抗CD71人-鼠嵌合抗体的体外抗肿瘤效应研究

目的 对抗CD71人-鼠嵌合抗体体外抗肿瘤效应进行研究。方法 以表达CD71分子的3种人类肿瘤细胞（K562，CEM和SMMC-7721）为靶细胞，以正常人外周血单个核细胞（PBMC）为效应细胞，在效/靶细胞比为50：1的条件下，测定嵌合抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC）；以CEM和SMMC-7721为靶细胞，在有新鲜补体存在下，测定嵌合抗体的补体依赖性细胞毒效应（CDC）。结果 抗CD71人-鼠嵌合抗体（D2C）能够通过识别CD71分子，并通过人抗体Fe段介导ADCC。在有新鲜补体存在下，介导CDC。结论 抗CD71人-鼠嵌合抗体对CD71^ 肿瘤细胞可介导ADCC和CDC。     

抗乳腺癌人鼠嵌合抗体的构建

目的：构建抗人乳腺癌单克隆抗体人鼠嵌合抗体，降低鼠源性抗体应用于人体的免疫排斥反应。方法：采用RT－PCR技术，从分泌抗人乳腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株CDI315B分离克隆抗体轻重链可变区基因，对其进行序列分析，将连接组建人鼠嵌合轻链和人鼠嵌合重链，然后分别将它们克隆到真核细胞表达载体pcDNA3。结果：构建的人鼠嵌合抗体基因克隆在真核细胞表达载体上。结论：人鼠嵌合抗体的构建为它的表达和临床应用打下基础。     

抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达

目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株（克隆号：2F5）中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5。转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养。采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况。结果抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合。结论抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础。     

抗HBsAg鼠/人嵌合抗体基因的构建、表达及鉴定

用抗体工程法构建抗乙肝表面抗原(HBsAg)鼠/人嵌合抗体的嵌合基因,并在哺乳动物细胞中成功地表达。分离鼠McAb 2H1(抗HBsAg)轻、重链可变区基因,并连接到含有人轻链(Kappa)及重链(Gamma 1)恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中;用电穿孔法将嵌合基因导入小鼠SP2/0细胞,得到高效表达。2H1嵌合抗体能特异性地与HBsAg结合,并能有效地与亲代McAb竞争;与血源性多克隆乙肝免疫球蛋白(HBIG)比较,其具有特异性好、节约血源、价廉、质纯、无其他病毒,如HIV等污染制品的可能等优点,可用于阻断乙肝母婴传播及在意外感染时被动免疫。     

细胞融合法制备抗人CD3—抗人IgMμ链双特异性抗体

目的 制备抗入CD3－抗人IgMμ链双特异性抗体（Bispecific antibody,BsAb)的细胞株,并对建株的杂交－杂交瘤的稳定性及活性进行鉴定。方法 将抗入CD3单克隆抗体细胞株采用8－AG诱变成HAT敏感杂交瘤细胞株,再通过FuGENE^TM6转染含neo基因质粒pCDaA3,制备成具有双标记杂交瘤αCD3 HAT^S G418^R亚系,与抗人IgMμ链单克隆抗体细胞株融合,通过ELISA法及流式细胞仪筛选,制备分泌BsAb的细胞株。结果 融合6次,共接种1080孔,共得5株抗CD3－抗IgM杂交－杂交瘤。经亚克隆后,其中2株体外连续传代培养2月仍保持良好的分泌BsAb功能。结论 采取细胞融合法可成功制备分泌BsAb的杂交－杂交瘤,其稳定性及效价与亲本杂交瘤相似。     

NBS法标记CEA人鼠嵌合抗体rch24的初步研究

目的:研究125I直接标记CEA人鼠嵌合抗体rch24的方法。方法:采用NBS(溴代琥珀酰亚胺)法进行碘标,并测定标记物的放射化学纯度、标记率和体外稳定性。结果:采用纸层析法测定的标记率和放射化学纯度分别为97.2%±0.4%和95.5%±0.2%;标记抗体体外4℃存放,放射化学纯度逐渐下降,14天后降为92.6%,35天后为89.3%。结论:标记物具有较高的放射化学纯度及稳定性,为体内治疗打下良好的基础。     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的 构建抗CD44抗体的单链抗体（anti-CD44-ScFv），为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法 从分泌抗CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系HII44a中提取总RNA，经RT-PCR分离获得了轻、重链可变区（VL、VH）基因，用连接肽将其构建成具有VL-Linker-VH结构的单链抗体基因，并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体PEV22b（＋）中进行表达。结果 经测序表明，VH、VL及Linker的序列正确。ScFv在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16％。能够特异性与CD44抗原结合。结论 成功构建抗CD44抗体单链抗体，为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。     

抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的制备及其对抗原决定簇特异性的研究

用杂交瘤技术建立三株分泌抗甲状腺球蛋白(TG)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所获三种单克隆抗体经兔抗小鼠IgG亚类、IgM及IgA血清鉴定表明,两种为IgG_1,一种为IgA;三种含单克隆抗体小鼠腹水的滴度(ELISA法)均为51200以上;以竞争性固相抗体结合试验测定它们对抗原决定簇的特异性差异,结果发现三种单克隆抗体的抗原结合部位是不同的,但对抗原的结合有一定的相互竞争抑制现象。     

抗人p185erbB2人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建表达及活性测定

目的:HER2/neu过度表达见于多种恶性肿瘤.作为肿瘤抗原,p185erbB2是一个理想的肿瘤治疗靶点.本实验在既往工作基础上,构建嵌合型抗p185erB2单克隆抗体(单抗)的真核表达载体,并在CHO-dhfr-细胞中表达,从而降低鼠源性抗体的免疫原性,为进一步的应用研究奠定基础.方法:RT-PCR扩增p185erbB2单抗1-2的轻、重链可变区基因,插入嵌合抗体真核表达载体pWSD2中,脂质体转染CHO-dhfr-细胞.经RT-PCR、间接ELISA、Western blot检测人-鼠嵌合抗体的表达水平,用ELISA、免疫沉淀方法对嵌合抗体的亲和力和特异性进行初步鉴定.此外,采用MTT比色法检测嵌合抗体对高表达p185erbB2的乳腺癌细胞系SKBR3的生长抑制作用.结果:用RT-PCR、间接ELISA、Western blot方法证明人-鼠嵌合抗体在CHO-dhfr-细胞中表达;ELISA检测提示嵌合抗体与高表达p185erbB2的细胞反应阳性,与低表达p185erbB2的细胞反应阴性;免疫沉淀结果表明嵌合抗体可与p185erbB2分子特异性结合;MTT比色法检测表明嵌合抗体对过表达p185erbB2的乳腺癌细胞SKBR3的生长有抑制作用.结论:CHO-dhfr-细胞表达的人-鼠嵌合抗体可与p185erbB2特异性结合,并可抑制高表达p185erbB2的肿瘤细胞生长,表明抗人p185erbB2人-鼠嵌合抗体具有肿瘤生物治疗的潜在应用价值.     

Anti-proliferative effects induced by anti-CD4 human/murine chimeric antibody and murine anti-CD4 monoclonal antibody

Summary The effects of chimeric anti-CD4 human/murine chimeric antibody and murine anti-CD4 monoclonal antibody (McAb) on the proliferation induced by anti-CD3 McAb, phytohemagglutinin (PHA), IL-2, and allogeneic cells were studied. The results showed that chimeric anti-CD4 antibody and murine anti-CD4 McAb could inhibit the proliferation induced by the above inducers and the inhibitory effects were related to the dosage of the antibodies. This project was supported by a grant from the National Sciences Foundation of China (Serial No. 39370628).     

抗人CD4D1D2结构域多克隆抗体对HIV-1的抑制作用

目的研究抗人CD4DID2结构域多克隆抗体对HIV-1的抑制作用。方法经overlappingPCR构建人鼠嵌合型CD4质粒pcDNA3．1-mhD1D2m和pcDNA3．1-mhD2m，利用pcDNA3．1／V5-His—TOPO质粒载体的通用引物双向测序，测序结果用vectorNTI8．0软件与预期序列作比对，并通过假病毒感染实验检测其介导病毒感染能力，实验数据采用SPSS11．5统计学软件进行χ^2检验。pcDNA3．1-mhDID2m和pcD—NA3．1-mhD2m经DNA免疫BALB／c小鼠，所获多抗血清经假病毒中和实验检测其抗HIV-1中和能力，经FACS检测其与CD4抗原结合能力。结果所构建人鼠嵌合型CD4质粒pcDNA3．1-mhD1D2m能够介导HIV-1假病毒感染。质粒pcDNA3．1-mhD1D2m免疫小鼠8周后所获得的多抗血清稀释100倍后，对HIV-1毒株抑制率为76％～95％。质粒pcDNA3．1-mhD2m免疫小鼠所获得的多抗血清则无明显的中和作用。FACS检测显示mhD1D2m多抗血清与TZM-b1细胞表面的CD4可以特异性结合。结论抗人CD4D1D2结构域多克隆抗体对H1V-1具有较强的抑制作用，为AIDS治疗和疫苗研发提供实验依据。     

重组人内抑素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗重组人内抑素(ES)单克隆抗体(McAb)并进行鉴定。方法利用重组人ES为抗原,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,间接ELISA法对细胞培养上清进行筛检,对能稳定分泌抗重组人ES的细胞株,进行扩大培养。体内诱生法制备腹水并对其初步鉴定。结果获得3B4、1D10、1G5、2D10,4株能稳定分泌抗重组人ESMcAb的杂交瘤细胞株,并对3B4和1D10两株给予鉴定,其免疫亚型为IgG2a、IgG3。腹水ELISA效价为10-6、10-5。通过蛋白免疫印迹法和免疫组化证明抗体有特异性和敏感性。结论成功制备分泌抗重组人ES的杂交瘤细胞株,为研究人ES的表达及相关领域奠定了基础。     

人源特异性抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体的制备及鉴定

目的:利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体?方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体?应用SDS-PAGE?Western blot?ELISA?免疫共沉淀?亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性?结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg?结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用?     

长春新碱载药红细胞制备及其生物学特性研究

目的:探讨红细胞作为长春新碱(vincristine, VCR)载体的可行性及其载药参数和生物学特性,为其应用提供实验依据.方法:改良低渗预膨胀法制备VCR载体红细胞,高效液相色谱法分析载体红细胞内、外液VCR含量,自动血液分析仪测定红细胞生理指标,考察红细胞VCR载药量、载药率和载体细胞回收率等参数.采用4℃保存定时提取上清液比较VCR含量并观测上清液溶血情况、渗透脆性检测,以显微镜观察等方法考察载体红细胞的载药释放、贮存稳定、渗透脆性和形态等生物学特性.结果:预膨胀红细胞与VCR的0.6%盐水溶液作用后,单位数量(1×109/ml)红细胞载药量最高,达49.59 μg;预膨胀红细胞与上述VCR溶液作用20 min后载药达到稳定;VCR浓度在50～2 000 μg/ml范围内时,单位数量红细胞的载药量(y, μg)可按y=0.098 2 x-2.465 8计算,线性相关系数r =0.996 1.红细胞总载药率为(61.42±3.69)%,载体红细胞回收率为(90.61±4.95)%.载体红细胞渗透脆性减低,形态无明显变化,体积略有增大与载药量成正比(r =0.988 0),药物释放缓慢,4 h连续释放率(11.35±1.65)%,可稳定贮存5 d.结论:红细胞可作为VCR载药,载药参数良好,生物学特性无明显改变.     

人羊水干细胞分离方法及其生物学特性研究

目的建立体外培养人羊水来源CD117阳性干细胞的方法,初步探讨CD117阳性干细胞的特性。方法通过孕中期羊膜腔穿刺获得86例羊水标本。采用CD117磁珠分选表达CD117抗原的羊水干细胞。对经过反复冻存的CD117阳性干细胞进行核型分析。分别经成脂诱导和成骨诱导分化,再分别使用油红O染色、茜素红染色。结果从61例标本中成功分离培养出CD117阳性细胞,经核型分析显示其染色体核型正常。CD117阳性细胞经成骨和成脂诱导后,茜素红和油红O染色阳性,说明可以向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论基于本研究,孕中期羊水CD117阳性细胞的分选成功率为70.93%。CD117阳性细胞在体外培养中保持形态和遗传学的稳定。在特殊培养条件下,人源羊水CD117阳性干细胞在体外,可以诱导分化成为脂肪细胞和成骨细胞,可能应用于细胞移植和再生医学。     

Expression of Anti-CD4 Human/Murine Chimeric Antibody and Their Killer Tumor Activity

MonoclonalantibodiesagainstCD4molecule(anti-CD4McAb)ofhumanTlymphocyteshavebeensuccessfullyusedforthetreatmentofautoimmunediseasesandpreventionoforgantransplantationrejectioninhuman[1'Zj.However,murinemonoclonalantibodies(Ahs)haveimmunogenicityonhumanandproduceneutralizinghumananti-mouseantibodies(HAMA).ToreducetheimmunogenicityofmurineMcAbinhuman,chimericAhshavebeenproduced,inwhichtheVregionsofthemouseantibodywiththedesiredspecificityarecombinedwithhumanCregions["4j.Inthisstudy,anti-C…     

小鼠乳腺癌细胞系高肺转移亚系（Ca761－P93）的筛选及其生物学特性

本文在原有工作的基础上，对具有血道与淋巴道双向转移特性的小鼠乳腺癌Ｃａ７６１－８６细胞系进行了高转移潜能癌细胞亚系的筛选，使其自发肺转移率由未筛选时的２０％稳定地提高到１００％，定名为Ｃａ７６１－Ｐ９３，并对其生物学特性进行了研究，为肿瘤血道转移的实验研究提供了一个较好的高肺转移模型。