指环蛋白31对表皮生长因子受体表达的调控作用及其机制

目的：探讨指环蛋白31 (RNF31)对表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响,并分析RNF31对EGFR的调控机制。方法：采用免疫共沉淀(Co-IP)法验证RNF31蛋白与EGFR蛋白的相互作用。HEK293T细胞分为空载体组(转染pc DNA3.1空载体)和RNF31组(转染RNF31-Flag质粒),采用实时荧光定量PCR (RT-q PCR)法和Western blotting法检测细胞中EGFR m RNA和蛋白表达水平。RNF31的泛素连接酶功能位点(RNF31^C699/702S)和去泛素化酶结合位点(RNF31^{N84A Y93A})突变后,采用Western blotting法检测各组细胞中EGFR蛋白表达水平。HEK293细胞分为空载体组、RNF31组(转染RNF31-Flag质粒)、RNF31+EGFR抑制剂吉非替尼(Gefitinib)组和RNF31+EGFR抑制剂厄洛替尼(Erlotinib)组,采用Western blotting法检测各组细胞中EGFR及其下游信号通路蛋白表达水平。结果：Co-IP法检测,RNF31蛋白...     

蛋白泛素化修饰调控炎性肠疾病发生和发展的研究进展

炎性肠疾病是一种慢性胃肠道功能紊乱的炎症性疾病。泛素化是一类重要的蛋白质翻译后修饰方式。近年来关于泛素化-去泛素化系统在炎性肠疾病发生和发展中的作用已成为研究热点。目前蛋白泛素化修饰调控炎性肠疾病过程所需的E3泛素连接酶中,分子生物学研究较为清楚的有环指蛋白183（RNF183）、环指蛋白20（RNF20）、Itch和锌指蛋白A20。其中RNF183可靶向核因子κB抑制蛋白α（IκBα）泛素化降解促进NF-κB活化;RNF20促进组蛋白H2B单泛素化从而下调相关炎症因子的转录;Itch促进维甲酸核孤儿受体γt泛素化降解抑制IL-17介导的肠炎;A20以其特有的泛素化和去泛素化双重活性影响炎性肠疾病的发展。本文综述了以上分子在炎性肠疾病发生、发展和转归中的作用及调控机制。     

GIT2参与NF-κB信号通路的负调控

目的核转录因子κB(NF-κB)在炎症、免疫、细胞应激和凋亡中扮演重要的角色。NF-κB信号通路的激活机制都具有十分重要的意义。方法以NEMO为诱饵,用酵母双杂交技术从胎肝文库中分离到了与NEMO相互作用的蛋白质GIT2,以GIT2为诱饵,筛选到的猎物发现有4种分子直接参与NF-κB信号通路激活的调控,包括NEMO、TRAF1、TNFAIP3和TNIP1。结果利用GIT2、A20和NEMO内源抗体检测了细胞中GIT2、A20和NEMO的表达,发现HEK293细胞中有GIT2、A20和NEMO的表达,并用Western blot和RT-PCR的方法检测了在HEK293细胞中A20 siRNA和GIT2 siRNA具有一定的干涉效果。通过复合体实验表明,GIT2可以促进A20与NEMO的结合。另外,在HEK293细胞中过表达和敲减GIT2发现GIT2可以促进A20使NEMO发生去泛素化,进而调控NF-κB的下游靶基因的转录。但GIT2调控NF-κB的分子机制还需要进一步的确证。结论 NEMO的相互作用蛋白GIT2在NF-κB信号通路中起重要的作用,GIT2作为一种新的调节NF-κB信号通路的分子,为研究NF-κB的调控机制提供了新的线索。     

核因子-κB信号通路中小泛素样修饰蛋白与2型糖尿病的关系

小泛素样修饰蛋白化是通过一系列小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)酶介导的生化级联反应将SUMO共价结合于靶蛋白的赖氨酸残基上,提高蛋白质稳定性,介导靶分子定位和功能调节的过程。经典通路κB抑制蛋白激酶(inhibitory proteinκB kinaseβ,IKKβ)/核因子κB(nuclear factorsκB,NF-κB)途径是炎性反应的关键信号转导通路。而NF-κB是公认的参与炎症和免疫反应的调节因子。研究发现,不仅NF-κB抑制蛋白(inhibitory protein,IκBa)的SUMO化修饰参与NF-kB信号通路的调节,而且SUMO酶可以直接介导NF-kB对靶基因的转录调控,某些蛋白也可能与SUMO化蛋白有相互作用。文中对SUMO修饰系统、SUMO循环及参与SUMO化循环的酶对NF-kB信号通路的转录调控及其与2型糖尿病相关性研究进行综述。     

基于酵母双杂交技术的PRR11相互作用蛋白筛选与初步分析

目的：采用酵母双杂交技术,筛选PRR11的相互作用蛋白,为深入研究其分子行为机制奠定基础。方法：构建用于酵母双杂交筛选的PRR11诱饵质粒并检测其自激活作用,根据结果进一步构建突变体获得具有较低自激活作用的突变体。对人胎脑cDNA文库进行筛选,获得初始阳性克隆。通过LacZ报告基因检测、回转验证、阳性克隆测序及BLAST序列比对分析,排除假阳性克隆和重复克隆,确定PRR11的候选相互作用蛋白。结果：PRR11具有自激活作用,构建了一个较低自激活作用的PRR11突变体。通过酵母双杂交筛选,获得102个初始阳性克隆转化子。经LacZ报告基因检测,将阳性克隆锁定至39个。通过测序和序列比对分析,证实这39个克隆属于编码15种不同蛋白的基因。最终有RNF41等4个蛋白通过回转验证。结论：RNF41、SCG5、BCYRN1和PRR13是PRR11的潜在相互作用蛋白。     

RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活

目的利用慢病毒干涉下调内源性RNF31 表达,研究NF-κB通路的活化及对细胞凋亡的影响。方法将人RNF31 的
shRNA片段克隆到慢病毒表达载体pGreenPuro中,瞬时转染HEK293T细胞,筛选出有效的干涉片段。将重组表达质粒与包装
质粒PMD、SPA共转染293T 细胞,在24 h、48 h 分2 次收集慢病毒上清,用流式细胞术检测病毒滴度。将获得的病毒感染
HEK293细胞,提取细胞蛋白,Real-time PCR以及Western Blot 检测RNF31干涉效果;报告基因实验检测敲低RNF31对NF-κB
转录活性的影响;Real-time PCR检测干涉RNF31对TNF-α诱导的NF-κB下游靶基因的影响;Western Blot 检测下调RNF31对
IκBα活化的影响;Hochest染色检测下调RNF31对细胞凋亡的影响。结果成功构建RNF31干涉慢病毒pGreenPuro-RNF31载
体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度可达3×107 pfu/ml。在HEK293细胞中下调RNF31,抑制TNF-α刺激的NF-κB的转录活性,并抑
制NF-κB下游靶基因的表达;下调RNF31抑制TNF-α刺激的IκBα的活化;此外,在TNF-α刺激细胞24 h时,RNF31表达下调使
细胞凋亡增多。结论RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活。
     

肿瘤坏死因子受体相关因子6泛素化位点突变载体的构建及其功能位泛素化位点的鉴定

预测人肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）基因上的泛素化位点,并构建泛素化位点突变质粒,探讨突变质粒对人结直肠癌HCT116和SW480细胞中核因子κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1）相对荧光素酶活性的影响。     

核转录因子NF-κB调节人肾小管上皮细胞SIGIRR表达机制的研究

目的 探讨人肾小管上皮细胞(HKC)内核转录因子NF-κB(NF-κB)反馈调控单免疫球蛋白白介素1受体相关蛋白(SIGIRR)表达的分子机制。方法 分子克隆法构建pLNCX2-G418-SIGIRR过表达载体，经PT67细胞包装后感染HKC细胞，构建SIGIRR过表达细胞和对照细胞。使用IL-1β诱导，Western blot验证过表达SIGIRR可抑制NF-κB活化。使用NF-κB阻断剂和干涉NF-κB活性后，免疫荧光法验证活化的NF-κB可调控SIGIRR表达。在线工具预测SIGIRR启动子区存在NF-κB结合位点。分子克隆法从人基因组DNA内获取含有结合位点的SIGIRR启动子序列，连接至荧光素酶载体pGL3-Luc,构建pGL3-Luc-SIGIRR,并突变结合位点。使用荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀技术(ChIP)共同验证活化的NF-κB可结合在SIGIRR启动子区调控SIGIRR基因的表达。结果 构建的pLNCX2-G418-SIGIRR逆转录病毒载体经酶切、测序验证后对比SIGIRR基因编码序列完全一致，重组体和对照载体经病毒包装后转入HKC细胞后成功构建HKC/...     

人环指蛋白11真核表达载体的构建及表达

目的构建含有标签蛋白的人环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)的真核表达载体,并观测其在293T细胞中的表达。方法使用MEGA5.0等生物学软件构建人RNF11的分子进化树;应用RT-PCR从4种人胃癌细胞系中检测到该基因的表达,并将其克隆到pEASY-Blunt载体中,酶切测序鉴定正确后,再将其连接到真核表达载体pCMV-HA中,酶切鉴定正确后转染293T细胞,Western-blotting测其表达。结果重组的携带有RNF11的真核表达载体酶切鉴定后显示载体及片段的大小正确,将该真核表达载体转染293T细胞后使用Western-blotting检测到了融合蛋白的表达。结论携带有标签蛋白的人RNF11基因的真核表达载体pCMV-HA-RNF11克隆及表达成功,为进一步研究其与其它蛋白质的相互作用奠定了基础。     

TRAF2 K48聚泛素化位点的研究

目的筛选K48聚泛素链在肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumor necrosis factor receptor-associated facto r 2,T RA F2）上的主要修饰位点。方法比较不同物种间的T RA F2氨基酸序列,选出人T RA F2上保守率在90%以上的赖氨酸。构建人野生型TRAF2的表达载体及保守赖氨酸突变为精氨酸的突变表达载体。将不同的TRAF2表达载体与NF-κB荧光素酶报告基因表达载体共转至293FT细胞中,通过荧光素酶检测NF-κB激活情况。结果人TRAF2上共有8个保守率在90%以上的赖氨酸,酶切及测序结果证明本研究成功构建TRAF2野生型和突变型表达载体。NF-κB荧光素酶报告基因检测证明TRAF2-K320可能是K48聚泛素链的主要修饰位点。结论 TRAF2-K320位点对TRAF2介导的NF-κB激活具有负向调控作用。     

人T细胞白血病1型病毒Tax蛋白对核因子κB活性的影响

人T细胞白血病1型病毒(HTLV-1)Tax蛋白是HTLV-1的转录激活蛋白,是病毒感染细胞恶性转化的关键因素。目前认为,HTLV-1 Tax蛋白主要通过核因子κB(NF-κB)信号通路发挥作用。HTLV-1 Tax蛋白可以从多个方面影响NF-κB的活性,进而影响CD4+T细胞转化为白血病细胞的过程。本文对Tax蛋白调节NF-κB活性的途径进行综述。     

核因子κB的研究进展

核因子κB(NF-κB)是一个可诱导转录因子,紧密地调节着大群基因的表达。作为细胞机器的一个重要成分,NF-κB在不同的细胞进程中起着重要作用,而这些细胞进程与炎症、先天性及获得性免疫、细胞应激反应、细胞黏附、细胞增殖及细胞凋亡等有关。NF-κB的激活在细胞质及细胞核内被紧密地调控着,其异常激活与感染、炎症性肠病、风湿性关节炎及肿瘤等疾病有关。     

pFLAG-CMV-TRAF1真核表达载体的构建及其对NF-κB信号通路的影响

目的 构建人TRAF1真核表达载体,应用荧光素酶报告基因实验研究TRAF1对NF-κB报告基因活性的影响.方法 采用PCR技术扩增出TRAF1编码基因,将其构到真核表达载体pFlag-CMV-2上.用脂质体将构建的真核表达载体瞬时转染HEK293细胞,用Western blot检测TRAF1蛋白是否表达.用荧光素酶报告基因实验验证其对NF-κB转录活性的影响.结果 成功克降TRAF1编码基因至相应表达载体上.构建的TRAF1真核表达载体使HEK293细胞高表达TRAF1蛋白;在肿瘤坏死因子(TNF-α)的刺激下可以抑制NF-κB的转录活性.结论 TRAF1负调控NF-κB的活性,为进一步研究TRAF1的功能提供了线索.     

TNIP1真核表达载体的构建及表达

目的构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白1(TNIP1)真核表达载体(p EGFP-N3-TNIP1),观察了解外源TNIP1蛋白的细胞内定位及其在He La细胞中的表达.方法应用RT-PCR从人外周血淋巴细胞中扩增TNIP1基因的开放阅读框(ORF),将目的片段亚克隆入p EGFP-N3中,筛选阳性克隆,提取质粒测序进行鉴定.将表达质粒转染He La细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的表达与定位,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白质免疫印迹分别从m RNA水平和蛋白水平来检测TNIP1在He La细胞中的表达情况.MTT实验检测细胞增殖情况、流式细胞仪检测细胞周期.结果重组质粒双酶切鉴定,在1.9 kb左右有明显的条带,DNA测序结果证实重组质粒p EGFP-N3-TNIP1中含有的目的基因片段与Gen Bank上登录号为BC014008.1的TNIP1基因序列完全一致;荧光倒置显微镜观察重组质粒转染He La细胞后有绿色荧光蛋白的表达,转染48 h后通过q RT-PCR和Western blot分别检测到TNIP1m RNA和蛋白质的表达,均较对照明显升高,外源性的TNIP1蛋白主要定位于细胞质中.结论成功构建了p EGFP-N3-TNIP1真核表达载体,外源表达的TNIP1蛋白主要分布于He La细胞的细胞质部分,过表达TNIP1蛋白不影响He La细胞的细胞周期及细胞生长存活.     

USP14调控OSBPL2蛋白去泛素化作用的实验研究

目的：研究泛素特异性蛋白酶14（ubiquitin?specific peptidase 14,USP14）通过调控氧化固醇结合样蛋白2（oxysterol binding protein?like 2,OSBPL2）的泛素化水平稳定OSBPL2表达的分子机制。方法：以HeLa细胞为工具细胞,通过对USP14过表达、敲降以及活性抑制,检测OSBPL2的表达水平;采用体外过表达实验考察USP14对OSBPL2的泛素信号和泛素化水平的调控;采用免疫共沉淀（co?immunoprecipitation,Co?IP）阐明USP14与OSBPL2相互作用的具体结构域、不同结构域在蛋白相互作用中的作用以及OSBPL2的关键泛素化位点。结果：USP14与OSBPL2存在相互作用关系并稳定OSBPL2的表达而不改变其转录水平;体外过表达和Co?IP实验结果表明,USP14催化（catalytic,CAT）结构域与OSBPL2氧固醇结合蛋白相关结构域（OSBP?related domain,ORD）的相互作用降低OSBPL2的泛素化水平;类泛素（ubiquitin?like,UBL）结构域在USP14与OSBPL2相互作用中起到了促进作用;Lys209和Lys361是OSBPL2泛素化和去泛素化的关键位点。结论：USP14通过调控OSBPL2蛋白Lys209和Lys361两个位点的泛素化进而调控其泛素化水平,稳定OSBPL2蛋白的表达。     

环指蛋白6在肿瘤中的研究进展

环指蛋白6（ring finger protein 6, RNF6）是含有RING结构域的泛素连接酶E3，可作为骨架招募E2和靶蛋白，介导泛素由E2转移到底物特定位点。RNF6可通过泛素化修饰底物蛋白改变其表达水平，也可改变底物功能。RNF6参与SHP1/STAT3、Akt/mTOR、Wnt/β-catenin、ERα/Bcl-xL、MAPK/ERK、MAD1/c-myc等信号通路的调控，与多种恶性肿瘤的发生发展相关。靶向抑制RNF6表达或可作为抑制肿瘤发生发展的一种方法，但仍需大量研究。本文通过查阅近年来涉及泛素连接酶RNF6的文献，综述RNF6的发现历程、结构特征及其与恶性肿瘤的关系，旨在为后续深入研究RNF6对肿瘤的影响提供理论基础。     

细胞角蛋白18真核表达载体的构建及其对NF-κB信号通路的影响

目的 构建人细胞角蛋白18(CK18)真核表达载体,以研究CK18与NF-κB信号通路的关系.方法 经PCR扩增CK18基因片段,用pCMV-Myc及pDsRed1-N1载体构建真核重组质粒,瞬时转染HEK293细胞,用Western blot方法检测pCMV-Myc-CK18的表达,在荧光显微镜下观察pDsRed1-N1-CK18的定位情况.用双荧光素酶报告基因系统,检测CK18对NF-κB信号通路的影响.结果 构建了人CK18真核表达载体,发现CK18定位于细胞质,并抑制NFκB的转录活性.结论 构建了人CK18真核表达载体,CK18负调控NF-κB信号通路.     

核因子κB与细胞周期蛋白D1在骨肉瘤中的表达及相关性研究

目的:探讨骨肉瘤细胞中核因子κB(NF-κB)及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达及其意义.方法:应用免疫组织化学SABC法,检测46例骨肉瘤、15例骨软骨瘤和5例正常骨组织中NF-κBp65亚单位和cyclin D1表达,并比较NF-κB表达在骨肉瘤组织学分级、分型间的差异及其与cyclin D1表达的关系.结果:NF-κBp65亚单位显著表达于骨肉瘤细胞中(67.4%),而在正常骨组织和骨软骨瘤中未见表达;NF-κBp65表达与骨肉瘤组织学分级无关,在骨内高分化型组表达显著高于普通中心型组(P＜0.05).cyclin D1在骨肉瘤中表达率为73.9%,显著高于骨软骨瘤组(33.3%,P＜0.05);骨肉瘤中NF-κB p65与cyclin D1蛋白表达显著正相关(r=0.463,P＜0.01).结论:NF-κB p65在骨肉瘤细胞中异常活化,并与cyclin D1过表达密切相关,其可能通过上调cyclin D1表达参与骨肉瘤的发生发展.     

泛素-蛋白酶体系统在核因子κB途径中的作用

核转录因子NF-κB控制着一系列的细胞和组织过程,包括从细胞的分裂、增殖、凋亡到组织器官的各种应答活动.泛素-蛋白酶体系统通过以下3个途径影响NF-κB信号转导:①泛素-蛋白酶体降解NF-κB的抑制因子IκB;②对NF-κB前体如p105和p100进行加工并使之成熟;③通过非降解依赖机制激活IκB激酶IKK,从而抑制NF-κB.本文对泛素-蛋白酶体系统对NF-κB信号转导途径的影响进行综述.     

与A20结合的核因子-κB抑制蛋白1的研究进展

与A20结合的核因子κB抑制蛋白1（A20 binding inhibitor of NF-κB activation ,ABIN1）是近年来研究发现的一个新泛素结合蛋白。最初的研究表明,ABIN1通过结合锌指结构蛋白A20在NF-κB信号通路中发挥重要的调节作用。目前发现,ABIN1在过表达的条件下能抑制肿瘤坏死因子、白细胞介素1、脂多糖、表皮生长因子等诱导的NF-κB的活性,从而发挥抗炎和免疫调节作用。因此,以ABIN1为新靶点调节NF-κB活性的研究日益受到关注。本文就ABIN1蛋白结构、功能及其研究进展做一综述。