内毒素结合肽表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

应用PCR技术,从含人NH@LBP cDNA的质粒中扩增出93bp的内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)基因片段,插入原核融合蛋白表达质粒Pinpoint Xa3的多克隆位点构建成表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组子Pinpoint Xa3-EBP并进行酶切鉴定及序列分析.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,经SDS-PAGE及Westen blot鉴定得到分子量约为16.5kD的生物素化EBP融合蛋白,为进一步研究其内毒素拮抗效应打下良好基础,并为内毒素结合肽的研究提供了一条新的途径.     

髓样分化蛋白-2在内毒素激活内皮细胞核因子-kB中的作用

目的 探讨髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2，MD-2)在内毒素(LPS)对内皮细胞核因子-κB(NF-κB)激活中的作用。方法 以ECV304细胞为模型，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测内皮细胞MD-2mRNA的表达；转染MD-2功能突变体，观察MD-2在内毒素对内皮细胞NF-κB激活和内皮细胞分泌IL-8中的作用。结果 内皮细胞有MD-2mRNA的表达，转染MD-2的突变体能明显抑制内毒素对内皮细胞NF-κB的激活和内皮细胞IL-8的分泌。结论 MD-2在内毒素对内皮细胞NF-κB激活中发挥着不可缺少的作用，且在内毒素对内皮细胞激活／损伤效应中占有重要的地位。     

烫伤大鼠组织脂多糖结合蛋白mRNA表达的动态变化

目的探讨烫伤后不同组织脂多糖结合蛋白（ＬＢＰ）ｍＲＮＡ的动态表达及其与内毒素血症的关系。方法采用大鼠３５％体表面积Ⅲ度烫伤模型，实验动物随机分为正常对照组、烫伤组和多粘菌素Ｂ治疗组。血浆内毒素水平测定采用改良过氯酸预处理血浆、偶氮显色法鲎实验定量测定，组织ＬＢＰｍＲＮＡ含量采用ＲＴ－ＰＣＲ法。结果烫伤后门静脉及体循环内毒素水平均显著升高，８小时达峰值。给予多粘菌素Ｂ治疗可不同程度地降低血浆内毒素水平。正常组织可表达少量ＬＢＰ，烫伤后２小时不同组织ＬＢＰｍＲＮＡ表达较对照值有显著升高（Ｐ＜０．０５～０．０１），８小时达峰值，约为对照值的２～２．５倍，且一直持续至伤后２４小时。给予多粘菌素Ｂ抗内毒素治疗，可不同程度抑制肺、肠、肾组织ＬＢＰｍＲＮＡ的表达（Ｐ＜０．０５～０．０１）。相关分析显示，门静脉内毒素水平与肺组织ＬＢＰｍＲＮＡ呈显著正相关（ｒ＝０．４１２，Ｐ＜０．０５），但与肝、肠、肾组织无显著相关性。结论组织ＬＢＰｍＲＮＡ表达在烧伤后显著增多，肠源性内毒素血症可能是刺激组织ＬＢＰ基因表达的重要因素之一     

脂多糖结合蛋白对内毒素急性肺损伤大鼠肺巨噬细胞TLR4信号通路的影响

为研究脂多糖结合蛋白（LBP）对内毒素（LPS）急性肺损伤大鼠TLR4肺巨噬细胞信号通路的影响，探讨LBP对LPS炎症反应增敏作用的部分机制，运用RT-PCR和ELISA方法分别检测LBP对LPS刺激后大鼠肺巨噬细胞IL-1β、IL-18mRNA表达与TNF-α分泌量的作用，同时用RT-PCR与Western blot检测其TLR4mRNA与蛋白的表达水平。结果显示，LBP显著增加LPS刺激后大鼠肺巨噬细胞TNF-α的分泌和IL-1β、IL-18mRNA的表达，同时也增加TLR4的mRNA与蛋白表达水平，而LBP多抗能阻断上述作用。说明LBP可增强由TLR4介导的LPS信号跨膜转导功能，这可能是LBP对LPS起增敏作用的重要分子机制之一。     

髓样分化蛋白-2在内毒素激活内皮细胞核因子-кB中的作用

目的　探讨髓样分化蛋白 - 2 (myeloiddifferentiationprotein - 2 ,MD - 2 )在内毒素(LPS)对内皮细胞核因子 -кB(NF -кB)激活中的作用。　方法　以ECV30 4细胞为模型 ,逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)方法检测内皮细胞MD - 2mRNA的表达 ;转染MD - 2功能突变体 ,观察MD - 2在内毒素对内皮细胞NF -кB激活和内皮细胞分泌IL - 8中的作用。　结果　内皮细胞有MD - 2mRNA的表达 ,转染MD - 2的突变体能明显抑制内毒素对内皮细胞NF -кB的激活和内皮细胞IL - 8的分泌。　结论　MD - 2在内毒素对内皮细胞NF -κB激活中发挥着不可缺少的作用 ,且在内毒素对内皮细胞激活 /损伤效应中占有重要的地位。     

血清淀粉样蛋白的诊断价值

血清淀粉样蛋白(serum amyloid protein,SAA)是急相蛋白(acute phase protein,APP)的一种当机体受到外界因子损伤时．肝细胞内的APP基因转录合成急相蛋白SAA、C-反应蛋白(C-reaction protein,CRP)等,Funk-JL通过动物实验发现Parathroid hormonerelated protein(PTHrp)对此过程起诱导作用。APP的产生是机体系统肪御反应的一部分,它通过抑制受损组织和聚集的吞嗜细胞释放血管活性物质,蛋白分解酶,细胞毒因子及通过参与反馈作用机制阻止器官的超敏反应,和其他防御因子共同辅助组织器官实现自身穗定。     

创伤合并内毒素攻击时小鼠肝组织锌指蛋白A20 mRNA表达的初步研究

目的　研究创伤合并内毒素攻击时小鼠肝组织中锌指蛋白A2 0mRNA的表达规律。方法　选用健康昆明种小白鼠 95只 ,雌雄不拘 ,体重 18～ 2 4 g ,制作双侧股骨闭合性骨折创伤及创伤合并内毒素血症模型。随机分为正常对照组、单纯创伤组、单纯内毒素组和创伤内毒素组。以逆转录 -聚合酶链式反应 (RT -PCR)技术检测肝组织中锌指蛋白A2 0mRNA的表达 ,结果以A2 0mRNA与内参照GAPDHmRNA之总灰度比值表示。　结果　正常对照组A2 0mRNA呈现低量表达 ;单纯创伤组各时相点锌指蛋白A2 0mRNA均呈现低量表达 ,与正常对照组相比 ,差异无显著性意义 ;单纯注射内毒素后 0 .5h ,A2 0mRNA均较正常对照组升高明显 ,注射后 0 .5～ 2h为A2 0mRNA表达的高峰期 ,2h以后表达又有所下降 ,各时相点均高于单纯创伤组 ;而创伤内毒素组在注射内毒素后 0 .5h ,A2 0mRNA均较其他两组显著升高 ,注射后 0 .5～ 2h为A2 0mRNA表达的高峰期 ,注射后 2h显著高于单纯内毒素组 (P <0 .0 5 ) ,至 4 ,7,10h时表达逐渐下降 ,但仍高于单纯创伤组。　结论　锌指蛋白A2 0作为一种参与体内炎症反应调控的内源性蛋白 ,在创伤合并内毒素攻击的早期即可呈现出高表达。说明创伤合并内毒素攻击情况下 ,A2 0表达增加是机体的一种重要的内源性抗炎保护效应机制 ,     

丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白1基因的克隆化与序列分析

目的 对命名为F蛋白结合蛋白1(FBP1)的未知基因,克隆其全长基因并进行生物信息学分析.方法 应用酵母双杂交技术得到FBP1,应用分子生物学技术克隆FBP1的基因编码序列.结果 经酶切和测序鉴定,结果完全正确,成功克隆了FBP1的基因编码序.结论 FBP1通过与F蛋白结合,在病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用过程中发挥重要作用.     

运动与骨骼肌脂肪酸转运膜蛋白研究进展

与脂肪酸转运和氧化相关的脂肪酸转运膜蛋白主要包括两类——脂肪酸结合蛋白(fattyacid binding protein,FABP)和脂肪酸转运蛋白(fatty acid transport protein,FATP)。近年来对其进行了很多研究,FABP中关于脂肪酸转位酶(fatty translocase/cluster of differentiation 36,FAT/CD36)的研究较多,FAT/CD36与膜脂肪酸结合蛋白(plasma membrane fatty acid binding protein,FABPpm)均可通过腺苷酸一磷酸激活蛋白激酶(adenine monophosphate protein kinase,AMPK)和肌肉收缩激活从而引起转位,而FATP中研究得较多的主要是FATP-1和FATP-4,二者与运动以及骨骼肌脂肪酸转运均密切相关。     

抗磷脂酰乙醇胺结合蛋白反义核酸的设计与筛选

目的:设计与筛选能有效下调磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)表达量的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynuclecotide,ASODN).方法:应用Sfold、Mfold、RNAstructure等软件设计针对PEBP编码序列(CDS)的ASODN,并进行结构与能级评价;以PC12细胞为实验对象,应用RT-PCR和Western 印迹方法筛选可有效下调PEBP基因与蛋白表达量的ASODN.结果与结论:实验结果表明,使用200 nmol/L ASODN转染PC12细胞24 h可有效下调PEBP基因和蛋白表达;ASODN对PEBP蛋白表达量的下调作用可持续至48 h,蛋白表达可下调至细胞对照组的38.3%.     

慢性重型肝炎患者血中LPS、LBP和sCD14的水平及其临床意义

探讨LBP、sCD14水平在慢性重型肝炎(慢重肝)患者伴肠源性内毒素血症中的作用.应用基质显色法和ELISA双抗体夹心法,检测24例慢重肝患者血中LPS、LBP和sCD14的水平,并以10名献血员和16例慢性乙型肝炎患者作为对照.结果慢重肝患者在早期、中期、晚期,其血中LPS、LBP和sCD14的水平均明显高于慢乙肝患者及献血员;慢重肝死亡者其LPS、LBP和sCD14的水平也显著高于存活者.提示慢重肝患者伴肠源性内毒素血症时,血清中LBP和sCD14的水平,可显著提高机体对内毒素的敏感性.在内毒素浓度较低时,仍可诱导Kupffer细胞释放TNF-α,从而加剧肝细胞损伤.     

脾切除对内毒素诱发大鼠急性肺损伤的影响及机制

目的：探讨脾切除对内毒素血症诱发急性肺损伤的影响及其增敏机制。方法：将雄性Wistar大鼠112只随机分为脾切除组（56只）和假手术对照组（56只）,前者采用大鼠切除合并低剂量内毒素（0．1mg/kg）攻击模型,分别于注射内毒素前,注射后10min和0．5,1．5,12,24h观察两组肺组织内毒素含量、脂多糖结合蛋白（LBP）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）mRNA表达、髓过氧化物酶（MPO）活性及形态学改变。结果：内毒素注射后10min肺组织内毒素水平迅速升高并达峰值,脾切除组的升高幅度更明显。,肺组织LBPmRNA表达明显增强,1．5h达峰值,脾切除组主射后1．5,4hLBPmRNA表达较有脾组分别升高31．7％和28．7％（P＜0．05）相关分析显示。LBPmRNA分别与TNF-αmRNA及MPO活性呈显著正相关（r值分别为0．6988、0．4417,P＜0．01）。形态学检查证实,脾切除大鼠肺组织炎症反应和细胞损害明显加重。结：脾切除可上调内毒素血症时肺脏LBP基因表达,LBP参与了急性肺损伤的病理过程。     

噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)前s1蛋白为靶蛋白,寻找其相应的结合蛋白。方法 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术克隆与前s1蛋白具有结合作用的蛋白序列,命名为前s1结合蛋白(PreS1BP)。将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列。结果 初步确定PreS1BP即为神经胶质瘤抑制基因区候选基因2(GLTSCR2),cDNA长为1436核苷酸,基因位于第19号染色体长臂13.3区(19q13.3),长度11445碱基对(bp),位于19号染色体10403483～10414989,PreS1BP基因含有13个外显子,具有12个内含子。结论 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术和生物信息学方法获得了HBV PreS1BP基因。     

Raf激酶抑制蛋白在食管鳞状细胞癌中的研究进展

Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitory protein,RKIP)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP)的家族成员之一,具有膜的生物合成、精子形成、神经发育等功能,并能抑制促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子kappa-B(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号转导通路,从而维持细胞正常增殖、分化以及凋亡.RKIP基因的下调或缺失可能导致这些通路的过度活跃以致细胞发生过度增殖及抗凋亡等现象[1-3].继Fu等[4]发现转移性前列腺癌患者的RKIP表达水平显著低于非转移性前列腺癌患者以来,陆续有大量研究证实在乳腺癌[5,6]、胃癌[7,8]、肝癌[9]、结直肠癌[10]、前列腺癌[11]、肾癌[12]、神经胶质瘤[13]、肺癌[14,15]、食管癌等[16]肿瘤患者中,RKIP基因表达水平均有不同程度的下调或缺失,表明RKIP可能对肿瘤转移起到一定的抑制作用.显然,RKIP已成为肿瘤学领域研究的一大热点.     

腹部大手术后杀菌/通透性增加蛋白的变化规律及意义

目的 观察外科大手术后内源性杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的变化规律及其临床意义.方法 选择拟行腹部大手术患者11例,分别于术前和术后1、3、5、7、14天采集血标本,测定外周血中性粒细胞数的变化,并采用ELISA方法测定血浆BPI、脂多糖结合蛋白(LBP)和IL-6水平,改良基质显色法鲎试验检测血浆内毒素含量.结果 正常对照组血浆中BPI/LBP比值为(0.672±0.083)×10-3,腹部大手术后第1天增高至(1.058±0.074)×10-3(P=0.004),第3天为(1.107±0.061)×10-3(P=0.001),第5天后降至正常范围(P＞0.05).11例患者术前血浆中均未检测到IL-6,腹部大手术后第1天血浆中IL-6水平迅速增高达峰值(27.440±12.144pg/ml,P=0.04),第3天仍处于较高水平(11.530±5.312pg/ml).结论 手术创伤后机体内源性BPI的增幅明显高于LBP,可能有助于控制大手术后内毒素血症的发生及发展.     

Treg-Th17荧光双标纯合子小鼠的培育及其在内毒素血症研究中的初步应用

目的 培育Treg - Th17荧光双标纯合子小鼠并探讨内毒素血症发生过程中Treg -Th17平衡的作用规律. 方法 从美国哈佛大学医学院引进Treg和Th17荧光单标小鼠,依照遗传学规则进行配对繁殖,提取子2代离乳仔鼠尾部组织DNA,通过PCR方法进行基因分型,选取荧光双标纯合子小鼠连续自交3代并检测其基因型和生活状态;制备该小鼠内毒素血症模型,流式细胞检测内毒素血症发生24 h和48 h Treg-Th17平衡的变化. 结果 第一批7只子2代小鼠中有3只小鼠(2♂1♀)为所需纯合子,自交3代连续基因分型结果均为Foxp3 RFPKI - homo -IL - 17A GFPKI,而且小鼠生长状态正常;内毒素重要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理能诱导明显的红色荧光蛋白(red fluorescence protein,RFP)和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)信号表达;LPS处理24h组总体淋巴细胞中CD8a+ Foxp3+、CD8a+IL- 17A+、CD4+Foxp3+和CD4+ IL - 17A+的数量百分比明显上升(P＜0.01或0.05),但对照组与LPS处理48 h组之间的差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 本实验培育的Foxp3 RFPKI - homo - IL - 17AGFPKI小鼠具有相同的基因表型和稳定的遗传学特征,是一种能够有效实时监测机体Treg - Th17平衡变化的模式动物和全新在体研究平台;Treg -Th17平衡作用在LPS刺激48 h内表现显著;CD8a+ Foxp3和CD8a+ IL - 17A+在Treg - Th17平衡中的作用值得进一步关注.     

无POU域八聚体结合蛋白基因的克隆及其在Hepa1-6细胞内的表达

目的构建小鼠无POU域八聚体结合蛋白(non-POU-domain-containing,octamer binding protein,NonO)真核表达载体并在小鼠Hepa 1-6肝癌细胞内表达,观察NonO胞内表达、定位及脂多糖(LPS)对其定位的影响。方法提取小鼠肝组织总RNA,RT-PCR扩增小鼠NonO基因的蛋白编码序列。采用基因重组技术将其亚克隆至pcDNA3-HA真核表达载体中,将该载体瞬时转染Hepa1-6细胞,通过细胞免疫荧光方法观察NonO的胞内表达及LPS对其定位的影响。结果酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;细胞免疫荧光可见NonO在Hepa 1-6细胞内表达、分布于细胞核,LPS刺激后NonO分布无明显变化。结论成功构建NonO真核表达载体,为研究NonO在基因表达调控中作用及其生物功能提供了重要载体。进一步证实NonO为定位于细胞核的核蛋白。     

G蛋白偶联受体与辐射关系的研究进展

G蛋白偶联受体(GPCR)是一类细胞表面受体大家族,通过G蛋白介导其细胞作用,在介导细胞间信号转导的过程中起着十分重要的作用。研究发现,G蛋白和GPCR与辐射损伤关系密切,这些研究为充分认识辐射损伤机制及提高防治水平提供了新的观点。     

视黄醇结合蛋白的分子机制及临床应用

视黄醇结合蛋白（retinol binding protein）是一类维生素A（VitA）的运载蛋白，参与血清和细胞内视黄醇／视黄酸的转运，是疏水小分子结合蛋白家族的成员。本文主要介绍了视黄醇结合蛋白的基因结构及表达，染色体定位，作用机制的研究进展，以及临床意义等。     

RAP结合肽-hFcγ1融合蛋白的表达与初步活性鉴定

目的：将肽库筛选到的正调控金黄色葡萄球菌(金葡菌)外毒素分泌的关键分子RAP(RNA Ⅲ activating protein)的结合肽与人IgG1抗体Fc片段(hFcγ1)融合表达，检测其干扰金葡茵外分泌毒素产生的活性。方法：根据噬茵体肽库筛选到的RAP结合肽序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子合成基因片段，将其融合在人IgGl抗体Fc片段基因序列的5’端，构建pET-rapbp-fc融合表达载体，转化大肠杆菌并诱导表达。以包涵体形式存在的目的蛋白经变性、复性后。ELISA实验分别证实其与抗人IgG抗体及纯化RAP的结合活性。以MDBK细胞株为模型，MTI实验观察融合蛋白对金葡菌196菌株外分泌毒素水平的影响。结果与结论：融合基因在大肠杆菌中获得表达。复性后，融合蛋白的Fc片段及结合肽部分分别能够与抗人IgG抗体及RAP结合，且能在一定程度上降低金葡菌196株上清中的毒素水平。