缺血再灌注肝损伤及肝细胞凋亡中的作用机制综述如下。     

重组改构人肿瘤坏死因子治疗恶性腹腔积液18例报告

恶性腹水是腹腔恶性肿瘤转移和播散所致的晚期表现，积液量多，难以控制。重组改构人肿瘤坏死因子（纳科思，rmhTNF）为广谱抗肿瘤药，具有直接抗肿瘤细胞的细胞毒作用，对肿瘤具有直接溶解及抗增殖作用。2005年2月～2006年1月，作者应用纳科思治疗18例恶性腹腔积液患者，疗效满意，现报告如下。     

诱导分化剂对白血病细胞产生肿瘤坏死因子α作用探讨

急性白血病患者原代白血病细胞的ＨＬ－６０细胞在诱导分化前后产生肿瘤坏死因子α的作用被研究。急性淋巴细胞白血病患者原代白血病细胞在诱导分化前后均不能产生ＴＮＦα，而急性非淋巴细胞白血病患者的原代白血病细胞在５种诱导分化剂诱导分化后能产生ＴＮＦα，白血病细胞产生ＴＮＦα与细胞分化密切相关。     

肿瘤坏死因子α诱导人髓核细胞凋亡的作用途径

背景:在与细胞凋亡有关的众多因素中,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成员发挥了重要的作用.但TNF是通过何种途径诱导椎间盘髓核细胞凋亡的机制尚未阐明.目的:探讨TNF-α激活后,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路中P38MAPK和应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase,JNK/SAPK)两条途径对人髓核细胞凋亡的作用.方法:体外培养人髓核细胞,将细胞随机分成4组:TNF-α刺激组,P38MAPK阻断组,P-JNK/SAPK阻断组和对照组.采用TUNEL法检测髓核细胞凋亡情况,免疫荧光法检测P-P38MAPK和P-JNK/SAPK的表达及定位:Western Blot法检测P38MAPK,JNK/SAPK及其磷酸化形式的表达.结果与结论:TUNEL法检测凋亡结果中,TNF-α刺激组较其他各组的凋亡细胞密度大(P＜0.01);免疫荧光结果显示TNF-α刺激组P-P38MAPK和JNK/SAPK在细胞质和细胞核的表达高于各阻断组和对照组(P＜0.01);Western Blot结果显示P38MAPK,P-JNK/SAPK在各组髓核细胞内均有表达,但无活化形式,TNF-α刺激组可见P-P38MAPK,P-JNK/SAPK表达,但相应阻断组无表达.结果表明,外源性TNF-α可通过P38MAPK和P-JNK/SAPK途径导致人髓核细胞凋亡.     

右旋柠烯对HL-60、K562白血病细胞体外作用的研究

本研究观察右旋柠烯（d-limonene，D-L）对HL-60和K562白血病细胞增殖凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。首先采用碘化丙锭染色法观察右旋柠烯对HL-60、K562细胞增殖的影响，再通过细胞形态学观察、流式细胞术分析、免疫细胞化学半定量测定突变型p53、bcl-2、bax基因的表达水平，系统观察D-L对HL-60、K562细胞体外诱导凋亡的情况。结果表明：D-L抑制HL-60和K562细胞的增殖，IC50均为0．75mmol／L，呈剂量时间依赖关系；D-L诱导HL-60、K562细胞凋亡；D-L在诱导HL-60细胞凋亡过程中随作用浓度增加，bcl-2的表达下降；D-L在诱导K562细胞凋亡过程中随作用浓度增加，突变型p53及bcl-2的表达下调，而bax的表达上调。结论：D-L抑制HL-60和K562细胞增值并诱导其凋亡；突变型p53，bcl-2，bax参与了D-L诱导凋亡的基因调控，     

青蒿琥酯诱导HL-60细胞凋亡的研究

本研究旨在研究青蒿琥酯体外诱导HL-60细胞凋亡及其过程中Bcl-2与ICAD蛋白表达的变化。采用MTT法测定青蒿琥酯对HL-60细胞的生长抑制作用;用光学显微镜检、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术观察和检测青蒿琥酯诱导HL-60细胞的凋亡;应用蛋白印迹法检测青蒿琥酯诱导HL-60细胞凋亡过程中Bcl-2与ICAD的表达变化情况。结果表明：青蒿琥酯对HL-60细胞有明显的生长抑制作用,并呈时间、剂量依赖性。48小时IC50值为18.33μg/ml,其增殖抑制作用与诱导细胞凋亡有关;Bcl-2和ICAD在HL-60细胞中均有表达,且随药物浓度的增高表达量逐渐降低。结论：青蒿琥酯可诱导HL-60细胞凋亡,Bcl-2和ICAD在青蒿琥酯诱导HL-60细胞凋亡的信号传导途径中可能是重要的调控因子。     

应用人类全基因组芯片检测多药耐药白血病细胞株HL-60/VCR与敏感细胞株HL-60基因的表达差异

本研究利用基因芯片技术检测白血病多药耐药细胞株HL-60/VCR及其亲本细胞株差异基因表达谱,探讨急性白血病多药耐药机制.本试验提取白血病细胞株HL-60及其多药耐药细胞株HL-60/VCR的mRNA,在反转录及体外转录过程中分别用生物素进行标记,与Affymetrix公司人类全基因组芯片U133A杂交,用Affymetrix专用芯片扫描仪G2500A GeneArray Scanner及Microarray Suite、Micro DB^TM GeneChip LIMS、GeneChip DMT分析软件系统处理杂交信号获取结果.结果表明：白血病细胞株HL-60及其耐药株HL-60/VCR差异显示基因5 507条,其中耐药细胞株中上调表达基因3 100条,下调表达基因2 407条;差异极显著性基因1 040条,表达上调435条,下调605条,涉及与细胞生长活动及信号转导相关的基因.结论：多基因参与白血病细胞株的多药耐药机制,基因芯片技术是并行分析多个基因、探讨白血病多药耐药机制的有效方法.     

沉默核干因子基因表达对HL-60白血病细胞凋亡的影响

本研究探讨靶向沉默白血病细胞的核干因子（nucleostemin,NS）基因对HL-60白血病细胞凋亡的影响。用T7启动子介导体外合成两条短发夹状干扰RNA（NS-shRNA）,以其中沉默NS基因作用强的一条NS-shRNA转染HL-60细胞,同时以与NS基因序列无关小干扰RNA转染HL-60细胞作对照,应用RT-PCR检测被转染的HL-60细胞NS-mRNA抑制效果,倒置显微镜下观察活体细胞形态变化,Wright-Giemsa染色观察细胞胞体和细胞核形态学变化,以流式细胞仪（FCM）和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）测定凋亡细胞数并计算凋亡阳性率。结果表明：HL-60细胞被NS-shRNA转染48小时后NS-inRNA阻断率达到74．94％,凋亡率分别为（25．32±3．06）％和（27．3±3．21）％,对照组仅（3．12±0．38）％和（3．30±1．52）％,转染组与对照组比较差异显著（P〈0．01）。Wright-Giemsa染色显示细胞发生核碎裂并出现“凋亡小体”。结论：靶向沉默NS基因表达可诱发和促进HL-60白血病细胞发生凋亡,为NS基因作为恶性肿瘤治疗的候选靶基因奠定了理论基础。     

正常人骨髓基质细胞对HL-60和HL-60/VCR 细胞凋亡易感性的影响

为了观察正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL对白血病敏感细胞HL-60和多药耐药细胞HL-60／VCR凋亡易感性的影响，先建立HL-60或HL-60／VCR细胞与HFCL细胞共培养体系；采用瑞氏-吉姆萨染色和吖啶橙／溴化乙啶(AO／EB)染色，分别在光镜和荧光显微镜下进行形态学观察；TUNEL检测晚期凋亡细胞，流式细胞术检测细胞周期、凋亡峰和annexin V阳性的早期凋亡细胞；Western blot检测Bcl-2、活化的胱冬蛋白酶(caspase)-3蛋白和P糖蛋白(Pgp)的表达变化。结果表明，经topotecan(TPT)处理后的HL-60和HL-60／VCR细胞，在光镜和荧光显微镜下均有典型的凋亡细胞形态学改变，这些改变具有时间和剂量依赖性；annexin V染色后能检测到早期凋亡细胞；细胞周期显示：G1期细胞比例增高，S期减低，并有明显凋亡峰；TUNEL能检测到许多阳性细胞；同时出现活化的caspase-3，伴有Bcl-2的表达下调，但与HFCL细胞共培养后，经TPT处理的HL-60和HL-60／VCR细胞中早期和晚期凋亡细胞有所减少，凋亡峰减低，而且活化的Caspase-3表达减弱，Bcl-2蛋白表达上调，且以直接接触组为甚。结论：正常骨髓成纤维样基质细胞HFCL能轻度降低白血病HL-60和HL-60／VCR细胞对TPT的凋亡易感性，并有caspase-3和Bcl-2重要信号传导分子的参与。     

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的促凋亡作用

为了研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导HL-60细胞凋亡的作用并探讨其抗癌作用机理,用不同浓度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂体外作用于HL-60细胞,采用MTT比色法检测其对HL-60细胞的抑制率,应用光学显微镜观察细胞核的形态学变化,用DNA凝胶电泳法检测HL-60细胞的凋亡,用流式细胞术检测该抑制剂作用于HL-60细胞后引起的凋亡现象。结果表明：重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞（PBMNC）无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100μg/ml重组荞麦胰蛋白酶抑制剂作用后,凋亡率达到52％;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解。结论：重组荞麦胰蛋白酶抑制剂在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导细胞凋亡,这为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂应用于急性髓细胞性白血病的治疗提供依据,也为重组基因工程植物蛋白药物的临床应用提供新思路。     

人成纤维样基质细胞系对HL-60细胞增殖和VEGF表达的影响

为了观察正常人骨髓成纤雏样细胞系(HFCL)对白血病细胞系HL-60细胞增殖和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响，用免疫组织化学对HFCL细胞进行组织学鉴定；建立HL-60细胞和HFCL细胞共培养体系，台盼蓝柜柒法测定生长曲线；既染色和瑞-姬姆萨染色后进行分裂指数(MI)测定；流式细胞术检测细胞周期的变化；Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达；ELISA双抗体夹心法检测HL-60细胞表达VEGF水平。结果发现。与HFCL细胞共培养后HL—60细胞生长受抑，且与HFCL细胞直接接触组的抑制作用大于用跨室共培养组，其分裂指数表现为单独HL-60细胞组大于用跨室共培养组，更大于与HFCL细胞直接接触组。同时发现HL-60细胞与HFCL细胞共培养后G1期细胞增多，S期细胞减少，且PCNA表达下调，以直接接触组为甚。HL-60细胞与HFCL细胞共培养后，培养上清的VEGF水平减低，直接接触组和跨室共培养组下降程度一样，而与HL-60细胞共培养，HFCL细胞增殖无明显变化。结论：正常人骨髓成纤维样细胞能抑制白血病细胞系HL-60的增殖，抑制细胞周期，降低VEGF因子的表达。     

人脐带间充质干细胞增强全反式维甲酸对HL-60细胞的诱导分化作用

本研究探讨人脐带间充质干细胞(hucMSC)对全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60细胞分化以及对HL-60增殖的影响。HL-60细胞分为4组:未经ATRA处理的对照组、与hucMSC细胞共培养的hucMSC组,经ATRA处理的ATRA组以及经ATRA处理并与hucMSC细胞共培养的ATRA+hucMSC组。在规定时间采用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测对照组和hucMSC组HL-60细胞增殖情况;在光学显微镜下观察各组细胞形态、NBT阳性细胞;应用real-timePCR方法检测c-myc基因表达水平以及流式细胞术检测CD11b表面标志以比较各组中HL-60细胞的分化情况。结果表明:共培养体系中hucMSC细胞能抑制HL-60的增殖,hucMSC∶HL-60为1∶1时,48小时时p0.05,72小时时p0.01;hucMSC∶HL-60为1∶5时,72小时时p0.05。在2μmol/LATRA的刺激下,ATRA+huc-MSC组与ATRA组相比,出现更多具有中性粒细胞形态的HL-60细胞和更高的NBT阳性率(p0.05);ATRA+hucMSC组中HL-60细胞c-myc基因表达更低(p0.05);ATRA+hucMSC组中HL-60细胞CD11b的表达更高(48小时p0.05,72小时p0.01)。结论:脐带间充质干细胞能抑制HL-60增殖并且增强ATRA对HL-60细胞的诱导分化作用。     

广枣黄酮槲皮素和山萘酚促人白血病HL-60细胞系凋亡及其机制探讨

本研究旨在探讨广枣黄酮主要成份槲皮素及山萘酚的抗白血病作用及其可能的作用机制。采用MTT法测定槲皮素及山萘酚对HL-60细胞的增殖抑制作用;用流式细胞术检测药物对HL-60细胞周期的影响及其诱导凋亡作用;通过Western blot观察药物诱导的HL-60细胞凋亡中survivin蛋白表达情况。结果表明,槲皮素及山萘酚对HL-60细胞的增长有显著的抑制作用,并呈浓度和时间依赖性（槲皮素相关系数r=0．77,山萘酚相关系数r=0．76）。给药后HL-60细胞发生G2／M期阻滞和凋亡。药物诱导HL-60细胞survivin蛋白表达下调。结论：广枣黄酮的主要成份槲皮素及山萘酚有明显的抗白血病作用,且槲皮素诱导凋亡作用强于山萘酚。其作用机制可能是通过抑制细胞增殖、细胞周期阻滞、抑制survivin蛋白而诱导细胞凋亡。     

七叶皂苷诱导HL-60细胞凋亡的研究

本研究观察七叶皂苷对髓系白血病HL-60细胞的抑制和诱导凋亡作用。取对数期生长的HL-60细胞经饥饿处理后，加入不同浓度的七叶皂苷观察七叶皂苷抑制细胞生长的指数、形态学变化，用DNA片段凝胶电泳（DNALadder）和Annexin V／PI—FITC双标法分析诱导细胞凋亡的作用。结果表明：七叶皂苷抑制HL-60细胞生长．15—120mg／L的七叶皂苷处理细胞48小时后，存活率为（92．2±0．69）％-（8．2±0．96）％，均明显低于不加药的对照组（99．4±0．31）％（P均〈0．05）；七叶皂苷15—60mg／L处理细胞24小时后细胞发生凋亡。Annexin V／PI分析显示，给药组Annexin V阳性细胞为（12．7±0．58）％-（65．4±1．30）％，明显高于对照组的（0．57±0．03）％（P均〈0．01）。七叶皂苷处理的细胞DNA琼脂糖凝胶电泳显示典形的凋亡DNA梯形条带。结论：七叶皂苷能特异性地诱导HL-60细胞凋亡，此研究结果为七叶皂苷今后作为治疗白血病的辅助药物提供实验依据。