人骨髓基质细胞培养及向成骨细胞的诱导分化

目的研究人骨髓基质细胞体外培养及向成骨细胞诱导分化的实验方法。方法采用梯度离心法获得人骨髓基质细胞，细胞纯化后使用分化培养液将骨髓基质细胞向成骨细胞方向诱导分化。通过形态学观察、生化指标检测、细胞染色和矿化结节测定等方法，确定细胞的功能状态和分化程度。结果显微镜观察显示获得的人骨髓基质细胞生长状况良好，生化指标稳定；经分化培养液培养的细胞增殖速度明显减慢，生长状态平稳。细胞在分化培养过程中，上清液中碱性磷酸酶分泌量明显增加，细胞碱性磷酸酶染色明显浓染，随时间呈显著增强趋势；采用常规培养液培养的骨髓基质细胞，在汇合后不能形成明显的矿化结节。用分化培养液培养的人骨髓基质细胞，在14d时开始出现矿化结节，在21d时呈现密集的茜素红染色矿化结节。结论梯度离心法获得的人骨髓基质细胞生长情况良好，功能状态稳定；体外培养的人骨髓基质细胞在一定条件下可以向成骨细胞方向诱导分化，并具有良好的成骨细胞功能特征，可以满足进一步研究的需要。     

骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的体外构建研究

目的探讨骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的构建及基本生物学特性。方法建立大鼠绝经后骨质疏松症(PMOP)模型,分离培养骨质疏松大鼠骨髓基质细胞(O-r BMSCs),并以O-rBMSCs为种子细胞构建细胞膜片。通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜及透射电镜对细胞膜片进行形态学检测;以免疫组织化学染色检测细胞外基质相关蛋白的表达情况。结果成功建立了大鼠PMOP模型,体外分离培养的O-rBMSCs具有多向分化潜能。显微镜下可见细胞复层生长,采用富含维生素C的培养基连续培养10 d左右即可获得白色膜样结构,该细胞膜片具有较好的弹性,HE染色及扫描电镜观察发现O-rBMSCs膜片由多层细胞及丰富的细胞外基质组成。透射电镜下可观察到细胞间连接。免疫组织化学染色示O-rBMSCs膜片高表达Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白。结论 O-rBMSCs体外采用富含维生素C的培养基连续培养可构建细胞膜片,该细胞膜片富含细胞外基质,有望应用于骨质疏松机体的组织再生。     

成骨细胞接种于脱蛋白骨中修复骨缺损的实验研究

目的　探讨成骨细胞悬液接种于脱蛋白型松质骨中对骨缺损修复的能力。方法　以 2 8天胎兔颅骨为骨源 ,用酶消化法分离成骨细胞 ,取第 3代成骨细胞制成细胞悬液 ,以 5× 1 0 6 /ml浓度接种于具有三维空间结构的异种脱蛋白型松质骨中 ,然后用此复合物修复兔颅骨缺损 ,本组作为实验组 (共 1 0只 )。对照组Ⅰ (共 1 0只 ) ,仅用异种脱蛋白型松质骨修复兔颅骨缺损。对照组Ⅱ (共 1 0只 )为成骨细胞。对照组Ⅲ (共 1 0只 )为空白对照组。结果　 8周后 ,实验组 :X线片均显示骨缺损周围有骨小梁通过 ,支架上有钙化阴影。大体观察 :缺损周围与正常骨组织之间无分界线 ,植入物硬度接近于正常骨组织。组织学分析 :支架上有大量新骨形成 ,支架有部分被降解吸收。四环素荧光标记证实在支架上有新生骨。所有对照组均无新生骨 ,仅见缺损区有纤维样组织覆盖。结论　体外培养的成骨细胞经增殖后接种于异种脱蛋白型松质骨中可以用来修复骨缺损     

体外负压培养对骨髓间充质干细胞成骨活性的影响

目的：探讨体外负压培养对骨髓间充质干细胞（bone marrow derived stroma cells,BMSCs）成骨活性的影响。方法：取第3代BMSCs分为实验组和对照组,实验组进行间歇性负压培养,设置压力为17kPa,每次30min,每日4次,干预2周;对照组于普通CO2培养箱中常规培养。倒置显微镜下观察细胞形态,检测ALP活性,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原的表达,RT-PCR检测2周后以及终止负压后1、2、3d骨保护素（osteoprotegerin,OPG）mRNA和骨保护素配体（osteoprotegerin ligand,OPGL）mRNA表达水平。结果：诱导2周后,BMSCs呈现出显著的成骨细胞特性,与对照组比较,ALP活性显著增加,Ⅰ型胶原表达阳性,实验组细胞OPG mRNA表达水平显著提高,OPGL mRNA表达水平显著降低,且差异均有统计学意义（P〈0.05）。负压终止后3d,两组细胞OPG mRNA和OPGL mRNA表达水平差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：体外负压培养可以提高BMSCs成骨活性。     

Effects of epidermal growth factor on osteoblastic cellsin vitro

Summary The effect of epidermal growth factor (EGF) on clone MC3T3-El cells that have osteoblastic activity was examined by phase-contrast microscopy and electron microscopy; hydroxyproline content, collagen synthesis, collagen pattern, and alkaline phosphatase (ALP) activity were also determined. We found that EGF (0.4 ng/ml) transformed the cells from their normal polygonal shape to a spindle-like morphology by 8 h. This hormone also caused dose-related suppression of hydroxyproline content and ALP activity which was detectable 2 days and 1 day, respectively, after EGF addition. Indomethacin did not affect hydroxyproline content and ALP activity, suggesting that the effect of EGF on the cells may not be mediated by prostaglandins. Epidermal growth factor at concentrations of 2 to 50 ng/ml significantly decreased collagen synthesis in the cells, whereas protein synthesis was stimulated. Electron microscopy demonstrated that collagen fiber formation was also reduced by EGF; an immature type of fibril was observed compared with the typical cross-striated one in the controls. Moreover, the hormone treatment also resulted in the appearance of type III collagen in addition to the type I already present in the cells. These suppressive effects of EGF on MC3T3-El cellsin vitro suggest that this hormone may be involved in bone remodellingin vivo as well.     

Effects of aluminum on rat bone cell populations

Summary Aluminum (Al) loading is associated with reduced bone formation and osteomalacia in human and certain animal models. However, uncertainty exists as to the cellular effect(s) of Al as both inhibition and stimulation of osteoblast proliferation have been reported. Furthermore, the extent to which Al affects osteoprogenitor cell populations is unknown. To determine the cellular effects of Al in the rat, an animal model in which Al bone disease has been produced, we compared thein vitro effect of 10–50 Al on the proliferation and hydroxyproline collagen formation of marrow osteoprogenitor stromal cell populations and perinatal rat calvarial osteoblasts. In subconfluent cultures, Al suppressed proliferation of both marrow fibroblast-like stromal cells and calvarial osteoblasts. In confluent cultures, however, Al selectively stimulated periosteal fibroblast and osteoblast DNA synthesis and collagen (hydroxyproline) production, both in the presence or absence of 1,25-dihydroxyvitamin D. Osteocalcin was not detected in osteoblast-conditioned media or extracellular matrix. These observations suggest that the bone formation defect associated with Al toxicity in growing rats may be a function of impaired patterns of osteoprogenitor/osteoblast proliferation. Furthermore, the Al-stimulated increase in collagen formation is consistent with the development of osteomalacia in Al-toxic humans and animals. The mechanism by which Al stimulated DNA synthesis and collagen production in more mature cultures awaits further study.     

淫羊藿甙对MC3T3-E1细胞Smad1,5作用的实验研究

目的 检测淫羊藿甙(icariin,ICA)对MC3T3-EI中Smad1,5 mRNA及蛋白的影响.方法 DMEM高糖、胎牛血清培养下的MC3T3-E1细胞按ICA刺激浓度0、10、40及80 ng/ml分为四组,各组接种于6孔板中,接种细胞数目约为3×105个/孔,分别于给药后24、48及72 h,用半定量RT-PCR技术测定Smad1,5 mRNA的量,以Western blot评价Smad1,5蛋白的量.并于给药72h后用免疫组织化学定位Smad1,5蛋白的表达.采用SPSS 13.0软件进行统计学分析.结果 RT-PCR显示ICA刺激24 h后,0、10、40、80 ng/ml各组Smad1.5 mRNA量的表达无统计学差异;刺激48 h后,0 ng/ml组Smad1mRNA表达量检出极少,Smad5 mRNA未检出;至72 h时,0 ng/ml组二者均未检出,而10、40、80 ng/ml各组在刺激48、72 h时,Smad1,5 mRNA保持较高水平,各组Smad1,5 mRNA的表达量较0 ng/ml组具有统计学意义.Westem blot蛋白印迹显示10、40、80 ng/ml各组的Smad1蛋白表达于不同时间点较0ng/ml组明显增加,0 ng/ml组仅于刺激72 h后少量检出.Smad5蛋白表达除0 ng/ml组外,于10、40、80ng/ml各组在不同时间点均有检出,较0 ng/ml组具有统计学意义.免疫组织化学显示10、40、80 ng/ml组,于胞质及核内Smad1,5蛋白的表达较0 ng/m组均增多.结论 淫羊藿甙可能通过上调Smad1,5mRNA及蛋白的表达来促进成骨细胞分化.     

淫羊藿甙对成骨细胞Smad4 mRNA作用的实验研究

目的检测淫羊藿甙对体外培养的成骨细胞MC3T3-E1中Smad4mRNA的影响。方法用0、10、20、40ng/ml的淫羊藿甙刺激MC3T3-E1细胞。用倒置相差显微镜观察细胞生长情况。通过四甲基噻唑蓝(MTT)法测绘细胞生长曲线和计算细胞群体倍增时间;描述刺激MC3T3-E1细胞的增殖能力。用速率分光光度法测定ALP的含量,免疫组织化学法观察Ⅰ型胶原的产生,用以判断细胞的分化情况。用RT-PCR测定Smad4mRNA的数量。结果10、20ng/ml浓度淫羊藿甙可使MC3T3-E1细胞的生长曲线明显上移(P<0.01);0、10、20和40ng/ml组群体倍增时间分别为(39.37±2.35)h、(26.76±1.78)h、(29.30±2.12)h和(36.35±2.34)h,各组间比较差异有统计学意义(P<0.01);0、10ng/ml可使MC3T3-E1细胞产生ALP和Ⅰ型胶原量增加,刺激ALP作用呈现时间和剂量的依赖性(P<0.01);RT-PCR显示10、20ng/ml浓度淫羊藿甙可以刺激MC3T3-E1细胞Smad4mRNA的数量增加。上述作用以10ng/ml浓度最强(P<0.01)。结论淫羊藿甙刺激成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化,可能是通过提高MC3T3-E1细胞Smad4mRNA的量而产生作用。     

蛇床子素对体外培养成骨细胞增殖与分化成熟的影响

目的:研究蛇床子素对体外培养大鼠成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖与分化成熟的影响。方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法获得成骨细胞,培养于含10%FBS的MEM培养液中,3d后首次换液,铺满90%皿底后传代培养。增殖分析采用96孔板MTT法分析,加入培养液中终浓度分别为1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L的蛇床子素;分化分析采用24孔板,于成骨性诱导培养第3、6、9、12、15天分别测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,第8天用免疫组织化学法观察Ⅰ型胶原合成情况,第12天进行ALP组织化学染色,第14天进行茜素红染色和钙化结节计数。结果:终浓度为1×10-4mol/L蛇床子素对细胞增殖有抑制作用,而1×10-5mol/L浓度虽对ROB增殖无明显影响,但能显著提高ALP活性,促进Ⅰ型胶原表达,并增加钙化结节数量。结论:1×10-5mol/L蛇床子素能促进ROB分化成熟,应为中药蛇床子抗骨质疏松的有效成分。     

强骨宝方对体外培养成骨细胞影响的实验研究

目的:探讨不同浓度强骨宝方提取液直接添加对体外培养成骨细胞增殖、分化与矿化功能的影响。方法:采用胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶消化法从2只1~2日龄SD乳鼠颅盖骨中分离出成骨细胞,鉴定细胞并传代培养后,分为对照组与4个实验组,实验组分别用终浓度为100、50、10、5μg/ml的强骨宝方提取液加入成骨细胞培养体系,对照组用不含强骨宝方提取液的培养基培养,应用MTT比色法、ALP含量测定、矿化结节形成等分别观察其对成骨细胞增殖、分化及矿化能力的影响。结果:100、50及10μg/ml浓度的强骨宝方提取液均具有促进体外成骨细胞增殖、分化与矿化的作用,以100μg/ml与50μg/ml促进作用最强。结论:每毫升含生药2g的强骨宝方提取液,pH=7.0,50μg/ml的添加浓度可能最适合于体外培养成骨细胞的增殖、分化及矿化成骨能力。     

体外培养成骨细胞的研究进展

随着体外细胞培养技术的发展,人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞,研究表明培养出的成骨细胞具有良好的生物学特性,在不同环境下可以形成骨组织,联合支架的应用,构建组织工程骨,将其植入体内修复骨缺损.现就成骨细胞的来源、分化调控因子、复合移植及中医药方面的研究进展作一综述.     

成骨生长肽对成骨细胞样细胞的成骨影响

目的 成骨生长肽（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅ,ＯＧＰ）是新近发现的具有促成骨作用和刺激造血的多肽类生长因子。本研究旨在成骨生长肽对兔成骨细胞样细胞的促成骨作用。方法 兔颅盖骨成骨细胞样细胞分成实验组和对照组培养,实验组加成骨生长肽。分别测定细胞的Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ表达,碱性磷酸酶活性,胶原和钙含量,胶原和钙含量。结果 培养７,１０ｄ,２时实验组细胞的Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ高度表达,     

骨膜成骨细胞修复骨缺损的实验研究

为了进一步验证骨膜成骨细胞培养建立“成骨细胞库”用于修复骨缺损的可能性，取８只家兔胫前骨膜进行成骨细胞分离培养，体外繁殖后，以明胶海绵为载体，回植于自体的桡骨缺损部。对侧以明胶海绵吸附Ｈａｎｋｓ液为对照。分别在细胞植入后第２，４，８和１２周拍摄Ｘ线片，按Ｌａｎｅ方法计分，评价其骨缺损修复愈合的能力。结果表明，植入的成骨细胞因自身的成骨能力而促进骨缺损的愈合。提示自体“成骨细胞库”的建立和移植在骨缺损的修复中是一种可以继续探索的方法     

成人骨髓成骨细胞体外培养

目的　研究成人骨髓基质干细胞在体外培养条件下的成骨能力及生物学特性 ,探讨简便易行的成人成骨细胞体外培养方法 ,为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法　因诊断需要抽取健康成人骨髓组织 ,在含体积分数为 10 %胎牛血清的DMEM培养基中 ,置于 37℃、含体积分数为 5 %的CO2 湿化空气孵箱中培养 ,传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养 ,用倒置相差显微镜观察、HE染色、扫描与透射电镜观察增殖和分化情况 ,并测定培养细胞的生长曲线 (MTT法 )、碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力。结果　采用本法在体外培养的成人成骨细胞生长良好 ,生化指标稳定 ,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。结论　本实验方法取材方便 ,所培养的细胞具有成骨细胞的特性 ,可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法     

壳聚糖-明胶网络/羟基磷灰石复合材料支架的研究--成骨细胞培养

目的　研究大鼠颅骨成骨细胞在壳聚糖 -明胶网络 /羟基磷灰石 (CS- Gel/ HA)复合材料支架上的生长情况。方法　将原代培养大鼠颅骨成骨细胞第 3代 ,密度为 1.0 1× 10 6 / m l悬液 ,种植于孔隙率分别为85 .2 0 %、90 .4 0 %和 95 .80 %的 CS- Gel/ HA支架材料中 ,利用细胞计数法检测种植后 3天 ,1、2及 3周的细胞增殖曲线 ,采用 HE和 von Kossa染色方法观察细胞生长、骨样组织形成和矿化沉积情况。结果　大鼠颅骨成骨细胞在孔隙率为 85 .2 0 %的支架中增殖较慢 ,在孔隙率为 90 .4 0 %和 95 .80 %的 CS- Gel/ HA复合材料支架上生长良好 ,增殖较快 ,周围分泌有大量细胞外基质 ,3周时局部已出现骨样组织 ,且细胞 /支架结构物有利于钙质沉积。结论　CS- Gel/ HA复合材料支架有望成为培养自体成骨细胞的材料 ,以重建新的骨组织     

不同剂量的X线对小鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的 探讨不同剂量的X线对小鼠成骨细胞增殖与分化的影响. 方法 将体外诱导培养的小鼠成骨细胞分为4组(n=3):对照组、0.1Gy组、0.5 Gy组、1.0 Gy组,4组细胞接种后24 h分别予以0、0.1、0.5、1.0 Gy剂量的X线照射,检测照射后l～3d细胞的增殖、细胞周期、凋亡情况,以及照射后7～14d碱性磷酸酶(ALP)、矿化结节形成与成骨相关基因的表达. 结果 对照组、0.1 Gy组、0.5 Gy组、1.0Gy组成骨细胞的细胞周期和凋亡变化、细胞增殖比较差异均无统计学意义(P＞0.05).X线照射后培养7、10、14 d,0.5 Gy组和1.0Gy组细胞外ALP活性均较对照组高,差异均有统计学意义(P＜0.05).X线照射后14d,0.5 Gy组和1.0 Gy组矿化结节数目明显多于0.1 Gy组和对照组.1.0 Gy组骨钙素和核心结合因子α1 mRNA的表达较对照组增加,0.5Gy组和1.0 Gy组骨保护素mRNA/核因子-kB配体受体激活物mRNA比率均较对照组大,以上项目比较差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 一定剂量范围(0.5～1.0 Gy)的X线照射在不影响成骨细胞增殖的情况下,可以促进成骨细胞的分化.     

兔活骨组织在体外促同种成骨细胞与支架粘附的实验研究

目的为提高体外构建组织工程化活性骨的质量,探索一种促进种子细胞与支架粘附的方法。方法应用三蒸水浸泡新鲜兔骨碎粒5h后与L-聚乳酸(PLLA)/聚磷酸钙纤维(CPPf)复合支架共培养48h作为实验组;未进行共培养的L-聚乳酸(PLLA)/聚磷酸钙纤维(CPPf)复合支架作为对照组。接种成骨细胞24h后应用扫描电镜观察细胞-支架复合体内粘附细胞情况,应用MTT法测接种细胞上架率。结果实验组的接种细胞上架率显著高于对照组(P<0.01),扫描电镜下实验组支架内粘附细胞明显多于对照组。结论兔活骨组织在体外可以促进同种成骨细胞与支架的粘附,从而提高体外构建活性骨的质量。     

Culture of osteoblasts on bio-derived bones

Thegoalofrepairingbonedefectsistofacilitatenewbonesgrowingintotheosseousdefects.Therefore, thematerialsusedforboneregenerationshouldsupporttheattachmentandproliferationofosteoblasts. Avarietyofbio derivedandchemosyntheticmaterialsareavailableforthesurgicaltreatmentofalveolarboneloss.1 Autogenousbonegraftsanddemineralizedfreeze driedboneallografts(DFDBA) fromhumancadavershavebeenusedwithadegreeofsuccess. However, neitherisideal. Autogenousbonegraftsinvolveanadditionalproceduretoharvestthebon…     

p38MAPK与 ERK1/2的协同效应及对成骨细胞分化的调控

 目的探讨骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中 p38MAPK与 ERK1/2的协同效应及其机制。方法以成骨细胞分化添加剂诱导小鼠 BMSCs向成骨细胞分化,测定碱性磷酸酶活性和钙沉积量。检测磷酸化 p38MAPK和磷酸化 ERK1/2(p-ERK1/2)的表达水平评估通路的激活状况。以 SB203580或 PD98059阻断 p38MAPK或 ERK1/2通路,观察对成骨细胞分化的影响。以 SB203580或亚砷酸钠阻断或激活 p38MAPK通路,观察 p-ERK1/2的变化。以冈田酸抑制蛋白磷酸酯酶 2A(protein phosphatases type 2A,PP2A)活性,观察 p-ERK1/2的变化及对成骨细胞分化的影响。通过免疫共沉淀实验观察 PP2A和 ERK1/2间的结合及 SB203580对结合的影响。结果成骨细胞分化添加剂诱导 BMSCs向成骨细胞分化的过程伴有 ERK1/2和 p38MAPK通路的激活, SB203580剂量±赖性抑制成骨细胞分化,PD98059剂量±赖性增强成骨细胞分化。 SB203580使 p-ERK1/2表达增加,亚砷酸钠减弱其表达。冈田酸使 p-ERK1/2表达增加,并使成骨细胞分化受到抑制。 PP2A可直接与 ERK1/2结合,SB203580使 PP2A与 ERK1/2的结合减弱。结论 p38MAPK可通过 PP2A与 ERK1/2产生协同效应,并调节 BMSCs向成骨细胞分化。     

软骨细胞外基质源性取向支架与骨髓基质干细胞体外软骨组织工程的初步研究

目的 制备关节软骨细胞外基质源性取向支架,观察其对体外培养的骨髓基质干细胞分布排列的影响,探索其用于修复关节软骨缺损的可行性.方法 收集天然猪关节软骨,在PBS溶液中超微湿法粉碎关节软骨,利用差速离心收集细胞外基质悬液;低温超速离心收集沉淀,制备成2%～3%悬液;采用定向结晶与冷冻干燥技术制备取向支架,应用紫外交联及碳化二亚胺交联.光学显微镜及扫描电镜观察支架的形态结构,冰冻切片后组织化学染色对支架进行定性分析;生物力学方法检测支架的力学特性.分离培养兔骨髓基质干细胞,PKH26标记,接种到支架上体外软骨诱导培养,倒置荧光显微镜及扫描电镜观察培养3 d内种子细胞在支架内的黏附、分布及排列方式.结果 制备的支架材料具有垂直取向排列的孔道结构,软骨细胞外基质特异性染色阳性,纵向压缩弹性模量为(2.02±0.02)MPa,横向压缩弹性模量为(0.264±0.16)MPa,具有各向异性的力学特点.体外培养显示骨髓基质干细胞广泛均匀地分布在支架内部,并且在支架材料表层呈平行排列,深层呈柱状排列,类似于天然软骨组织中细胞的排列方式.结论 以关节软骨细胞外基质材料制备的取向性组织工程支架,在生化组成和结构上仿生天然关节软骨细胞外基质,是一种较为理想的软骨组织工程支架.