胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞的分离培养与观察

目的建立神经干细胞分离、培养、分化鉴定技术,观察神经干细胞增殖、分化特点.方法利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代、贴壁分化观察.采用免疫细胞化学、透射电镜检测技术,观察鉴定神经干细胞和分化的神经细胞.结果从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞,透射电镜观察见典型的干细胞特征和不对称分裂现象.贴壁分化后可以出现MAP2、NSE、GFAP和GC表达阳性的细胞.结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎端脑皮层在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体———巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。结果获得了大量自我增殖并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。结论成功分离并获得了大鼠胚胎端脑皮层神经干细胞,并连续稳定传代,具有多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

人类神经干细胞的长期培养和传代

目的：探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。方法：采用机械方法从胎脑中分离神经细胞，应用N2培养基进行培养，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子(EGF)刺激细胞扩增；传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养；应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果：从流产胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞，培养条件下呈悬浮状态生长，形成神经球，绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashi1两种神经干细胞的标志物；这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞，早期的培养有少量的少突胶卷质细胞；在这种培养条件下，神经干细胞生长速度较慢，而采用切割神经球的方法保持了细胞间的联系，神经干细胞可获得较大的扩增速度。结论：体外的培养条件下，可从胎脑组织中培养出神经干细胞，它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及分化研究

目的:研究大鼠胚胎神经干细胞体外分离、培养的条件及增殖、分化特性。方法:取胎龄15~17 d的SD大鼠胎脑海马及室周组织,在含碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF),表皮生长因子(EGF),B27、N2添加剂的无血清培养基中培养,用有限稀释法进行克隆、传代,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞克隆球及诱导分化后的细胞。结果:大鼠胎脑能在体外培养获得大量神经干细胞,并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:胚胎脑组织有丰富的神经干细胞,可在体外长期培养并保持干细胞特性,能分化为神经元、胶质细胞等终末细胞。     

胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞的分离培养及分化观察

目的：研究脊髓源性神经干细胞的分离、培养、增殖和分化特点。方法：利用无血清培养和细胞克隆培养技术及免疫细胞化学方法，观察脊髓源性神经干细胞的体外扩增和贴壁分化情况。结果：脊髓源性神经干细胞具有增殖能力，并可传代培养，经含血清培养基培养，贴壁可分化为MAP2、GFAP和GC阳性细胞。结论：分离培养的脊髓源性神经干细胞具有增殖能力，并具有多向分化潜能。     

新生大鼠神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的获得新生大鼠神经干细胞,为深入研究其增殖分化奠定基础。方法从新生24小时内大鼠端脑及中脑部位分离NSC,采用体外无血清悬浮培养,以获得能在体外长期生存的NSC;通过单细胞克隆实验检测其自我更新能力,免疫细胞化学检测NSC标志物nestin表达及分化为神经元和胶质细胞的能力;用细胞计数法研究其生长特点并绘制生长曲线。结果获得的NSC能在体外长期生存,具有很强的增殖能力、自我更新能力,能分化为神经元和胶质细胞,具有多向分化能力,表达nestin,体外传代至10代细胞数量扩增了40倍。结论成功地从新生大鼠端脑和中脑中分离得到了能在体外长期培养的NSC。     

不同分离方法对人胚胎脑海马区神经干细胞体外生长的影响

目的　比较不同分离方法对人胚胎脑海马区神经干细胞生长的影响。方法　取胎龄 8～ 12周药物流产的人胚胎脑 ,分别用胰蛋白酶消化法和机械分离法分离海马区细胞 ,均以 10 6个细胞 /ml接种到含人表皮生长因子 (h -EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子 (h -bFGF)和人白细胞抑制因子 (h -LIF)的基础培养液中培养 ,以含1%胎牛血清 (FBS)的DMEM/F12和多聚鸟氨酸诱导分化 ,免疫细胞化学鉴定。结果　胰蛋白酶消化组和机械分离组分离到的活细胞分别占各自细胞总数的 4 8.2 %和 6 1.7% (P <0 .0 5 ) ;7天后 ,两组均形成许多直径从几十到几百个微米不等的细胞球 ,但机械分离组的细胞球数目明显多于胰蛋白酶消化组。取细胞球诱导分化及免疫细胞化学染色鉴定 ,细胞分别呈RNA -结合蛋白、β-Ⅲ管蛋白、胶质原纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂免疫细胞化学反应阳性。结论　人胚胎脑海马区有神经干细胞存在 ,离体培养时能分裂增殖 ,并能被诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。机械分离法可以获得更多的活细胞 ,原代培养易形成较多的细胞球。     

胚胎大鼠海马神经干细胞分离培养和分化

目的：研究胎鼠脑海马组织去掉的神经干细胞的分离、培养、增殖及分化特点。方法：采用无血清培养、单细胞克隆技术及免疫细胞化学方法，观察海马源性神经干细胞的体外扩增和贴壁分化情况。结果：从大鼠胚胎脑海马分离的细胞具有增殖能力，可以传代培养，子代细胞免疫组化显示神经巢蛋白(nestin)阳性。经含血清培养基培养，贴壁可分化为微管相关蛋白-2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞。结论：用本方法分离培养的细胞具有自我复制和多向分化的能力，是中枢神经系统的干细胞。     

GFP标记成年大鼠表皮神经嵴干细胞的分离培养与形态学特征

目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记大鼠表皮神经嵴干细胞(EPI-NCSC)的分离培养方法,为EPI-NCSC在体移植研究脊髓损伤修复奠定基础。方法分离成年GFP大鼠胡须毛囊,取毛囊隆突部贴附于胶原包被的培养板上。在培养第4天有大量细胞游出,取出贴附的毛囊隆突部,细胞传代培养。细胞采用SOX10和Nestin免疫细胞化学染色鉴定,并计算细胞纯度。结果 EPI-NCSC在胶原基质上从隆突部游出,细胞为圆形或梭形,呈强绿色荧光。免疫细胞化学染色SOX10和Nestin双阳性,纯度在99%以上。结论本实验方法简便易行,能分离出高纯度的GFP-EPI-NCSC,可作为一种有效的工具细胞用于损伤脊髓修复研究。     

新生大鼠神经干细胞的体外分离和培养

目的改进大鼠神经干细胞的分离和培养方法。方法用出生1～3d的新生大鼠，取脑用刀片剁碎和吸管吹打的机械分离法代替酶消化法。用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞、神经元和星形胶质细胞。结果用机械分离法从新生大鼠脑组织分离神经干细胞的获得率较高，并培养出较多的神经球，还能分化成神经元和星形胶质细胞。结论该方法简便，能得到较多的神经球，细胞获得率也较高。     

大鼠海马神经干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探寻出生后1～3d和成年大鼠海马分离、培养并鉴定神经干细胞(NSC)的可行性。方法向培养基添加碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及其他生长因子，采用单细胞克隆技术，分离出生后1-3d和成年SD大鼠海马组织并分别无血清培养；以免疫细胞化学方法对原代和传代培养形成的克隆细胞，以及其分化后的细胞进行鉴定。结果上述条件下培养可形成悬浮生长的表达巢蛋白的神经球，且具有连续克隆的能力；分化后可得到具有网状联系的、分别呈神经元特异性烯醇化酶阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经元及胶质细胞。结论新生及成年SD大鼠海马存在神经干细胞．     

神经干细胞的分离培养及其鉴定

目的：从成年大鼠纹状体区和胎鼠皮层分离并鉴定神经干细胞。方法：利用无血甭培养和单细胞克隆技术在成年大鼠纹状体区和胎鼠皮层分离具有单细胞克隆能力的细胞群,选取单个克隆进行连续传代培养获得大量亚克隆,采用免疫荧光细胞化学技术检测克隆细胞Ｎｅｓｔｉｎ抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果：从纹状体区和皮层分离的细胞群具有连续克隆能力,胚胎早期细胞抗原－Ｎｅｓｔｉｎ抗原阳性,分化后的细胞表达神经元     

C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定

目的体外分离、培养神经干细胞（NSCs）,并对其进行鉴定。方法采用手动法及胰蛋白酶消化法分离胎鼠脑细胞,用优化的无血清NSCs培养基进行培养。细胞免疫荧光法检测NSCs特异性标记分子的表达。结果分离的脑细胞体外培养48 h已大部分贴壁,3 d左右获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团。第3代时,很少见到贴壁细胞,几乎全是神经球,神经球周围存在较多微刺。细胞表达一种中间丝蛋白,即巢蛋白（nestin）。结论成功分离、鉴定出C57小鼠NSCs,并可在体外条件下进行传代扩增培养。     

大鼠背根神经节源干细胞分离培养和鉴定

目的：探讨大鼠背根节（DRG）内是否存在神经干细胞。方法：取胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行P75BrdU/Nestin,GFAP,NF200免疫荧光组织化学鉴定。结果：细胞培养获得大量能够分裂增殖且呈巢状悬浮生长的干细胞团,呈P75BrdU/Nestin免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清10d后,相差显微镜下可见部分细胞伸出多个细长突起,且免疫组化呈NF200阳性;部分细胞具有扁平多突起的或双极细胞形态,免疫组化呈GFAP染色阳性。细胞球经NGF培养诱导1d左右有些神经元样的细胞开始迁出,随着时间增长迁出的细胞越来越多,并且细胞和细胞之间发生联系,形成交错的复杂网络,迁出的细胞经免疫组化鉴定几乎都是呈NF200免疫染色阳性。结论：大鼠DRG内存在有神经干细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索大鼠胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法:从孕14 d SD胎鼠前脑组织分离神经干细胞,用DMEM/F12无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进行体外扩增、培养和传代.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养,经nestin染色鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的建立胎鼠神经干细胞体外培养方法并鉴定神经干细胞,观察神经干细胞生长特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的无血清培养基对大鼠胚胎间脑组织细胞悬液进行培养。通过检测神经干细胞的特异性抗原、神经干细胞的自我增殖能力和分化能力来鉴定神经干细胞。结果分离培养出了大量具有不断增殖的能力、表达神经巢蛋白的神经干细胞,并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞,并能稳定传代20代以上。结论无血清培养基分离培养的胎鼠脑组织神经干细胞具有自我更新和增殖能力,巢蛋白细胞免疫荧光鉴定为神经干细胞,成功建立了大鼠神经干细胞的分离培养方法。     

胚胎大鼠海马源性神经干细胞的分离、培养、分化和鉴定

目的:探讨胚胎大鼠海马源性神经干细胞(N SC)的分离、培养、分化和鉴定的方法。方法:机械分离出胚胎大鼠海马区细胞,以无血清培养基培养,再以血清培养基诱导其分化;在显微镜下观察其形态学特征,逆转录PCR(RT-PCR)和免疫荧光化学法检测神经干细胞和其诱导后细胞的表面标志物。结果:无血清培养基条件下培养的细胞在光镜下可见呈悬浮生长,易聚集成神经球,RT-PCR和免疫荧光化学法可检测到N SC表面标志物N estin的表达;经血清培养基诱导分化后,光镜下可见细胞呈贴壁生长,可见胞体呈树突状突起或呈梭形,RT-PCR和免疫荧光化学法可检测到星形胶质细胞的表面标志物GFAP和神经元细胞的表面标志物N SE的表达。结论:胚胎大鼠海马区分离的细胞具有N SC的特性,并能在含特定生长因子的无血清培养基保持其分化潜能,为进一步针对N SC的研究奠定了基础。