骨形态发生蛋白-2基因转染对舌癌细胞增殖活性的影响

目的 探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)基因转染舌癌Tca8113细胞后,对Tca8113细胞形态和增殖活性的影响.方法 分别以感染复数(MOI)为0、50、100的腺病毒为载体的BMP-2基因转染体外培养的舌癌Tca8113细胞.采用荧光倒置显微镜观察转染前后Tca8113细胞形态的变化,Weste...     

骨形态发生蛋白6对张应力下大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白-6(BMP-6)对张应力作用下大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成骨向分化的影响。方法:应用四点弯曲加力系统对体外分离培养大鼠BMMSCs施加不同大小的周期单一张应力60 min,2 h后检测检测内源性BMP-6的表达量,同时检测碱性磷酸酶、骨钙素表达量和进行成骨细胞转录因子-2mRNA定量分析。然后对体外分离培养转染人BMP-6复制缺陷型病毒的大鼠BMMSCs施加4000μstrain的周期单一张应力60 min,2 h后检测成骨标志表达。结果:随着张应力的增大,BMP-6的表达逐渐增强,同时成骨能力亦增强,但2000 μstrain以后BMP-6的表达与成骨能力均下降。4000 μstrain条件下2 h后转染人BMP-6基因的大鼠BMMSCs各项成骨标志因子的检测明显强于转染空白病毒。结论:适当的张应力可促进BMP-6表达上调和BMMSCs骨向分化,上调BMP-6的表达可以恢复过大张应力所致的成骨能力下降。     

绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的　体外研究绿色荧光蛋白 (GFP)基因转染骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法　体外分离培养大鼠MSCs,用重组GFP的腺病毒载体Ad GFP及脂质体介导质粒pEGFP C1两种方法转染GFP,流式细胞术观察比较基因转染和表达结果;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果　重组Ad GFP对细胞的感染率达(41 3±1 4)%,感染 6周后仍有表达;脂质体组转染效率最高为 12 5%。病毒感染组阳性细胞与未感染组细胞经成骨诱导分化后碱性磷酸酶表达均逐渐增高;诱导 3周后茜素红钙盐染色均为阳性。结论　重组GFP的腺病毒载体Ad GFP可高效感染MSCs,基因转染后细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义(P>0 05),可以作为一种高效的大鼠MSCs的标记方法。     

腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染肌卫星细胞诱导成骨的动物实验研究

目的观察腺病毒介导的BMP- 2基因转染肌卫星细胞后体内骨诱导能力。方法采用动物实验方法,将转染BMP- 2基因的绿色荧光蛋白（GFP）转基因鼠肌卫星细胞吸收到胶原支架上,然后将细胞胶原支架复合物移植入野生型129sv小鼠的后小腿肌肉中,应用X线片观察、组织学检查及荧光显微镜观察转染细胞的诱导成骨能力。结果用BMP- 2基因转染的肌卫星细胞复合胶原支架移植入野生型小鼠后小腿筋膜下肌肉后会产生异位骨形成,移植2周后其中有GFP阳性的成骨细胞和骨细胞,3周后形成良好的骨组织,4周时已形成成熟的骨组织,而且骨组织具有GFP荧光。对照组用胶原支架和未转染的肌卫星细胞移植,未出现诱导性异位骨形成。结论Ad- BMP2转染的肌卫星细胞以胶原为支架可以在肌肉内诱导骨组织形成。     

骨形态发生蛋白-2基因修饰骨髓间充质干细胞复合对氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物移植促进兔下颌骨牵张成骨的实验研究

目的 探讨人骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因修饰骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合可注射骨组织工程支架材料对氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物（Pluronic F-127）移植对兔下颌骨牵张成骨新骨形成的促进作用。方法 将48只新西兰白兔随机分为4组,每组12只。建立下颌骨牵张成骨动物模型,固定期第2天A组于牵张间隙注射200 μL BMP-2基因修饰BMSCs与Pluronic F-127复合物;B组注射等量BMP-2基因修饰BMSCs液;C组注射等量BMSCs液;D组注射等量生理盐水。分别于固定2、6周时处死半数动物获取标本,通过X线片、组织切片及免疫组化观察骨质愈合改建情况。结果 通过X线片及免疫组化观察并经过统计软件分析,在固定2周和6周时,A组牵张区内骨密度和BMP-2蛋白的表达明显高于B、C、D组（P<0.01）,B组明显高于C组和D组（P<0.01）;C组和D组比较差异无统计学意义（P>0.05）。A、B组间隙内成骨质量好于C、D组,A组好于B组。结论 BMP-2基因修饰BMSCs复合可注射骨组织工程支架材料Pluronic F-127移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成。     

腺病毒介导的骨形态发生蛋白应用安全性的研究

腺病毒介导的骨形态发生蛋白转基因方法被认为是最有前景的利用骨形态蛋白诱导成骨的手段。关于这种基因治疗方法的安全性一直是制约其运用于临床的主要原因之一。本文参考了相关英文文献,总结了众多学者的观点,概述了腺病毒介导的骨形态发生蛋白安全性方面的问题,并详细阐述了目前有关提高其安全性的各种解决办法。     

BMP-2对大鼠骨髓间充质干细胞成骨作用的影响

目的:携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因的慢病毒载体感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)后,观察BMP-2对BMSCs成骨作用的影响。方法:原代培养大鼠BMSCs并进行传代及鉴定,用携带BMP-2的慢病毒感染第3代BMSCs后,进行骨向诱导,通过茜素红染色观察钙沉积。观察细胞黏附能力及对成骨标志分子骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、胶原蛋白Ⅰ(Col-Ⅰ)及smad(drosophila mothersagainst decapentaplegic protein)表达的影响。采用SPSS11.0软件包对数据进行统计学分析。结果:①原代培养出大鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定;②携带BMP-2和EGFP的慢病毒感染第3代BMSCs后,免疫荧光检测和RT-PCR及WB检测感染成功;③大鼠骨髓间充质干细胞感染慢病毒后进行骨向诱导,钙沉积明显增加;④BMSCs细胞黏附能力增强;⑤OPN、OCN、Col-Ⅰ及smad表达增加。结论:BMP-2通路增强了细胞黏附及相关成骨分化因子的表达,可明显促进大鼠...     

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/ BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/ BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。     

骨形态发生蛋白-2基因转染对舌癌细胞增殖活性的影响

分别以感染复数(MOI)为0、50、100的腺病毒为载体的BMP-2基因转染体外培养的舌癌Tca8113细胞。采用荧光倒置显微镜观察转染前后Tca8113细胞形态的变化,Western blot法检测Tca8113细胞BMP-2的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测Tca8113细胞增殖能力,并绘制生长曲线。结果:MOI为100时转染率最高,转染前后Tca8113细胞形态变化不大,Western blot检测到Tca8113细胞BMP-2的表达,转染后Tca8113细胞的增殖活性降低。结论:腺病毒介导的人BMP-2在体外能够抑制舌癌Tca8113细胞的增殖活性。     

人体脂肪基质细胞成肌潜能研究

目的　研究分离的人体脂肪基质细胞经过诱导培养后向骨骼肌细胞分化的潜能。方法　通过脂肪抽吸 术获取健康成人脂肪,机械分割后用Ⅰ型胶原酶消化,得到脂肪基质细胞。将脂肪基质细胞在BGJb培养基中原代 培养10 d,在DMEM/F12培养基中进行成肌诱导培养20 d,获得细胞爬片。细胞爬片经4%多聚甲醛固定后,用甲 苯胺蓝、Mallory磷钨酸苏木素染色观察细胞形态;Myosin单克隆抗体免疫细胞化学染色观察肌球蛋白表达情况。 结果　经过成肌诱导培养的细胞与常规培养的脂肪基质细胞在形态上有明显的差异,表现为细胞体积增大,单个 核的细胞融合形成多核的肌管样结构,胞浆内细胞器发达,肌浆网扩张并形成肌原纤维骨骼肌特异性的Myosin表 达阳性。未经诱导的脂肪基质细胞在相同时间点无此现象。结论　人类脂肪基质细胞中存在着成体干细胞,在成 肌诱导培养条件下具有向骨骼肌细胞分化的潜能。     

重组人骨形成蛋白2基因转染大鼠自体骨髓基质细胞成骨能力研究

目的　在构建的SD大鼠骨组织工程模型中,观察以含孔磷酸钙陶瓷为支架的基因转染自体骨髓基质细胞异位骨形成能力。方法　成年雄性SD大鼠20只,全麻及无菌条件下取其左侧股骨及胫骨,将骨髓冲入 75 ml培养瓶中并在常规培养条件下进行体外扩增;5 d后将部分骨髓基质细胞消化并通过LipofectAMINETM2000介导进行重组人骨形成蛋白(rhBMP2)基因转染及G-418连续筛选14 d;再将转染和未转染的自体细胞一同接种于经纤连蛋白表面修饰的含孔磷酸钙陶瓷上继续培养10 d,并将细胞陶瓷复合体对应地种植于大鼠背部皮下及肌肉内。分别于2~20周处死动物,从形态学及组织学角度观察异位骨形成情况。结果　基因转染细胞陶瓷复合体无论种植于皮下或肌肉内均表现明显的异位骨形成能力;其同期骨形成与早期实验中的经诱导骨髓基质细胞陶瓷复合体异位骨形成相似。结论　应用以含孔磷酸钙陶瓷为支架的rhBMP2基因转染自体骨髓基质细胞移植,可获得与诱导分化的自体骨髓基质细胞相同的成骨能力,说明基因转染自体骨髓基质细胞再次植入体内后,可相当于生物反应器,在增殖的同时促进干细胞的分化和成骨潜能。     

hBMP-7基因转染的骨髓基质细胞与BME-10X胶原膜复合物的体外构建

目的:观察人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因转染的骨髓基质细胞(BMSCs)与胶原膜BME-10X复合后,BMSCs在BME-10X上的生长状态。方法:利用脂质体介导法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSCs,传代与胶原膜BME-10X复合,荧光显微镜、扫描电镜、透射电镜观察。结果:转染细胞复合胶原膜后生长良好,24h细胞已贴附、伸展。透射电镜可见细胞与材料表面连接紧密,包膜部分增厚,形成类似半桥粒样结构。结论:hBMP-7基因转染BMSCs在胶原膜BME-10X上生长良好,hBMP-7基因转染的BMSCs与胶原膜复合物有望应用于牙周组织工程。     

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的骨诱导作用

目的　建立表达骨形成蛋白2 (BMP-2)的人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs),观察其体内成骨作用,为牙周缺损修复基因疗法的建立提供实验依据。方法　采用脂质体载体将人BMP-2噬菌粒表达载体pBK-B2转染至 HPDLFs。利用免疫组化ABC法检测转染细胞内BMP-2蛋白的表达,并于无菌条件下将转染细胞注射于裸鼠股部肌肉内,21 d后取材,苏木精-伊红染色观察肌肉组织内骨形成情况。结果　BMP-2基因转染后HPDLFs内有BMP- 2蛋白的表达。在注射BMP-2基因转染细胞的肌肉组织内可见明显的新骨形成。结论　BMP-2基因成功转入HP- DLFs中并得到有效表达,转染BMP-2基因的HPDLFs能够在体内诱导新骨形成。     

骨形成蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓基质细胞的生物学作用

目的：探讨重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(b—FGF)单独或联合作用对人骨髓基质细胞(HBMSC)增殖和分化的影响。方法：利用四唑盐比色法(MTT)、碱性磷酸酶(ALP)测定法观察不同浓度的rhBMP-2和b—FGF单独或联合作用时HBMSC的增殖和分化情况。结果：rhBMP-2对HBMSC的增殖和ALP表达均有促进作用；b—FGF促进HBMSC增殖，但抑制ALP表达；rhBMP-2和b—FGF联合作用时HBMSC的增殖和ALP活性较单独作用有显著提高。结论：rhBMP-2和b—FGF联合应用时对HBMSC的增殖和向成骨细胞分化具有协同作用。     

骨形成蛋白-2基因转染对成纤维细胞表型影响的实验研究

目的 探讨腺病毒载体介导的骨形成蛋白-2（Ad-BMP-2）基因转染人胚肺成纤维细胞（HELFs）后,对HELFs的表型特别是矿化能力的影响。方法 原代培养HELFs,并用Ad-BMP-2进行转染。观察转染前后HELFs的形态学变化;用四唑盐比色法、碱性磷酸酶染色、蛋白印迹以及体外矿化实验,检测转染BMP-2基因后HELFs增殖活性、碱性磷酸酶活性、BMP-2蛋白表达和矿化能力的变化。结果 HELFs经Ad-BMP-2转染后,胞体变大,由单一细长梭形转变为多种形态,由单层生长变为复层生长;转染后HELFs增殖受到明显抑制;碱性磷酸酶染色见大部分细胞呈现阳性反应;蛋白印迹检测到明显的BMP-2蛋白条带;细胞经茜素红S染色后出现桔红色的矿化结节。结论 经Ad-BMP-2转染后,HELFs向成骨细胞表型转变,具有了矿化能力。     

犬骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:研究犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外诱导分化为成骨细胞的方法和活性检测。方法:抽取犬骨髓3 mL,使用成骨条件培养液,贴壁法体外培养,将培养的第2、3代细胞进行透射电镜、流式细胞仪、生长曲线、碱性磷酸酶、Von Kossa和免疫组化等检测。结果:第2代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性表达;第3代细胞Von Kossa染色、骨桥素、骨涎蛋白和骨钙蛋白呈阳性表达;第3代细胞透射电镜显示高尔基体和线粒体丰富;流式细胞仪检测显示第3代处于S期的细胞比例较第2代增加。结论:犬骨髓基质细胞在体外能定向诱导分化为成骨细胞。     

骨骼肌卫星细胞体外培养及分化为成骨样细胞的实验研究

目的:评估骨骼肌卫星细胞(skeletalmusclesatellitecells,SMSCs)体外分化为成骨样细胞的能力,探讨骨骼肌卫星细胞作为骨组织工程种子细胞的可能性。方法:取新生Wistar大鼠骨骼肌,采用酶消化法分离出SMSCs,体外原代及传代培养,经腺病毒介导的人骨形成蛋白2(Ad-BMP2)基因转染后,行成骨细胞标志物活性的检测及细胞化学染色,并进行细胞体外矿化能力的测定。结果:转染后细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性增强(P<0.01)且组织化学染色呈阳性,骨钙素及I型胶原的免疫细胞化学染色呈阳性,21d后见钙结节形成。结论:体外培养的骨骼肌卫星细胞可以向成骨方向转化,有望成为骨组织工程的种子细胞。     

脂肪基质细胞骨向诱导分化的研究进展

脂肪基质细胞(ADSCs)是目前骨组织工程的理想种子细胞,诱导其定向成骨分化是该领域的研究热点。脂肪基质细胞定向成骨诱导的方法主要有改变ADSCs所处的微环境、修饰ADSCs内部基因等。本文对脂肪基质细胞骨向诱导分化的研究进展进行综述。