人骨髓间质干细胞的培养及成骨功能研究

目的　体外扩增人骨髓间质干细胞 (humanbonemarrow derivedmesonchymalstemcells,hBMMSCs) ,研究其生物学特征及体内、外成骨功能。方法　分离培养hBMMSCs,并对其形态、增殖动力学、碱性磷酸酶 (alkalinephosphatase,ALP)表达及体内、外成骨功能进行研究。结果　hBMMSCs可在体外培养扩增 ,群体倍增时间约为 3 5d。ALP检测表明 ,未经矿化诱导的hBMMSCs可表达少量ALP ,诱导后其表达量明显增高。vonkossa染色证实在矿化诱导液作用下hBMMSCs在体外可形成钙结节。体内成骨实验证实 ,1× 10 5个hBMMSCs接种到 30mm3 块状HA/TCP载体移植BALB/C裸小鼠皮下 3个月 ,可观察到层板状骨组织生成。结论　hBMMSCs是一种具有成骨潜能的前体细胞 ,经培养、扩增、诱导后 ,在体外可形成矿化结节 ,体内可在载体表面形成骨组织。     

兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞生物学行为及其体内成骨的研究

目的:探讨兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外分离、培养及其生物学行为,评价下颌骨BMMSCs体内成骨的效果。方法:取兔下颌骨中的松质骨,贴壁培养,取第P2或P3代检测:1)倒置显微镜下观察细胞生长状态;2)MTT法测定细胞增殖并绘制细胞生长曲线;3)向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化;4)将P3代BMMSCs与羟基磷灰石/磷酸三钙(Hydroxyapatite/tricalcium phosphate,HA/TCP)复合,自体回植;单纯HA/TCP植入做对照。术后8周和20周,通过组织学观察评价体内成骨的效果。结果:1)细胞经传代后形态一致;2)细胞生长曲线显示下颌骨BMMSCs经历潜伏期、对数生长期和平台期;3)成骨诱导、成脂诱导后形成钙结节及脂滴,茜素红、油红O染色呈阳性;4)体内成骨显示术后8周BMMSCs-HA/TCP组空隙内新骨形成;术后20周大量新骨形成,HA/TCP大部已降解。单纯HA/TCP植入组术后8周未见新骨形成;20周大部HA/TCP降解,仍未见新骨形成。结论:兔下颌骨分离出的BMMSCs,具有强大的自我复制、增殖能力及多向诱导分化的潜能,并能体内成骨。     

兔成骨细胞体外培养及自体肌内成骨的实验研究

目的 :建立一种体外培养兔成骨细胞的生物学模型 ,并对其生物学特性及体内成骨能力进行研究。方法 :抽取日本大耳白兔骨髓液经离心后得骨髓单个核细胞 ,以1×106/ml的细胞浓度进行培养 ,经传代培养 ,通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜、透射电镜、碱磷酸酶 (alkalinephosphatase,ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和VonKossa钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性研究。然后将细胞与载体材料—膨体聚四氟乙烯(ePTFe)复合培养1周后回植自体兔肌肉内 ,4周、8周后分别取材 ,组织学方法观察其成骨能力。结果 :培养的细胞形态多样 ,呈集落样生长 ,可相互重叠成复层状 ,胞浆富含线粒体、粗面内质网和高尔基体 ,胞浆突起长短、粗细不等 ,互相连接。培养细胞富含ALP活性Ⅰ型胶原和VonKossa染色均阳性。这与典型成骨细胞的生物学特性相似。成骨细胞经体外增殖 ,与载体复合培养后生长良好。植入体内早期(4周时 )形成的骨基质结构疏松 ,周围仍有较多成骨细胞 ,晚期 (8周时 )则可见形成的骨样组织结构致密 ,内有骨细胞位于骨陷窝中 ,与典型的骨组织结构相似。结论 :用兔骨髓基质细胞在体外筛选、培养成骨细胞的方法是可行的     

腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染肌卫星细胞诱导成骨的动物实验研究

目的观察腺病毒介导的BMP- 2基因转染肌卫星细胞后体内骨诱导能力。方法采用动物实验方法,将转染BMP- 2基因的绿色荧光蛋白（GFP）转基因鼠肌卫星细胞吸收到胶原支架上,然后将细胞胶原支架复合物移植入野生型129sv小鼠的后小腿肌肉中,应用X线片观察、组织学检查及荧光显微镜观察转染细胞的诱导成骨能力。结果用BMP- 2基因转染的肌卫星细胞复合胶原支架移植入野生型小鼠后小腿筋膜下肌肉后会产生异位骨形成,移植2周后其中有GFP阳性的成骨细胞和骨细胞,3周后形成良好的骨组织,4周时已形成成熟的骨组织,而且骨组织具有GFP荧光。对照组用胶原支架和未转染的肌卫星细胞移植,未出现诱导性异位骨形成。结论Ad- BMP2转染的肌卫星细胞以胶原为支架可以在肌肉内诱导骨组织形成。     

重组腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP转染的Beagle犬牙周膜细胞成骨能力研究

目的    观察重组腺病毒载体 Ad5-hOPG-EGFP 转染 的Beagle 犬牙周膜细胞（ PDLCs）体内和体外的骨化能力。方法    将体外构建的携带人骨保护素（human osteoprotegerin,hOPG）基因的腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP转染Beagle犬PDLCs,通过体外Von Kossa染色实验、实时荧光定量PCR检测成骨指标的表达情况、酶联免疫检测RANKL/OPG的值及裸鼠体内胶原膜成骨实验比较转染组和对照组的成骨能力。结果    组织学和形态学结果显示,转染了重组腺病毒Ad5-hOPG-EGFP的Beagle犬PDLCs形成的矿化结节数目多且体积大、深染。转染组中犬碱性磷酸酶（alkaline phosphates,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OC）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）基因相对表达水平均高于空载体组和空白对照组（P＜0.05）。转染组中犬RANKL/OPG的值下降趋势最为明显。裸鼠体内实验中转染组胶原膜也体现出较好的成骨能力。结论    重组腺病毒介导的hOPG基因可以促进PDLCs成骨。     

犬骨髓基质细胞和β-磷酸三钙复合物在裸鼠体内的成骨性能

目的：观察犬骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）和支架材料β-磷酸三钙（β-TCP）复合物植入裸鼠体内的成骨情况。方法：首先在体外构建BMSCs和β-TCP的复合物，大小3mm^3左右。实验分为3组：裸鼠体内植入单纯β-TCP，植入未经体外培养的BMSCs和β-TCP复合体，植入体外培养5d的BMSCs和β-TCP复合体。植入后1周、1个月和3个月取出标本，进行大体观察、X线片观察、灰度测定、组织学观察及成骨图像分析。结果：植入后3个月，BMSCs＋B-TCP体外培养组X线片密度最高，DigiDens X线片灰度值3组分别为：0．605〉0．555〉0．473（P〈0．01）。HE染色显示：1个月后，BMSCs＋β-TCP体外培养组见新骨和血管形成；3个月后，BMSCs＋β-TCP体外培养组新骨形成明显，并有大量血管生成．BMSCs＋β-TCP体外未培养组少量成骨，单纯β-TCP组未见明显成骨。成骨罔像分析3组成骨密度均数分别为：23．99％、8．36％、1．23％（P〈0．05）。结论：BMSCs＋β-TCP复合物植入裸鼠体内4周出现新骨形成．3个月时．骨形成明显并有血管化生成。     

实验犬磨牙根分叉骨缺损应用组织工程骨修复的效果分析

目的观察以组织工程方法修复大面积根分叉骨缺损的效果。方法以成骨条件培养液培养实验犬骨髓基质细胞(BMSCs)至第3代并以1×106/cm2的密度与猪的脱矿冻干骨(fdDBM)复合培养后回植于犬磨牙根分叉骨缺损区(2.0cm×1.0cm×0.8cm)。术后3个月与6个月取实验开窗区骨制作组织切片或2mm厚的骨磨片,观察新生骨组织形态及骨钙素与Ⅰ型胶原表达情况并作骨磨片的骨密度分析。所得数据用SAS6.12软件作t检验。结果6个月及3个月实验侧骨缺损完全修复。骨切片显示实验侧开窗区新生骨与正常骨无明显区别且Ⅰ型胶原和骨钙素表达亦同正常。X线骨密度数据显示回植后6个月实验组的骨密度高于对照组及回植3个月者。结论以组织工程骨修复大面积根分叉骨缺损是可行的。     

珊瑚复合人骨髓基质细胞构建组织工程骨

目的：观察人骨髓基质细胞在角孔珊瑚上立体培养后的生长情况及其在体内的成骨能力。方法：穿刺抽吸人髂骨区骨髓基质细胞，体外培养扩增、诱导后，接种于角孔珊瑚中立体培养5d，观察细胞在角孔珊瑚表面的贴附及伸展情况；将上述细胞/角孔珊瑚复合物植入体内，观察植入物在体内的成骨情况。结果：细胞可在角孔珊瑚中立体培养成活。体内植入后4周，复合物中有少量新骨形成；体内植入后8周，复合物中出现大量较成熟骨组织；而对照组4、8周均无骨组织形成。结论：穿刺抽吸的人骨髓基质细胞可作为骨组织工程的种子细胞，角孔珊瑚可作为骨组织工程的支架材料。     

兔骨髓基质干细胞自体嚼肌内移植异位成骨实验研究

目的：观察骨髓基质干细胞成骨向分化诱导后植入嚼肌内异位成骨的过程。方法：从兔髂骨分离骨髓基质干细胞,经体外诱导分化,与磷酸三钙／羟基磷灰石（tricalcium phosphate／hydroxyapatite,TCP／HA）支架复合,植入兔自体嚼肌内,形态学、免疫细胞化学、组织学观察其成骨特征。结果：体外培养的兔骨髓基质干细胞性状稳定,经矿化诱导培养的骨髓基质干细胞表现为成骨细胞分化,表达Ⅰ型胶原蛋白,与支架材料复合植入自体嚼肌内可见成熟骨组织形成。结论：利用骨髓基质干细胞为种子细胞植入嚼肌内开展功能性组织工程化颌骨移植方法可行。     

人成骨样细胞在糖交联胶原支架材料中的黏附和整合素表达

目的探讨人成骨样细胞在糖交联胶原支架材料中的黏附和整合素表达。方法将SAOS-2细胞接种于糖交联胶原支架表面,共培养3周后,采用扫描电子显微镜观测材料表面细胞形态,通过细胞示踪、整合素(Integrin-β1)免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观测细胞活性和在材料表面的黏附。结果人成骨样SAOS-2细胞可在糖交联胶原支架材料表面黏附,形成细胞膜片样结构,并表达细胞黏附因子Integrinβ1。结论糖交联胶原支架材料表现出良好的生物相容性,可在体外促进人成骨样SAOS-2细胞的黏附,并诱导整合素Integrinβ1表达,进一步调控细胞向成骨方向分化。     

Matrix metalloproteinase-7, -8, -9, -25, and -26 and CD43, -45, and -68 cell-markers in HIV-infected patients'' saliva and gingival tissue

BACKGROUND: Matrix metalloproteinases (MMPs) process the extracellular matrix and act in tissue remodelling in many physiological and pathological conditions. Certain MMPs can also exert protective anti-inflammatory properties. The levels and expression of MMPs and tissue inhibitors of MMPs (TIMPs) in saliva and gingival tissues of human immunodeficiency virus-seropositive (HIV+) patients are unclear. METHODS: Enzyme-linked immunosorbent assay methods and Western blots were used to study levels and molecular forms of MMP-7, -8, -9, -25, and -26 and TIMP-1 from salivary samples of HIV+ patients (n = 55) and healthy controls (n = 10). The expression of MMPs was also studied by immunohistochemical means in gingival tissue specimens (n = 11, HIV+ patients; n = 10, healthy controls). RESULTS: The HIV+ patients' MMP-8 levels in saliva were statistically significantly higher only in the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)-phase. MMP-9 levels in ASX- and AIDS-phases showed increased expression. TIMP-1 levels were significantly decreased in lymphadenopathy syndrome (LAS)- and AIDS-related complex (ARC)-phases, while MMP-8/TIMP-1 and MMP-9/TIMP-1 molar ratios were increased in all phases in comparison with controls. The molecular forms of MMP-7, -25, and -26 were different between patients and controls as assessed by Western blot. Immunohistochemical studies showed slightly enhanced MMP-7, -8, -9, -25, and -26 staining in HIV+ gingival tissue samples in comparison with controls. CONCLUSIONS: This study confirmed and further demonstrated differences in salivary amounts and molecular forms of MMPs and TIMP-1 in HIV+ patients. The results may reflect alterations in host defence reactions associated with HIV infection.     

Matrix metalloproteinase -2, -8, -9, and -13 in gingival crevicular fluid of short root anomaly patients

The aim of the present observational study was to identify and characterize matrix metalloproteinase (MMP) -2, -8, -9, and -13 in gingival crevicular fluid (GCF) of patients with short root anomaly (SRA). GCF samples collected from affected maxillary central incisors and premolars of five SRA patients and five systemically and periodontally healthy controls were analysed using the zymographic technique for gelatinase A and B (MMP-2 and -9) and by Western blot for collagenase -2 and -3 (MMP-8 and -13). SRA GCF revealed MMP-9 (30 per cent of the total gelatinolytic activity), of which 18 per cent was in 90 kDa proform and 12 per cent in 71-82 kDa active form. Moreover, high-molecular weight complexes (37 per cent) and low-molecular size fragmented (33 per cent) gelatinolytic enzymes were detectable. No MMP-8 or -13 immunoreactivities existed. These results may suggest that activation and complex formation of MMP-9 is characteristic of SRA GCF. From the findings it may be assumed that the GCF of SRA teeth has low collagenolytic resorptive or pathological activity.     

骨形态发生蛋白-2、-4、-6、-7和-9差异性介导永生化成牙本质细胞成骨分化

目的 研究永生化成牙本质细胞（immortalized odontoblasts,iODs）的间充质干细胞表型和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）-2、-4、-6、-7和-9差异介导iODs成骨分化的作用。方法 使用SV40 T抗原永生化成牙本质细胞（odontoblasts）,建立iOD细胞株,并连续检测BMP的内源性表达。使用Ad-Easy技术合成表达BMP和GFP的重组腺病毒,使用MTT试剂盒检测iOD的增殖能力。通过免疫荧光检测iOD的间充质干细胞表面标志物。在体外,使用半定量RT-PCR、碱性磷酸酶活性、茜素红染色及油红O染色检测iOD的成骨和成脂分化能力。最后,使用micro-CT和组织学分析评估体内形成的异位矿化组织的体积和密度。采用SPSS 21.0软件包中的单因素方差分析和Scheffe的多重比较检验对结果进行分析。结果 SV40 T抗原有效地永生化OD。iOD细胞株保持良好的增殖活性,表达间充质干细胞表面标志物并具有多向分化能力。相比BMP-4、-6和-7,BMP-2和BMP-9具有更强的介导iOD的成骨分化作用。结论 ODs和成骨生长因子（如BMP-2和BMP-9）可用作骨组织生物工程的有效策略。