祛风通络方对大鼠系膜细胞增殖及转化生长因子β1和白细胞介素6mRNA表达的影响

目的：观察祛风通络方对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（mesangial cell，MC）增殖及其分泌的转化生长因子β1（transforming growth factor—betal，TGF—β1）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）mRNA表达的影响。方法：采用血清药理学方法，体外培养大鼠肾小球系膜细胞，分为正常对照组、模型组、蒙诺（福辛普利钠）组和祛风通络方组。并采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测大鼠MC增殖情况，逆转录聚合酶链反应法检测TGF—β1和IL-6mRNA的表达。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠肾小球系膜细胞增殖升高（P〈0．05）；与模型组比较，祛风通络方组大鼠肾小球系膜细胞增殖受到抑制（P〈0．05），且祛风通络方作用优于蒙诺（P〈0．05）。模型组系膜细胞TGF-β1mRNA表达高于正常对照组（P〈0．01）；祛风通络方组和蒙诺组系膜细胞TGF—β1mRNA表达低于模型组（P〈0．01）；祛风通络方组与蒙诺组比较，TGF—β1mRNA的表达降低（P〈0．01）。LPS刺激后可提高大鼠系膜细胞内IL-6mRNA的表达，与正常对照组比较，模型组IL-6mRNA表达上升，差异有统计学意义（P〈0．01）；祛风通络方组、蒙诺组与模型组比较，IL-6mRNA表达下降（P〈0．01）；祛风通络方降低IL-6mRNA表达的作用亦优于阳性对照药蒙诺（P〈0．01）。结论：祛风通络方对大鼠MC增殖及其TGF—β1和IL-6mRNA表达均有明显的抑制作用。     

祛风通络方对大鼠系膜细胞增殖及转化生长因子β1和白细胞介素6 mRNA表达的影响

目的：观察祛风通络方对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（mesangial cell，MC）增殖及其分泌的转化生长因子β1（transforming growth factor—betal，TGF—β1）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）mRNA表达的影响。方法：采用血清药理学方法，体外培养大鼠肾小球系膜细胞，分为正常对照组、模型组、蒙诺（福辛普利钠）组和祛风通络方组。并采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测大鼠MC增殖情况，逆转录聚合酶链反应法检测TGF—β1和IL-6mRNA的表达。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠肾小球系膜细胞增殖升高（P〈0．05）；与模型组比较，祛风通络方组大鼠肾小球系膜细胞增殖受到抑制（P〈0．05），且祛风通络方作用优于蒙诺（P〈0．05）。模型组系膜细胞TGF-β1mRNA表达高于正常对照组（P〈0．01）；祛风通络方组和蒙诺组系膜细胞TGF—β1mRNA表达低于模型组（P〈0．01）；祛风通络方组与蒙诺组比较，TGF—β1mRNA的表达降低（P〈0．01）。LPS刺激后可提高大鼠系膜细胞内IL-6mRNA的表达，与正常对照组比较，模型组IL-6mRNA表达上升，差异有统计学意义（P〈0．01）；祛风通络方组、蒙诺组与模型组比较，IL-6mRNA表达下降（P〈0．01）；祛风通络方降低IL-6mRNA表达的作用亦优于阳性对照药蒙诺（P〈0．01）。结论：祛风通络方对大鼠MC增殖及其TGF—β1和IL-6mRNA表达均有明显的抑制作用。     

血管紧张素-（1-7）对TGF-β1诱导的大鼠心肌成纤维细胞Smad3、Smad7 mRNA表达的影响

目的：观察血管紧张素-（1—7）对TGF-β1诱导幼年大鼠心肌成纤维细胞增殖以及Smad3、Smad7mRNA表达的影响。方法：分离培养SD仔鼠心脏成纤维细胞,以Ang-（1—7）、TGF-β1、Ang-（1—7）＋TGF-β1组、TGF-βI型受体抑制剂等干预,通过WST-1法检测细胞增殖,RT—PCR测定心脏成纤维细胞Smad3、Smad7mRNA的表达。结果：①与空白对照组比较,TGF-β1组心脏成纤维细胞的OD值增加（P〈0．05）;与TGF-β1组比较,0．001～1．0μmol／L血管紧张素－（1-7）和5μg／TGF-β1共同干预后OD值逐渐降低（P〈0．05）。②与对照组比较,TGF-β1组心脏成纤维细胞的Smad3mRNA表达升高（P〈0．05）,Smad7mRNA表达降低（P〈0．05）。结论：血管紧张素-（1—7）能有效抑制TGF-β1引起的心脏成纤维细胞的增殖,其作用不通过TGF-βI型受体介导。     

N-乙酰半胱氨酸对机械通气致大鼠急性肺损伤的干预作用

目的通过观察N-乙酰半胱氨酸（NAC）对大潮气量机械通气大鼠肺组织转化生长因子β1（TGF～β1）的影响,探讨NAC对机械通气致大鼠急性肺损伤的干预作用。方法24只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、大潮气量组和NAC干预组,测定其肺组织和血浆中丙二醛（MDA）含量,测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中蛋白含量,分别采用原位分子杂交技术和免疫组织化学染色法检测肺组织TGF—β1 mRNA及其蛋白的表达水平。结果大潮气量组和NAC干预组大鼠肺组织和血浆中MDA含量、BALF蛋白含量和细支气管上皮细胞TGF-β1 mRNA及其蛋白表达水平均明显高于对照组（均P〈0．01）;NAC干预组大鼠肺组织和血浆MDA含量、BALF蛋白含量和细支气管上皮细胞TGF—β1 mRNA及其蛋白表达水平明显低于大潮气量组（均P〈0．01）。相关性分析结果表明,大潮气量组和NAC干预组大鼠BALF蛋白含量与细气道上皮细胞TGF—β1 mRNA表达水平呈正相关（r=0．98,r=0．98,均P〈0．01）。结论氧化／抗氧化失衡参与了呼吸机相关性肺损伤（VALI）的发病过程,NAC通过其抗氧化作用对大鼠VAU模型具有一定保护作用。     

siRNA沉默livin基因对食管癌细胞生长与凋亡的影响

目的观察小分子干扰RNA（siRNA）沉默livin基因在食管癌细胞中的表达情况,探讨livin基因对食管癌细胞生长、凋亡的影响。方法自行设计两条针对livin基因的siRNA：livin—sh-1,livin—sh-2,构建相应的表达载体分别转染至对数生长期的食管癌,经G418筛选后采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、MTT、TUNEL分别比较检测转染前后食管癌细胞livin基因的表达。结果siRNA对照组与空siRNA载体组的livinw／β mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）;但转染siRNA组Livinl／2mRNA表达显著降低,明显低于siRNA对照组和空siRNA载体组（P〈0．05）。细胞生长曲线测定经F检验三组间差异无统计学意义。转染siRNA载体沉默livina／β表达,细胞凋亡率显著增加。结论siRNA沉默livin基因能抑制食管癌细胞的生长,促进食管癌细胞的凋亡,livin基因有可能成为食管癌治疗的新靶点。     

囊素五肽对人肺成纤维细胞细胞外基质及转化生长因子β1／Smad信号通路的影响

目的观察囊素五肽（BP5）对转化生长因子β1（TGF-1）刺激的人肺成纤维细胞分泌的细胞外基质以及对转化生长一β1／Smad信号通路的影响,探讨囊素五肽抗肺纤维化的机制。方法HLF细胞分为阴性对照组、TGF- β1 刺激组、TGF-β1＋BP5药物干预组（三组均用TGF-β1刺激后分别使用不同浓度BP52．5、5及10μg／mL进行干预）。免疫荧光法测定细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,Westernblot方法检测collagen—Ⅰ、p-Smad2／3、p-Smad3和Smad7蛋白的表达。结果TGF—β1刺激细胞经免疫荧光标记显示α-SMA阳性表达,说明人肺成纤维细胞在TGF-β1刺激下转化为肌成纤维细胞（MF）,TGF-β1刺激同时加BP5不同药物浓度组中,10μg／mL的BP5药物浓度能显著减少细胞增殖转化。经TGF-β1刺激后,人肺成纤维细胞collagen—Ⅰ[（1．402±0．158）比（0．605±0．367）]、p-Smad2／3[（1．457±0．111）比（0．815±0．039）]、p-Smad3[（1．320±O．147）比（0．623±O．128）]蛋白表达较刺激前表达明显增多（P〈0．01）,Smad7表达较对照组降低[（0．613±0．107）比（0．865±0．063）,P〈0．05）];与TGF-β1处理组相比,BP5可抑制由TGF-β1刺激人肺成纤维细胞引起的collagen—Ⅰ蛋白[（0．718±0．049）比（1．402±0．t58）]、p-Smad2／3[（0．696±0．031）比（1．457±0．111）]p-Smad3[（0．766±0．006）比（1．320±0．147）]表达上调（P均〈0．01）,而Smad7的蛋白表达明显增加[（1．237±0．173）比（0．614±0．107）,P〈0．05]。结论BP5可能通过抑制TGF—β1／Smads信号通路激活,下调TGF-β1刺激下人肺成纤维细胞的collagen-Ⅰ及d—SMA蛋白的表达,提示BP5可能对肺纤维化具有一定的干预作用。     

抗增殖蛋白抑制转化生长因子-β1诱导的肾脏成纤维细胞增殖和表型改变

目的 研究抗增殖蛋白（prohibitin,PHB）在肾间质纤维化发生中的作用。方法（1）检测48例原发性肾小球肾炎患儿肾组织中PHB蛋白表达,并比较其与肾小管间质损伤程度的相关性。（2）观察PHB在大鼠肾脏成纤维细胞（NRK-49F）中亚细胞定位,以Western印迹和RT-PCR测定NRK-49F受到转化生长因子B1（TGF-β1）刺激后PHB表达的变化。（3）构建PHB表达质粒并转染,观察PHB对NRK-49F细胞周期以及表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白质和mRNA的影响。结果 （1）PHB蛋白主要表达于肾间质细胞和肾小管上皮细胞的胞质,随肾小管间质损伤程度加重而逐渐减弱（组间比较,均P〈0．01）,PHB表达量与肾小管间质损伤程度显著负相关（r=-0．802,P〈0．01）。（2）激光共焦显微镜下见PHB主要分布于NRK49F的细胞质,细胞核亦有较弱表达。TGF-β1刺激后PHB蛋白和mRNA表达均下调,呈现时间和剂量依赖关系（组间比较,P〈0．01）。（3）成功构建PHB真核表达质粒,转染48h细胞中PHB蛋白量升高约2．54倍（与未转染组比较,P〈0．01）。（4）转染PHB基因明显抑制TGF—β1所诱导的细胞增殖,使更多的细胞处于G0／G1期（与TGF-β1组比较,P〈0．01）,而对未受刺激的细胞无影响（P〉0．05）。（5）转染PHB基因明显抑制TGF—β1所诱导的α-SMA蛋白质和mRNA表达（与TGF-β1组比较,P〈0．01）,而对α-SMA基础表达无影响（与TGF-β1组比较,P〉0．05）。结论 PHB在肾组织中的表达水平可以反映肾小管间质损伤程度．外源性PHB显著抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖和表型改变。     

NADPH氧化酶在TGF-β1诱导大鼠小管上皮细胞表达炎症因子中的作用

【目的】观察转化生长因子β1（TGF—β1）对大鼠肾小管上皮细胞单核细胞趋化因子-1（MCP-1）及白细胞介素-6（IL-6）表达的影响，并探讨NADPH氧化酶在其中的作用。【方法】以大鼠肾小管上皮细胞株（NRK-52E）为研究对象，采用TGF—β1（10ng／mL）刺激0h，2h，4h，8h，12h，24h分别收取RNA；刺激0h，12h，24h，48h，72h分别收取细胞上清液；部分实验中培养的细胞在刺激前用NADPH氧化酶抑制剂DPI（0．1，1，5，10μmol／L）预处理1h，然后含10ng的TGF—β1无血清DMEM／F12培养液分别培养12h（收集RNA）和24h（收集细胞上清液）。所有实验重复3次。细胞内活性氧（ROS）的产生采用激光共聚焦显微镜观察。NADPH氧化酶p22phox、gp91phox、p47phox和p67phox亚单位以及MCP-1和IL-6mRNA的表达采用RT—PCR检测。细胞上清液中MCP-1的含量采用ELISA检测。【结果】TGF—β1可显著上调NADPH氧化酶p67phox亚单位mRNA的表达，8h为对照的2．43倍（P〈0．01），24h达3．59倍（P〈0．01）。但对p22phox、gp91phox和p47phox亚单位mRNA表达无显著影响。TGF—β1显著增加细胞内ROS产生，DPI预处理后ROS产生较TGF—β1刺激组降低了43．69％（P〈0．05）。TGF—β1可显著上调MCP-1和IL-6mRNA及蛋白的表达。DPI预处理可明显逆转TGF—β1诱导的MCP-1和IL-6的上调表达。【结论】TGF—β1可促使细胞ROS产生增加。TGF—β1可能通过NADPH氧化酶依赖的ROS介导了大鼠肾小管上皮细胞MCP-1及IL-6的上调表达。     

混合游离脂肪酸对大鼠肺微血管内皮细胞Toll样受体4表达的影响及其介导的炎症反应机制

目的研究混合游离脂肪酸（FFA）对大鼠肺微血管内皮细胞（RRPMVECs）Toll样受体4（TLR4）的激活作用及其介导的链式炎症反应机制。方法以不同浓度的FFA处理体外培养的RPMVECs,Westernblotting检测TLR4蛋白的表达。用干扰小RNA（siRNA）转染体外培养的RPMVECs（TLR4 siRNA组和杂序siRNA组）,设立阴性对照组。分别用0．1mmol／LFFA、10ng／mL脂多糖（LPS）和5ng／mL肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理各组细胞,以未加药细胞作为相应的空白组。Real-TimePCR检测TLR4mRNA和NF-κB抑制蛋白激酶β（IKKβ）mRNA的表达,Westernblotting检测磷酸化核因子κB抑制因子（p-IκBα）和核因子κB（NF-κB）的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中炎症因子白介素-1β（IL-1β）的表达。结果RPMVECs的TLR4蛋白相对表达量在0．1mmol／LFFA处理后显著增高（P〈0．05）,并随FFA浓度的升高而增加。在杂序siRNA和阴性对照组,TLR4mRNA的相对表达量在LPS和FFA处理后显著升高（P〈0．05）,TNF-α处理无明显变化;而在TLR4干扰组,3种处理后TLR4mRNA的表达均无显著变化。在杂序siRNA和阴性对照组,3种方式处理后RPMVECs的IKKβmRNA、p-IκBα及IL-1β的相对表达量均显著升高（P〈0．05）,而TLR4siRNA干扰抑制了其在FFA和LPS处理组的表达,但对TNF-α组无抑制作用。结论FFA通过TLR4／IKKβ／NF-κB信号通路介导RPMVECs的炎症反应。     

慢病毒介导TGF-β1 siRNA对高体积分数氧致新生小鼠肺损伤的影响

目的：探讨以慢病毒介导的小分子干扰RNA技术（siRNA）沉默转化生长因子β1（TGF-β1）基因对高体积分数氧致新生小鼠肺损伤的影响.方法：将100只新生昆明小鼠随机分为高氧组、干扰组、阴性干扰组、空气组4组,每组动物25只.分别构建含TGF-β1短发卡RNA（shRNA）及阴性对照序列的PRNAT-u6.2载体,慢病毒包装.于小鼠出生后3d时将两类慢病毒载体以鼻腔吸入法分别导入干扰组和阴性干扰组小鼠肺内.出生后4～14d时将高氧组、干扰组、阴性干扰组小鼠置于含600mL/LO2的氧箱内饲养.空气组仅置空气下饲养.出生后4,7,14,21,28d时分别随机杀取各组5只动物并取左上肺制作石蜡切片,进行组织形态学变化观察,测定放射状肺泡计数（RAC）和肺泡平均截距（MLI）.右肺组织以RT-PCR,Western Blot法分别检测TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平.结果：经测序和双酶切鉴定,表达TGF-β1 shRNA的慢病毒载体构建成功;干扰组肺组织TGF-β1 mRNA水平在小鼠出生后4d即明显低于其他3组（P〈0.05）;出生后7,14,21,28d时干扰组TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平均低于高氧组和阴性干扰组,但高于空气组（P均〈0.05）.出生后7,14,21,28d干扰组MLI低于高氧组和阴性干扰组而高于空气组（P均〈0.05）.RAC高于高氧组和阴性干扰组而低于空气组,差异均具有统计学意义（P〈0.05）.高氧组与阴性干扰组在各时间点上述各项指标的差异无统计学意义.结论：慢病毒载体介导的TGF-β1小分子干扰RNA对高体积分数氧吸入所致新生小鼠肺损伤具有保护作用.     

β 防御素 2 对大鼠肺部炎症细胞因子的影响

目的 探讨 β 防御素 2 对大鼠肺部炎症反应的影响及其可能机制。方法 构建大鼠β 防御素 2（rBD2）的 cDNA 慢病毒载体和 RNA 干扰载体,双向调节 rBD2 在大鼠肺组织内的表达水平,ELISA 法检测肺组织中 IL-1α ,IL-1β ,IL-4,IL-10 的表达变化。Western blot检测肺组织中 rBD2 的表达,Real time PCR 法检测肺组织中 rBD2 mRNA 的表达。结果 成功构建 rBD2 cDNA 慢病毒和 RNA 干扰载体,并成功转染。大鼠肺部感染时,上调rBD2可降低IL-1α ,IL-1β等促炎细胞因子的水平,提高抗炎细胞因子IL-4,IL-10的含量（P-〈0．01）。结论rBD2可调节大鼠肺组织炎症相关细胞因子的水平,参与并抑制大鼠肺部炎症反应。     

RNAi抑制NEK293细胞TGF-β1表达的研究

目的:探讨针对转化生长因子β1(TGF-β1)的小干扰RNA(siRNA)对大鼠肾间质细胞系(NEK293)TGF-β1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用.方法: 利用RNA干扰(RNAi)效应设计针对TGF-β1的不同siRNA,构建表达载体质粒并转染NEK293细胞系.RT-PCR和WesternBlot分别检测TGF-β1 mRNA及蛋白的表达,细胞生长试验和流式细胞观察转染前后细胞周期及细胞凋亡的变化.另设一无意义RNA载体质粒为阴性对照.结果: siRNA转染效率70%,特异性siRNA对TGF-β1 mRNA及蛋白的表达具有抑制作用(P>0.05),实验组细胞生长受到抑制、凋亡增加(P>0.05).结论: 应用RNAi技术可明显抑制TGF-β1的表达,并高效的抑制NEK293的生长、诱导其凋亡.     

siRNA干扰整合素β4的表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响

目的采用RNA干扰（Small interference RNA,siRNA）技术抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞中整合素β4（integrinβ4）基因表达,观察其对细胞侵袭和迁移能力的影响。方法选用MDA-MB-231乳腺癌细胞为研究对象,应用siRNA技术沉默癌细胞Integrinβ4 mRNA的表达,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测未转染Integrinβ4 siRNA的乳腺癌细胞组（简称空白对照组）及转染Integrinβ4 siRNA的乳腺癌细胞组（简称Integrinβ4 RNA干扰组）的Integrinβ4 mRNA和蛋白表达水平;Transwell实验检测两组细胞的侵袭及迁移能力。结果与空白对照组相比,Integrinβ4 RNA干扰组Integrinβ4的mRNA及蛋白表达水平分别降低了86%（P〈0.01）和89%（P〈0.01）,细胞侵袭和迁移能力下降（P〈0.05）。结论应用siRNA干扰技术抑制Integrinβ4表达可使MDA-MB-231细胞迁移及侵袭能力降低,提示Integrinβ4在乳腺癌侵袭转移中发挥重要作用。     

藏药帕珠丸对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织IL-1、IL-6、TNF—α、TGF—β1含量及TGF—β1 mRNA表达的影响

目的观察藏药帕珠丸对酒精性肝损伤大鼠肝组织IL-1、IL-6、TNF一α、TGF—β1含量及TGF—β1 mRNA表达的影响。方法分别给予慢性酒精性肝损伤模型大鼠50、100、200mg·kg^-1帕珠丸混悬液,观察其对肝组织IL-1、IL-6、TNF—α、TGF—β1含量及TGF—β1 mRNA表达的影响。结果藏药帕珠丸低、中、高剂量组肝组织IL-1、IL-6、TNF-α、TGF—β1含量均显著降低（P〈0．05）,TGF—B,mRNA表达下降（P〈0．05）。结论藏药帕珠丸可能是通过降低肝组织中IL-1、IL-6、TNF-α、TGF—β1含量及TGF—β1 mRNA表达,对大鼠慢性酒精性肝损伤发挥保肝作用。     

靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的 构建具有特异性瘦素（leptin）基因小于扰RNA（small interfering RNA，siRNA）功能的表达质粒，研究靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中leptin表达及HSC生物学特性的影响。方法 以leptin为目的基因，以产生siRNA质粒载体psiRNA-hHlneo为表达模板，细胞内转录合成4对特异的siRNA和1对对照siRNA。构建能在真核细胞中表达的重组质粒leptinsi RNA，用酶切方法和测序法对重组体进行鉴定。应用脂质体介导重组质粒转染HSC。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测HSC的leptin表达情况，用MTT法检测细胞增殖，用流式细胞仪分析细胞凋亡。结果 酶切和序列测定表明，成功构建了leptinsiRNA表达质粒；外源重组质粒siRNA3和siRNA4能够抑制leptinm RNA和蛋白表达（均P〈0．01）；HSC增殖活性显著降低（P〈0．05），凋亡增加（P〈0．01）。与未转染组相比，consiRNA、siRNA1和siRNA2转染组没有显著改变（均P〉0．05）。结论 构建的leptinsi RNA表达载体可减少leptin的表达，抑制HSC增殖并诱导其凋亡。为肝纤维化基因治疗提供了新的靶点。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对大鼠肾成纤维细胞转化生长因子β1/Smad信号途径的作用研究

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂阻断转化生长因子（TGF）β1致肾间质纤维化作用的机制，探讨其抗肾间质纤维化的潜在作用。方法体外培养大鼠肾成纤维细胞株（NRK／49F），观察PPARγ配体15d-PGJ2及其激动剂曲格列酮和齐格列酮对TGFβ1诱导的纤维连接蛋白（FN）mRNA表达的影响。利用Western印迹技术观察PPARγ激动剂对TGFβ1诱导的FN和Smad蛋白表达的影响。结果（1）与1ng／ml TGFβ1组比较，5ng／ml TGFβ1组FN mRNA表达量增加了3．6倍（P〈0．01），5ng／ml TGFβ1刺激24h时较刺激前增加了2．4倍（P〈0．01），TGFβ1诱导FN mRNA表达呈一定范围内的剂量（0—5ne／ml）和时间（0—24h）依赖效应。（2）与5ng／ml TGFβ1组比较，10μmol 15d-PGJ2、曲格列酮和齐格列酮预处理组FN mRNA表达量分别降低37．3％、41．5％和22．7％，FN蛋白表达量分别降低20．6％、38．1％和28．6％。（3）5ng／ml TGFβ1以时间（0．2h）依赖方式诱导p-Smad2／3蛋白表达量增加，作用1h时达到高峰；5ng／ml TGFβ1组p-Smad2／3蛋白表达量较对照组和2ng／ml TGFβ1组分别增加3．42倍和0．97倍。（4）15d-PGJ2、曲格列酮和齐格列酮预处理组p-Smad2／3蛋白表达量与5ng／ml TGFβ1组比较分别降低61．2％、53．0％和59．S％。3种药物干预组之间p-Smad2／3蛋白表达量比较差异无统计学意义，各组Smad2和Smad3蛋白表达量无显著变化。结论PPART激动剂可以抑制TGFβ1诱导的肾间质成纤维细胞细胞外基质合成，其机制可能与阻断TGF-β1／Smad信号途径有关，提示PPARγ激动剂具有抗肾间质纤维化的潜在作用，可能成为延缓终末期肾功能衰竭的治疗新手段之一。     

RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β1刺激结缔组织生长因子表达的影响

目的 体外构建结缔组织生长因子(CTGF)序列特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,研究其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF表达基因和蛋白的影响. 方法 体外构建CTGF序列特异性siRNA质粒表达载体,Dosper脂质体转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后.用10 ng/ml剂量的转化生长因子(TGF-β1)刺激细胞,采用RQ-PCR和Western blot观察CTGF mRNA和蛋白水平的变化.结果经TGF-β1刺激后,重组质粒组CTGF mRNA仅为止常表达的56.6%(P<0.05),CTGF蛋白仅为正常表达的基线水平(P<0.05). 结论 siRNA质粒表达载体可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF基因表达和蛋白分泌,即使在TGF-β1刺激条件下,其分泌功能仍明显受抑.     

转化生长因子β1在老龄大鼠博来霉素诱导肺成纤维化模型肺脏中的表达变化

目的对比观察转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGFβ1）在老龄大鼠及成年大鼠博来霉素诱导肺间质纤维化模型中表达水平的变化，探索老年人肺间质纤维化发病率升高的可能机制。方法大鼠气管内灌注博来霉素（实验组）或生理盐水（对照组），择期处死，取出鼠肺，Trizol一步法提取大鼠肺脏mRNA，M-MLV逆转录为cDNA。利用taqman探针方法实时PCR（realtime PCR）技术测定TGFβ1 mRNA表达量。结果老龄大鼠肺脏TGFβ1 mRNA表达水平与成年大鼠肺脏表达水平差异无显著性（P〉0．01）。气管内灌注博来霉素后老龄大鼠肺脏TGFβ1 mRNA表达水平升高，第14h达到峰值，与成年大鼠气管内灌注博来霉素后肺脏TGFβ1 mRNA升高一致，但是保持峰值时间长于成年大鼠。结论气管内灌注博来霉素后老龄大鼠肺脏TGFβ1长时间高水平表达可能是增龄后肺间质纤维化发病水平增高的基础。     

靶向小鼠核因子κB P65的小干扰RNA逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的构建靶向小鼠核因子κB（NF-κB）P65进行RNA干扰（RNAi）的逆转录病毒载体,鉴定其生物学效应。方法采用分子克隆技术构建靶向小鼠NF-κB P65 siRNA的逆转录病毒载体,转染293E细胞,包装成逆转录病毒,以不同滴度感染小鼠单核巨噬细胞J774A.1,用相同浓度的脂多糖（LPS）刺激,在不同时间点用RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平上检测细胞NF-κBP65表达,并用RT-PCR和ELISA方法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达。结果成功构建靶向小鼠NF-κB P65基因的小干扰RNA逆转录病毒表达载体。经LPS刺激后,siRNA病毒组J774A.1细胞中NF-κB P65 mRNA的表达明显受到抑制,2 h即明显低于Scramble病毒组（0.91±0.03比1.02±0.02,P〈0.01）,此后持续降低;在LPS刺激后的24、36、48和72 h,siRNA病毒组NF-κB P65蛋白表达均明显低于Scramble病毒组（0.97±0.02比1.01±0.01,0.94±0.01比1.02±0.01,0.94±0.02比1.02±0.01,0.93±0.01比1.00±0.02,P〈0.05）。LPS刺激后2、6、12和24 h,siRNA病毒组TNF-α的mRNA表达水平均明显低于Scramble病毒组（P〈0.01）,而相同时间点siRNA病毒组细胞上清TNF-α的含量亦明显低于Scramble病毒组（P〈0.01）。结论将小干扰RNA片段连接到空白质粒中构建逆转录病毒表达载体的方法是可行的。采用RNA干扰技术抑制NF-κB的表达后,可以减少其下游炎症因子的释放,提示RNA干扰技术在炎性损伤性疾病如急性肺损伤的防治中具有潜在应用价值。     

阿魏酸钠对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子β1信号通路分子mRNA表达的影响

目的观察阿魏酸钠对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子β1（TGF-β1）信号通路分子mRNA表达的影响，探讨其防治肺纤维化的作用及机制。方法气管内滴入博来霉素（5mg／kg）建立大鼠肺纤维化模型。将30只SD大鼠随机分为三组（每组10只）：对照组、肺纤维化模型组和阿魏酸钠组。HE染色检测肺组织病理改变，胶原纤维染色检测胶原纤维表达，原位杂交技术检测肺组织TGF-βRⅡ及Smad4 mRNA表达，实时荧光定量RT-PCR技术检测TGF-β1 mRNA表达。结果胶原纤维染色显示模型组大鼠肺内胶原纤维表达显著高于对照组和阿魏酸钠组（P〈0．001）。大鼠肺内TGF-β1、TGF-βRⅡ和Smad4的mRNA表达在模型组显著高于对照组（P〈0．01），在阿魏酸钠组显著低于模型组（P〈0．05）。结论阿魏酸钠能有效地减轻肺纤维化大鼠肺组织的纤维化程度，其作用机制主要是通过抑制TGF-β1、TGF-βRⅡ和Smad4的mRNA表达上调，从而干扰TGF-β1／Smad4信号通路对靶基因的激活来实现的。