半月板碎片来源间充质干细胞样细胞的分离培养及多向分化潜能

目的:探讨半月板碎片来源间充质干细胞(MSC)样细胞的分离培养和多向分化潜能。方法:通过酶消化的方法分离半月板碎片来源细胞,体外培养至第3代,显微镜下观察其形态和生长状态。取第3代细胞并对其进行向成骨、成脂和成软骨诱导分化。结果:经酶消化的方法分离半月板碎片来源细胞4~6天可见少量的长梭形贴壁,10~14天细胞成簇生长,克隆集落形成。第3代细胞形态较均一,生长增殖良好。成骨诱导14天后ALP和茜素红染色阳性,有矿化结节形成。成脂诱导14天后油红O染色阳性提示细胞内有脂滴形成。采用细胞微团无血清成软骨诱导21天后甲苯胺蓝染色呈阳性,细胞外有蛋白多糖形成;免疫组织化学染色示特异软骨基质Ⅱ型胶原表达阳性。结论:采用混合胶原酶消化的方法分离获得的半月板碎片来源的细胞贴壁生长,呈典型的长梭形的MSC样细胞形态,在体外适当的诱导条件下具有分化成骨、成脂、成软骨的潜能,有望成为半月板再生的种子细胞来源。     

真皮来源间充质干细胞的分离培养及成神经分化的研究

目的：研究真皮来源间充质干细胞的分离培养方法及其向神经细胞分化的条件及可行性。方法：取大鼠真皮组织，采用贴壁传代培养筛选法，分离培养真皮间充质干细胞，流式细胞术检测细胞周期，经β-巯基乙醇诱导，倒置显微镜下观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果：分离的早期贴壁的真皮来源间充质干细胞经过连续传代培养至第4代，细胞形态较为均一，86％的细胞处于G0／G1期，细胞表面波形蛋白表达阳性，但因子Ⅷ和角蛋白表达阴性。经β-巯基乙醇诱导，真皮间充质干细胞可向神经细胞分化，细胞突起增多，具有神经元的形态学特征，分化后的细胞表达神经元标志物——神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经微丝（NF-200）。结论：大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞，一定条件下可分化为神经元。提示真皮可能是成体多能干细胞的又—来源，有望在神经组织修复和再生中发挥作用。     

重组人干细胞因子对猕猴外周血干细胞的动员作用

给正常成年猕猴每天一次皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子 10 μg·kg-1·d-1(μKD)或 (和 )重组人干细胞因子 2 0、5 0和12 5 μKD ,前者给药 5天 ,后者 8天 ,观察国产重组人干细胞因子动员外周血干细胞的效果。结果表明 ,给药后外周血白细胞数最高值rhG CSF单独给药组为 2 0 6 % ,rhSCF单独给药为 2 0 0 % ,而两者联合给药后为 2 80 %～ 310 % ;外周血CFU GM较动员前分别升高 1 1、1 3和 5 8～7 9倍 ;3个联合动员组外周血CD34+ 细胞数分别为动员前的 2 0、2 4和 35倍。说明rhSCF对外周血干 /祖细胞有明显的动员作用 ,rhSCF+rhG CSF联合动员效果更佳     

急性心肌梗死患者外周血干细胞动员效率及安全性观察

目的　观察急性心肌梗死 (AMI)患者应用G CSF行自体外周血干细胞动员的效率与安全性。方法　我院 2 0 0 3年 11月至 2 0 0 4年 8月收治的 4 5例AMI患者 ,入院后在常规AMI治疗 (药物与介入治疗 )基础上给予包涵体型G CSF ,30 0～ 6 0 0 μg d皮下注射 ,连续 5d ,第 6天经美国Baxter公司生产的CS30 0 0PLUS血细胞分离机 ,分离外周血干细胞 ,然后进行经皮经腔冠状动脉内移植自体外周血干细胞进一步治疗急性心肌梗死。动员前及动员后第 3～ 7天行外周血WBC计数检查 ,经流式细胞仪测定CD34+ 的细胞数量。并在外周血干细胞动员时观察有无不良反应 ,心绞痛或心衰加重等并发症发生 ,及一些少见的并发症 :自发性脾破裂、严重化脓性感染、高凝状态、自身免疫性疾病等发生。结果　在动员前及动员后第 3～ 7天外周血中WBC量分别为 (8.4 2± 2 .5 9)× 10 9 L、(31.2 8± 8.34)× 10 9 L、(35 .2 4± 9.38)× 10 9 L、(37.0 3± 13.0 7)× 10 9 L、(35 .34± 14 .6 8)× 10 9 L、(2 0 .35± 9.2 2 )× 10 9 L ;CD34+ 量分别为 (14 .89± 11.4 6 )× 10 6 、(6 7.78± 5 0 .88)× 10 6 、(12 4 .79± 136 .13)× 10 6 、(2 0 8.92± 2 0 6 .97)× 10 6 、(2 0 6 .10± 184 .5 7)× 10 6 、(6 6 .6 3± 5 6 .5 6 )× 10     

去分化来源表皮干细胞的分离、培养和鉴定

目的 分离培养去分化来源的表皮十细胞(dedifferentiation-derived epidermal stem cells,DDESCs),并进一步观察其表型特征.方法 包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮.分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮十细胞后,移植到BALB/c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,移植5 d后收集皮片制备单细胞悬液,流式检测CK10、CK19和β1整合素阳性细胞白分数,然后用Ⅳ型胶原粘贴法分离皮片内DDESCs,并采用免疫荧光法和荧光定量PCR法分别检测去分化细胞内CK19、β1整合素、Oct4和Nanog的表达.结果 流式检测结果表明,皮片移植5 d后,CK10阳性细胞减少(P＜0.01),CK19和β1整合素阳性细胞增加(P＜0.01).Ⅳ型胶原粘贴分离DDESCs,结果表明,移植皮片组在10 min内约有4.56%的贴壁细胞出现.细胞的表型分析结果表明,DDESCs内CK19、β1整合素、Oct4和Nanog的表达量类似于原始表皮干细胞(P＞0.05),但明显高于成熟表皮细胞(P＜0.01).结论 DDESCs的表型特征与原始表皮干细胞相类似,提示去分化细胞有可能代替原始表皮干细胞应用于创伤部位的修复和再生.     

人脂肪来源间充质干细胞的制备及其质量检验方法

 目的 研究人脂肪来源间充质干细胞(human adipose-derived stem cells, hADSCs)的制备及其质量检验方法 , 为临床研究提供安全合格的干细胞。方法 取50例人吸脂术抽取的脂肪, 剪碎, 用胰酶和胶原酶消化、分离、培养, 并按照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》对其进行细胞形态、数量、活率、无菌、支原体、人源特定病毒及猪源病毒、内毒素、免疫抑制活性、分化能力、免疫表型等检测及染色体核型。结果 50例hADSCs;细菌、内毒素检测阴性, 无内外源致病菌;干细胞免疫表型检测CD90、CD105表达阳性, 阳性率＞95%, CD34 、CD45和HLA-DR表达阴性, 阳性率<2%;具有成骨、成脂分化潜能;能抑制异体淋巴细胞的增殖。间充质干细胞活性冻存前≥92％, 冻存复苏后≥82％。结论 按照本工艺及标准制备的hADSCs符合质量控制标准, 为同类干细胞制备及其检定过程标准化提供了试验依据。
     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定及标记

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养、鉴定和标记的方法以及生物学特性。方法无菌条件下穿刺人髂后上嵴抽取骨髓,采用直接贴壁法分离纯化hMSCs,体外扩增,用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的hMSCs进行鉴定,同时检测第3代和同代溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)标记的hMSCs细胞周期。结果体外培养的原代hMSCs在培养24小时内可见少量贴壁细胞,7天达到融合,免疫细胞化学示CD44和CDl05表达阳性,CD34表达阴性,流式细胞仪示CD44阳性率为89．64％,CD34为0．11％。大部分hMSCs核抗BrdU染色阳性,阳性率达90％。细胞周期显示第3代和同代BrdU标记的hMSCs约有90％的细胞处于G0／GI期,第10代为80％。结论hMSCs在体外很容易分离培养和扩增,但随着传代次数的增加,hMSCs变得宽大扁平且增殖速度减慢,出现衰老现象;用BrdU标记hMSCs对其细胞周期无明显影响,可作为标记细胞的一种有效手段。     

大鼠脂肪组织源间充质干细胞的培养及诱导分化

目的体外培养脂肪组织源间充质干细胞,诱导该细胞向成骨细胞和心肌细胞分化,为骨和心肌组织工程提供种子细胞。方法取Wistar大鼠脂肪组织,以胰蛋白酶消化分离出脂肪间充质干细胞。第三代细胞用于鉴定细胞表面抗原,同时以成骨诱导培养液诱导细胞,并以10μmol/L5-氮胞苷处理细胞24h,然后培养,用免疫组化法和组织化学法检测这些细胞。结果所分离细胞90%以上表达CD44、CD13、CD29抗原,有些细胞表达肌节型肌动蛋白和结蛋白;经成骨诱导液诱导14d的细胞表达碱磷酸酶,21d后表达骨钙蛋白并有少量胞外钙沉积;经10μmol/L5-氮胞苷处理的细胞均表达NKx2.5、肌节型肌动蛋白和连接蛋白Cx43。结论本实验所培养的细胞为脂肪组织源性间充质干细胞,能向成骨细胞和心肌样细胞分化,可为骨和心肌组织工程提供种子细胞。     

干细胞动员对骨创伤大鼠免疫功能的保护作用

目的：观察自体干细胞动员对骨创伤大鼠的免疫功能的保护作用，为战创伤后的免疫抑制及继发性感染、系统性炎症反应等治疗提供依据。方法：挤压折断法复制大鼠双后肢股骨骨折模型，于致伤后0、24、48h连续给模型动物肌肉注射GM—CSF20μg／kg，致伤后72h细胞增殖法检测T、B淋巴细胞活性，ELISA法检测血清IL-1、IL-2、IFN-7、TNF—α浓度，自动系列化分析法检测C3、CA、IgM、IgG浓度，称重法观察脾重与体重的比例变化。结果：股骨骨折模型大鼠致伤后72h，GM—CSF动员骨髓干细胞组大鼠的T、B淋巴细胞活性和血清IFN-γ、IL-2浓度高于对照组（P〈0．01），IL-1、TNF—α浓度低于对照组（P〈0．01），血清C3、CA、IgM、IgG浓度及脾／体重比值高于对照组（P〈0．01）。结论：GM—CSF动员自体干细胞动员对大鼠骨创伤诱导的免疫功能抑制具有保护作用。     

脐血间充质干细胞的培养及诱导分化的研究进展

骨髓是间充质干细胞的丰富来源,但是关于脐血及循环血中是否存在MSC,在研究初期一直存在争议。2000年,Erices等首次报导了从脐带血中分离培养出低密度类似骨髓MSCs的贴壁细胞,其表达SH1,SH2等间充质细胞标志抗原,并可分化成为成骨细胞和脂肪细胞,其免疫表形和功能特点与骨髓来源的MSC极为相似,同时发现早产儿脐血中间充质干细胞的含量要较足月儿丰富。有研究者证明,脐带血中含有间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,并且具有多向分化潜能和很高的可塑性。     

PET人工韧带材料纳米化对骨髓基质干细胞粘附、增殖及分化影响的实验研究

目的:观察人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)在经过表面纳米化处理的PET人工韧带材料表面的粘附、增殖及成骨分化。方法:根据PET膜片表面处理情况分为PET组(PET膜片未经表面处理)、LBL组(PET膜片表面经透明质酸、壳聚糖纳米自组装涂层处理)和HA组(PET膜片经透明质酸、壳聚糖纳米自组装处理后,表面再加纳米羟基磷灰石涂层)3组。在上述3种PET材料上分别培养hBMSCs后进行各项检测。扫描电镜(SEM)观察hBMSCs在材料上培养1天和7天时的细胞形态。培养7天后,Alamar blue法检测hBMSCs的增殖,pNPP法检测碱性磷酸酶(ALP)活性。RealTimePCR检测培养3天hBMSCs的整合素β1mRNA表达。结果:SEM显示HA组和LBL组hBMSCs能更好地伸展和粘附,形态明显优于PET组。培养7天,HA组和LBL组的细胞增殖、ALP活性定量均显著高于PET组(P<0.001);HA组细胞增殖显著高于LBL组(P=0.01),HA组ALP活性显著高于LBL组(P<0.001)。培养3天后,HA组和LBL组hBMSCs的整合素β1mRNA表达显著高于PET组(P<0.001),HA组显著高于LBL组(P=0.003)。结论:PET人工韧带材料表面经壳聚糖、透明质酸纳米自组装涂层和纳米羟基磷灰石涂层处理后,能明显促进人hBMSCs的粘附、增殖和分化。纳米羟基磷灰石涂层的作用最明显。     

超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记兔骨髓间充质干细胞的孵育时间优选

目的探讨超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米颗粒标记兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的最佳孵育时间。方法分离培养兔骨髓单个核细胞5×105/8ml共4瓶,SPIO分别以10μl、20μl、60μl浓度加入其中3瓶标记,另1瓶为未标记细胞。均在37°C,5%CO2条件下孵化过夜,6h及以后每隔6h直至标记后7d分别经荧光显微镜观察标记细胞的形态学改变和铁颗粒结合率,并与未标记组细胞进行对照。结果3组均显示细胞内吞铁颗粒随着孵育时间的延长而增加,标记浓度越高则细胞内吞铁颗粒越多;10μl组标记后18~24h标记率可达到96%~100%,且细胞的形态与增殖分化能力正常,与未标记细胞组基本一致,孵育时间<18h则标记率<90%;20μl组标记后12h细胞标记率即达到100%,标记后3~7d,细胞分裂增殖不明显;60μl组标记后6h标记率即达到100%,但以后细胞的分化增殖能力明显受限。结论安全标记浓度下磁性标记干细胞的最佳孵育时间为18~24h。标记率与标记浓度和标记后孵育时间呈正相关。     

高原红细胞增多症患者骨髓间充质干细胞的培养

目的：对高原红细胞增多症（HAPC）患者骨髓间充质干细胞（MSCs）进行分离培养,为进一步探讨其生物学特性奠定基础。方法：采用密度梯度离心和贴壁筛选法对10例HAPC和10例正常人骨髓MSCs进行分离培养,倒置显微镜下观察MSCs形态,流式细胞仪行细胞表面抗原检测,检测MSCs生长情况,判断其增殖能力。结果：骨髓密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC）后培养,骨髓MSC均分离培养成功,贴壁细胞呈梭形;两组骨髓MSCs均表达CD29、CD105和CD13,不表达CD45、CD4、CD8、CD14、CD3、CD34和HLA-DR（P〉0.05）。HAPC骨髓MSCs增殖能力高于正常骨髓（P〈0.01）。结论：HAPC患者骨髓MSCs体外可有效分离培养,所培养的细胞成分单一,可供进一步实验应用。     

异种脐血干细胞移植修复兔全层关节软骨缺损的初步研究

目的 :探讨人脐血干细胞对兔全层关节软骨缺损的修复作用及免疫反应。材料和方法 :取人脐带血中脐血干细胞及幼兔的骨髓基质细胞 ,体外分离培养 ;以聚乳酸 (PLA)为载体 ,将培养的原代细胞植入PLA支架上 ,形成细胞 -PLA复合物。于 2 0只成年新西兰大白兔的股骨滑车关节面上造成直径 4.5mm深 3 .0mm的全层关节软骨缺损 ,将两种细胞 -PLA复合物分别植入关节软骨缺损处。植入异种脐血干细胞 -PLA复合物为实验组 ,植入同种异体骨髓基质细胞 -PLA复合物为阳性对照组 ,缺损不处理为阴性对照组。术后 6周、1 2周观察缺损修复情况、新生组织类型及有无免疫反应。结果 :脐血干细胞组 6周时标本为纤维组织修复 ,内有少量软骨细胞 ;1 2周时 40 %标本为软骨样组织修复 ,较薄 ;60 %标本为纤维组织修复。移植物周围无明显淋巴细胞聚集 ,部分滑膜有炎症反应。骨髓基质细胞组(阳性对照)为软骨样组织修复 ;滑膜无明显炎症反应。阴性对照组为纤维组织修复 ,无软骨形成。结论 :异种脐血干细胞移植修复软骨缺损优于缺损不处理组 (阴性对照) ,但明显差于同种骨髓基质细胞组 (阳性对照 )。脐血干细胞有可能成为软骨修复的新的种子细胞。由于种属差异的影响 ,脐血干细胞组可能存在免疫反应 ,结果需进一步研究     

MRI体外定量测定SPIO标记兔骨髓间充质干细胞

目的 测定MRI监测SPIO标记兔骨髓间充质干细胞(r-MSC)的最低SPIO浓度,寻找MRI体外定量测定SPIO标记r-MSC的方法.方法 分离、培养r-MSC,不同浓度SPIO标记r-MSC 24 h后采用3.0 T MRI T2*W-GRE、T1W-GRE、T2W-PROPELLER序列扫描标本.结果 3种序列中,T2 * W-GRE序列体外监测SPIO标记干细胞的能力最佳,1×105/ml、1 × 106/ml细胞浓度下,T2 *W-GRE序列测定的平均MR信号衰减率(△SI)与SPIO浓度之间具有强相关.结论 适宜细胞浓度下,T2 * W-GRE序列可用于定量近似预测SPIO标记浓度.     

应用植入转染血小板源性生长因子基因的骨髓间充质干细胞的灭活同种异体跟腱重建兔前交叉韧带效果的实验研究

目的:探讨应用植入转染血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)基因的骨髓间充质干细胞的灭活同种异体跟腱重建兔前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)的效果。方法:取新西兰白兔自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),培养后感染稳定表达PDGF-BB逆转录病毒,种植于经γ射线照射灭活的同种异体跟腱上,进行前交叉韧带重建。实验分对照组(移植物为单纯灭活跟腱)、细胞组(移植物为种植MSCs的灭活的跟腱)和基因组(移植物为转染基因的MSCs种植于灭活的跟腱)三组。术后3周、6周、12周,分别进行组织学及免疫组织化学染色,观察关节腔内移植物的变化过程及力学拉伸试验观察韧带的生物力学改变。结果:术后3周移植物表面已经覆盖大量从受体来的炎性细胞,对照组细胞量明显少于细胞组和基因组。细胞由移植物表面逐渐进入深部,基因组中随大量细胞进入的同时还伴有血管的增生,形成典型的肉芽组织。而对照组和细胞组血管增生不明显。手术后6周,对照组、细胞组和基因组都显现细胞到达移植物深部,甲苯胺蓝染色显示细胞组和基因组移植物的异染阳性,但对照组为阴性。手术后12周,对照组显现移植物内有大量的成纤维细胞,甲苯胺蓝染色轻度异染;而细胞组和基因组细胞量减少,显现类软骨性状,细胞排列与正常前交叉韧带接近。胶原分型的免疫组化染色三组均显示Ⅰ型胶原为主的移植物在植入后经过Ⅲ型胶原替代,后由Ⅲ型胶原为主逐步过渡到重新以Ⅰ型胶原为主。这个转换过程基因组最快,对照组最慢。手术后3、6和12周移植物的刚度和最大载荷与移植前相比均有明显下降,以3周下降最明显。术后6周,移植物刚度和最大载荷开始上升,细胞组和基因组上升明显,与对照组有显著性差异。结论:转染PDGF-BB基因的自体骨髓间充质干细胞有促进重建韧带血管化、加速韧带成熟的作用。     

人神经干细胞在宿主鼠脑内分化成神经元呈脑位点特征

目的研究人胎脑神经干细胞植入年幼大鼠脑后的成神经元分化作用,探讨神经干细胞替代治疗小儿脑病的可行性。方法自孕16周的胎脑组织分离培养出神经干细胞球,在小儿脑脊液中培养诱导分化以证明其分化潜能。将培养14d的神经干细胞球移植10d龄鼠的侧脑室内,于移植后第4、7、14天杀鼠取脑,切片,行人神经丝特异性标志的免疫荧光分析,显示神经元的分布和细胞形态。结果培养获得典型神经干细胞球,呈漂浮生长,在小儿脑脊液中能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。用抗人神经丝混合单抗检测移植物的成神经元分化,移植后的第4天,观察到阳性反应细胞在颗粒层表现为颗粒性细胞,锥体细胞层则出现长突起的锥体细胞,还有连接神经元样中间神经元,小脑内有单层排列的浦肯野细胞。对比各时间点的观察结果,阳性细胞分布位置未变。随着移植后天数的后延,阳性细胞数量呈减少趋势,但锥体细胞的突起明显加长。结论体外培养获得的人神经干细胞脑室途径移植年幼大鼠,在脑内发生迁移,并分化成形态上与其临近宿主细胞一致的神经元。提示宿主脑组织局部微环境在引导移植物分化成神经元中发挥了重要作用。     

Caspase在原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞的表达及其临床意义

目的检测caspase8和caspase3在原发性胆汁性肝硬化(PBC,primary biliary cirrhosis)患者外周血单个核细胞中的表达,探讨其与PBC疾病进展的相关性。方法采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法,检测30例PBC和30例正常对照者的外周血单个核细胞(PBMCs)中caspase8和caspase3的基因和蛋白表达。结果PBC患者PBMCs中的caspase8和caspase3的mRNA和蛋白的表达明显低于健康对照组(P<0.05)。结论PBC患者caspase8,3的表达与疾病的发生发展存在一定的相关性,可以为PBC的诊断和预防提供新线索。     

外周血来源的间充质干细胞在脱矿松质骨支架中的增殖和成软骨能力的实验研究

目的:研究外周血来源的间充质干细胞(PBMSCs)在3D多孔支架中的生物学行为。方法:将兔PBMSCs接种到猪脱矿松质骨(DCB)支架中,并以骨髓间充质干细胞(BMMSCs)以及关节软骨细胞(ACCs)进行对照,通过扫描电镜观察3D环境中的细胞形态和分布;通过Live/Dead染色检测细胞活性,Hoechst33258法检测DNA含量,二甲基亚甲基蓝(DMMB)法检测糖胺聚糖(GAG)含量,酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光法检测二型胶原(COL 2)表达、RT-PCR法定量分析软骨分化相关基因的表达。结果:扫描电镜(SEM)观察显示3种细胞在支架中均匀贴附,Live/Dead染色显示接种3天后3种细胞存活率相似(P>0.05),7天后3种细胞增殖能力以及DNA含量无明显差异(P>0.05)。PBMSCs和BMMSCs均较ACCs分泌更多GAG,但COL 2分泌量相似。此外,PBMSCs和BMMSCs的聚集蛋白聚糖(AGC),COL 2和碱性磷酸酶(ALP)等基因表达均明显上调(P<0.05);而ACCs组这些基因的表达显著下调(P<0.05)。MSCs组的COL 1表达趋于增加,而ACCs组中的表达趋于减少(P>0.05)。在成软骨诱导21天时,PBMSCs和BMMSCs的COL 2和ALP表达较ACCs升高(P<0.05),AGC和COL 1表达与ACCs相比无显著差异(P>0.05)。结论:外周血来源的间充质干细胞在异种脱矿松质骨支架中具有与骨髓间充质干细胞相似的良好的增殖和成软骨能力,但体外培养条件下依然存在肥大软骨细胞基因表达的现象,需要对培养条件进一步优化。