Fas基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建肿瘤凋亡基因Fas小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肺腺癌A549细胞Fas基因表达的阻抑作用,探索Fas/FasL途径在肺癌转移中的作用机制。方法设计有小发夹结构的3条Fas siRNA对应模板DNA序列,退火处理后克隆至pGCsi-U6质粒,构建重组质粒pSi-Fas。将pSi-Fas转染人肺癌A549细胞,采用Western blot检测Fas表达。结果酶切及测序证实质粒pSi-Fas构建成功,可显著抑制A549细胞Fas蛋白表达。结论成功构建的Fas siRNA表达质粒pSi-Fas能抑制人肺癌A549细胞Fas蛋白表达。     

TNF-α基因siRNA真核表达载体的构建及其对A549细胞TNF-α和TGF-β1表达的影响

目的:构建靶向肿瘤坏死因子α（TNF-α）基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,观察其对人肺腺癌A549细胞中TNF-α和转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响。方法:依据GenBank中人TNF-α（NM₀00594）序列和siRNA靶序列设计原则,设计并合成一对针对TNF-α的特异性序列（siTNF-α）和一对无关序列（siCon）。退火合成DNA双链,再分别重组入pRNAT-U6.1载体,经过PCR和DNA测序鉴定。将构建好的重组载体pRNAT-U6.1-siTNF-α、pRNAT-U6.1-siCon及空载体pRNAT-U6.1用脂质体介导转染A549细胞株,分别采用RealtimePCR和Westernblot方法检测细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平。结果:PCR和DNA测序鉴定证实载体构建成功;转染pRNAT-U6.1-siTNF-α的A549细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均低于其他3组（FmRNA=478.663,4.081;F蛋白=123.420,6.312,P均<0.05）。结论:成功构建了靶向TNF-α基因的siRNA真核表达载体,该载体能够有效沉默A549细胞中TNF-α的表达,TGF-β1基因表达亦受到抑制。     

hnRNP B1 siRNA对肺腺癌细胞A549 p53表达的影响

目的 探讨核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)B1调节肺腺癌细胞A549抑癌基因p53表达的作用.方法 采用前期研究已构建并通过体外实验证实具有较好干扰效果的两对hnRNP B1特异性的小干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体(重组质粒A和D)转染的人肺腺癌细胞株A549作为实验组,对照组为转染空质粒的A549细胞和未转染任何质粒的A549细胞.各组细胞均用10 μmol/L顺铂作用24 h收集细胞.实时荧光定量RT-PCR检测p53 mRNA的表达,Western blot检测P53及磷酸化P53蛋白表达的变化.结果 各组细胞p53 mRNA和蛋白表达量无明显差异,说明hnRNP B1特异性siRNA对A549细胞p53基因mRNA和蛋白表达无影响.转染hnRNP B1 siRNA细胞磷酸化P53蛋白表达率分别为0.87±0.06、0.75±0.06,与空质粒转染组(0.30±0.08) 和未转染组(0.21±0.04)相比明显增高(P<0.01).结论 hnRNP B1 siRNA可上调肺腺癌细胞A549 P53活性,参与肺癌的发生发展.     

肺腺癌细胞A549 hnRNP B1基因RNA干扰的体外研究

目的 体外研究特异的小干扰RNA(siRNA)对肺腺癌细胞A549 hnRNP B1 基因表达及生长的抑制作用. 方法设计和构建由H1启动子驱动产生的特异的hnRNP B1 siRNA 表达质粒,转染至A549细胞,荧光定量PCR法及Western blot检测hnRNP B1基因的表达,MTT法检测该表达质粒转染后对A549细胞生长的影响.结果 针对hnRNP B1 基因构建的重组质粒具有明显的干扰效果,受特异hnRNP B1 siRNA 干扰的A549细胞hnRNP B1 mRNA及蛋白表达下调,细胞生长受到抑制.结论 应用RNA干扰技术可阻止hnRNP B1基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向.     

人分化抑制因子3基因靶向微小分子RNA表达载体的构建及筛选

目的人分化抑制因子3(inhibitor of differentination 3,Id3)基因在A549细胞中的外源性表达能抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。文中旨在构建靶向人Id3基因的微小分子RNA(miRNA)表达载体,观察miRNA对A549细胞中Id3表达的下调作用,为进一步探讨Id3基因在A549细胞生长调控中的作用机制提供一定实验依据。方法依据miRNA设计原则,针对人Id3基因的mRNA序列,设计并合成编码miRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建含靶向人Id3基因的miRNA表达质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3),DNA测序验证后,采用Lipofectamine2000TM脂质体转染技术将该质粒导入A549细胞。荧光倒置显微镜下观察miRNA干扰质粒转染A549细胞后EGFP的表达情况,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测miRNA干扰后Id3mRNA及蛋白水平的表达。结果DNA测序表明重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3构建正确,将其成功导入A549...     

利用RNAi技术抑制Bcl 2基因表达增强肺腺癌A549细胞放射敏感性

目的利用RNAi技术抑制Bcl 2基因的表达,观察其对肺腺癌A549细胞凋亡和放射敏感性变化的影响。方法构建Bcl 2基因的干扰质粒pBcl 2 siRNA,稳定转染人肺腺癌A549细胞,同时设立转染无意义链组、空载体组和未转染组。采用Real time RT PCR和Western blot方法, 观察Bcl 2基因在mRNA和蛋白水平表达的变化。采用流式细胞术和克隆形成方法,检测RNA干扰对A549细胞放射敏感性的影响。结果成功构建bcl 2 siRNA质粒,转染A549细胞,获得稳定转染细胞株A549/Bcl2 Ins;Bcl 2mRNA、 Bcl 2蛋白表达明显降低;A549/Bcl2 Ins凋亡率［（10.11±0.92）%］明显高于对照组,6Gy X线照射后凋亡率［（28.81±1.10）%］明显高于对照组及未照射组;A549/Bcl2 Ins的D0和Dq值分别为1.399和1.298,明显低于转染无意义序列细胞株A549/Bcl2 Neg(1.695和2.480)、转染空载体细胞株A549/SD (1.706和2.227)和空白对照细胞A549(1.816和2.777)。结论RNAi技术可以有效抑制肺腺癌A549细胞Bcl 2基因的表达,增强A549细胞对X线的放射敏感性。     

CCR7基因载体的构建及其在肺腺癌H157细胞的稳定表达

目的 构建人CCR7基因真核表达质粒,获得稳定表达CCR7蛋白的H157细胞.方法 应用逆转录PCR法(RT-PCR)自人肺腺癌标本中扩增出CCR7编码区序列,定向克隆至载体pEGFP-N1中构建质粒pEGFP-CCR7,采用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒DNA导入肺腺癌H157细胞中,加入G418对细胞进行筛选,...     

CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响?方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA 慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定?用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-time PCR?Western-blot检测CTGF mRNA和蛋白的表达?结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确?经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低?结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGF mRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础?     

人miRNA let 7a2质粒的构建及其表达

目的构建人miRNA let 7a2真核表达质粒,检测其在肺癌细胞A549中的表达。方法以人肺腺癌A549细胞总RNA为模板,将RT PCR扩增let 7a2的前体（pre let7a2）序列, 克隆至pSilencer4.1 CMV neo表达载体中,构建pSilencer4.1 let7a2重组质粒,转染A549细胞,采用RT PCR法检测pre let7a2的表达;构建let 7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIR Report let7a2T,与pSilencer4.1 let7a2质粒共转染A549细胞,测定相对荧光素酶活性,以检测成熟let7a2在A549细胞中的表达及作用;采用MTT比色法检测pSilencer4.1 let7a2转染对A549细胞增殖的影响。结果构建的人let 7a2真核表达质粒pSilencer4.1 let7a2和let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIR Report let7a2T经酶切及测序鉴定正确;pSilencer4.1 let7a2质粒转染A549细胞后,RT PCR检测pre let7a2表达较对照组明显增强;MTT比色法显示let 7a2对A549细胞增殖有抑制作用。pSilencer4.1 let7a2 质粒和pMIR Report let7a2T质粒共转染A549细胞后,通过报告基因检测相对荧光素酶活性较对照组降低,显示let 7a2表达质粒转染A549细胞后,可有效表达let 7a2并转变为成熟的具有生物学活性的let 7a2。 结论成功构建了人let 7a2真核表达质粒,并在肺腺癌细胞A549中有效表达。     

针对DEK原癌基因的siRNA真核表达载体的构建

目的 以DEK基因为靶基因,针对其特定核苷酸序列,构建psiRNA-hHDEK表达载体,转染宫颈癌CaSki细胞,观察DEK siRNA对DEK基因mRNA转录水平和蛋白表达水平的靶向沉默效应.方法 根据DEK核苷酸序列,利用软件设计出针对DEK位点的特异性小干扰RNA,克隆至siRNA真核表达载体psiR-NA-hHlneo中,构建能在真核细胞中表达的靶向DEK基因的siRNA重组质粒;应用脂质体介导重组质粒转染宫颈癌CaSki细胞株,用RT-PCR和Western Blot检测转染后DEK mRNA和蛋白表达.结果 筛选出阳性克隆,抽提质粒,经限制性内切酶AseI酶切鉴定及测序分析证实合成的siRNA序列正确,并已准确克隆入psiRNA-hHl neo我体中.DEK特异性siRNA栽体构建成功.经RT-PCK和Western Blot测定分析,转染质粒psiRNA-hHDEK CaSki细胞组DEK mRNA和蛋白的表达明显减少.结论 成功构建了DEK特异性siRNA表达载体.设计构建的真核表达载体可以特异性干扰DEK原癌基因的表达,为进一步研究DEK基因的功能奠定了基础.     

HSV-tk基因表达载体的构建及其对A549细胞的杀伤作用

目的构建自杀基因HSV-tk表达质粒,研究自杀基因疗法对人肺癌细胞的杀伤作用,探讨其治疗肺癌的可行性。方法PCR扩增tk基因带EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点,然后构成建到pcDNA3.0载体中成pcDNA3.0-tk;将pcDNA3.0-tk转染A549肺癌细胞,应用细胞生长曲线和MTT法测定前药GCV对A549细胞的杀伤作用。结果成功获得pcDNA3.0-tk克隆,RT-PCR、Western印迹法证明A549细胞转染pcDNA3.0-tk后可表达自杀基因,GCV能特异性地杀伤A549/tk细胞。结论HSV-tk基因表达质粒构建成功;HSV-tK/GCV系统对肺癌A549细胞有一定的杀伤作用。     

靶向IGF-1R的siRNA增强肺癌细胞对Trail诱导凋亡敏感性的研究

目的 研究IGF-1R特异RNA干扰后肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的改变以及其对Trail的敏感性。 方法 化学合成IGF-1R特异siRNA转录模板,与表达载体连接,转染大肠杆菌扩增后提取质粒,酶切鉴定和DNA测序分析。转染A549细胞后筛选稳定表达IGF-1R-siRNA细胞株,FQ RT-PCR、Western blot和免疫组织化学检测IGF-1R基因表达。MTT法和流式细胞仪测定Trail作用前后转染和非转染A549细胞增殖活性和凋亡率。 结果 成功构建IGF-1R-siRNA表达载体并筛选出稳定表达IGF-1R-siRNA单克隆细胞。和空白对照相比IGF-1R蛋白和IGF-1RmRNA表达分别下降79.01%(0.17±0.06 vs.0.81±0.15)(P＜0.01)和76.05%(1.36±0.26 vs.5.68±0.45)(P＜0.01)。免疫组织化学显示IGF-1R表达降低。Trail作用于IGF-1R-siRNA的A549,细胞增殖速度降低(P＜0.05);凋亡率明显增加(P＜0.01)。 结论 IGF-1R-siRNA表达载体具有RNA干扰作用。IGF-1R表达下降后A549细胞增殖速度减慢,对Trail诱导的细胞凋亡敏感性增加。      

携带STAT3基因的siRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建含入STAT3基因不同位点的一系列siRNA真核表达质粒pSUPER,并进行测序,为以STAT3为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定基础.方法:将人工合成的针对STAT3基因2个不同位点经基因重组定向克隆插入到真核表达质粒pSUPER中,通过PCR检测及质粒测序确定重组结果.结果:各对mRNA序列均按正确方向插入pSUPER质粒.结论:成功构建了含人STAT3基因2个不同位点的siRNA真核表达质粒.     

哺乳动物细胞siRNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建哺乳动物细胞siRNA表达载体。方法：用PCR的方法扩增人源性的U6启动子的序列，并将其克隆入pUC18载体中，进一步将针对绿色荧光蛋白的编码siRNA的DNA克隆入U6启动子的下游，通过限制性酶切和测序对该重组表达载体进行鉴定。结果：限制性酶切和测序结果表明成功构建了哺乳动物细胞siRNA表达载体pUC18U6。结论：哺乳动物细胞siRNA表达载体pUC18U6的构建为进一步利用siRNA研究基因的功能及治疗疾病奠定了基础。     

转录因子Kaiso真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定转录因子Kaiso的表达质粒pEGFP-Kaiso.方法 采用PCR的方法扩增pCS2-Kaiso中人Kaiso的全长序列,克隆至载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-Kaiso,以酶切及基因测序方法鉴定重组质粒的准确性.利用LipofectamineTM 2000将重组质粒转染至肺癌细胞系A549,24h后荧光显微镜观察绿色荧光信号,48 h后Western blot鉴定Kaiso蛋白表达变化.结果 限制性双酶切及DNA测序分析结果显示插入的DNA片段长度约为2 022 bp,与预期Kaiso基因片段大小相同.转染pEGFP-Kaiso重组质粒后,荧光显微镜观察到明确的绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光信号,Western blot证实转染pEGFP-Kaiso质粒后的Kaiso蛋白表达量显著上调(P＜0.05).结论 成功构建了人Kaiso基因真核表达载体,为深入研究Kaiso的生物学功能提供了有力的实验工具.     

RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响

目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,观察RNA干扰介导的MAGE3基因表达默寂对肺癌细胞定植和转移的影响.方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneoGFP载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR和Western印迹检测MAGE3基因mRNA和蛋白表达水平的变化.用软琼脂克隆形成实验和细胞体外侵袭实验,观察对肿瘤形成能力和侵袭力的影响.结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPERneoGFP载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western印迹检测显示, MAGE3基因的表达水平明显降低;转染siRNA表达载体组的肺癌细胞在软琼脂中形成克隆数和穿透Matrigel的细胞数都显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性（P﹤0.05）.结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体, RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉寂可有效降低肺癌细胞定植和转移.     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因真核表达载体的构建

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,为进一步研究打下基础。方法以Hela细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pCDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,并用酶切分析和序列测定进行鉴定。结果经酶切鉴定和测序证实,人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)。结论真核表达质粒pCDNA3.1(-)-sTNFR1的构建为今后的研究打下了基础。     

CD151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立

目的构建人的CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立A549-CD151i稳定细胞株。方法根据人的CD151基因序列,设计三对RNAi序列,筛选出有效序列,利用此有效序列,合成相对应的Oligo DNA,退火后形成黏性末端的DNA双链,与双酶切后的pshRNA—Lentivector载体连接得到LV—CD151i慢病毒载体,转化TOP10感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。用LV—CD151i和包装质粒共转染慢病毒包装用293T细胞,生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。利用所获得的慢病毒感染A549细胞,筛选稳定转染细胞株。结果测序证实,成功构建CD151RNAi的慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为5×10^8ifu,并利用此病毒悬液,成功感染A549细胞,筛选到稳定表达细胞株。结论成功构建人CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立稳定的A549-CD151i细胞株。