小鼠IL-3 cDNA逆转录病毒载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

为了探讨放射损伤小鼠IL-3基因治疗可能性,本文作者将小鼠IL-3cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上。将重组的逆转录病毒载体用电穿孔法和磷酸钙共沉淀法转染双向包装细胞系PA317,经新霉素类抗菌素G418选择,得到了多个产病毒细胞克隆。用含有复制缺陷病毒的产病毒细胞培养上清转化NIH3T3细胞,得到了数个自发分泌IL-3的克隆。在去掉G418,传代15代,约2个月后,这些克隆分泌IL-3的能力没有明显的变化。     

小鼠IL－3 cDNA转化细胞移植体内表达的初步研究

随着基因治疗技术的发展和多个细胞因子基因的克隆，人们提出了供细胞因子的基因治疗的设想，以期为肿瘤、老年性痴呆、严重的造血功能障碍等这样一类难治疾病的治疗另辟蹊径。为改善放射损伤小鼠受抑制的造血功能，我们采用基因治疗的方法，将小鼠ＩＬ－３基因ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体重组，转染包装细胞ＰＡ３１７，用其分泌的含ＩＬ－３ｃＤＮＡ的复制缺陷逆转录病毒感染、转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞，从中筛选可在体外分泌ＩＬ－３的克隆，将可分泌ＩＬ－３的细胞种植到放射损伤小鼠体内后发现：受体小鼠血清中检出了ＩＬ－３的活性；其外周血白细胞计数升至５５万／ｍｍ３，以成熟中性粒细胞为主；肝、脾脏内有大量各个分化阶段的中性粒细胞。这些结果表明：可以利用基因治疗技术，在体内表达ＩＬ－３，改善机体的造血功能。     

小鼠IL—3 cDNA转化细胞移植体内表达的初步研究

随着基因治疗技术的发展和多个细胞因子基因的克隆，人们提出了供细胞因子的基因治疗的设想，以期为肿瘤、老年性痴呆、严重的造血功能障碍等这样一类难治疾病的治疗另辟蹊径。为改善放射损伤小鼠受抑制的造血功能，我们采用基因治疗的方法，将小鼠ＩＬ－３基因ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体重组，转染包装细胞ＰＡ３１７，用其分泌的含ＩＬ－３ ｃＤＮＡ的复制缺陷逆转录病毒感染、转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞，从中筛选可在体外分泌ＩＬ－３     

逆转录病毒介导的IL－2和TNF－α融合基因在卵巢癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞生长的影响

ＩＬ－４和ＴＮＦ－α是引人注目的抗肿瘤活性因子，两者在抗肿瘤及免疫调节方面具有协同作用。我们利用逆转录病毒载体Ｘｄ１构建了插入ＩＬ－２和ＴＮＦ－α融合基因的重组逆转录病毒载体ＸｄＦ，融合基因包括编码ＩＬ－２前导肽和ＩＬ－２和ＴＮＦ－α成熟肽的序列。重组载体用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法引入病毒包装细胞ＰＡ３１７，挑选Ｇ４１８抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得一滴度为１×１０￣４ＣＦＵ／ｍｌ的高滴度克隆。超速离心浓缩这一重组病毒上清，转导人卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３，经Ｇ４１８筛选获得抗性克隆。ＰＣＲ可从融合基因转导的细胞ＤＮＡ中扩增出１．１ｋｂ的融合基因片断，证明目的基因完整的整合在细胞的基因组ＤＮＡ中，测其上清中的ＩＬ－２和ＴＮＦ－α活性结果显示：ＩＬ－２的活性为８－１５Ｕ／１０￣６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ，ＴＮＦ－α的活性为１５０－４００Ｕ／１０￣６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ。这一结果表明逆转录病毒介导的融合基因可以在卵巢癌细胞中获得有效表达，表达的融合基因产物在体内和体外部对肿瘤细胞的生长具有抑制作用。     

逆转录病毒介导的β－珠蛋白基因在小鼠骨髓单核细胞的表达

从小鼠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ股骨分离得到骨髓单核细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ，ＢＭＭＣ），并在体外建立了ＢＭＭＣ细胞培养体系。将携带有人β－珠蛋白基因及其增强子的逆转录病毒载体（Ｎ２ＡβＥ３６）经ＤＮＡ磷酸钙共沉淀转染单向性包装细胞系（ψ－２）收集抗Ｇ４１８阳性ψ－２细胞克隆的病毒上清，感染体外培养的ＢＭＭＣ，同时加入白介素－３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３，ＩＬ－３）、白介素－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）、红细胞生成素（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｐｏ）等造血调节因子以促进造血细胞的增殖及提高基因转移的效率。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析证实在小鼠ＢＭＭＣ中具有β－珠蛋白基因的整合与表达。     

IL—11 cDNA—逆转录病毒载体的构建及亲本细胞系的转染

本文采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导法，将构建的带有白细胞介素１１（ＩＬ－１１）ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体导入制备人Ｂ细胞杂交瘤的亲本细胞系ＨＦ２、Ａｇ８．６５３和Ｓｐ２／０中，Ｇ４１８筛选稳定表达的抗性细胞，经克隆化后获得稳定分泌ＩＬ－１１的新型亲本细胞系。     

白细胞介素4基因转移的肿瘤细胞体外生物学特性及体内致瘤性的研究

观察了白细胞介素４（ＩＬ－４）基因转移的肿瘤细胞体内致瘤性的变化。构建了含５００ｂｐ的小鼠ＩＬ－４ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－４．用该表达载体将ＩＬ－４基因转移至小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及ＩＬ－４活性检测，获得了高分泌ＩＬ－４的黑色素瘤细胞克隆株并经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹鉴定，将其接种于小鼠皮下后观察到肿瘤生长缓慢、小鼠存活期延长，表明高分泌ＩＬ－４的细胞克隆株体内致瘤性显著下降。该结果为进一步研究肿瘤的ＩＬ－４基因治疗打下了基础。     

IL-2基因修饰成纤维细胞对肝癌荷瘤小鼠的治疗实验

目的研究双顺反子逆转录病毒载体介导ＩＬ－２基因转导成纤维细胞对小鼠肝癌的治疗作用。方法利用双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＩＬ－２将ＩＬ－２基因转导小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，然后将分泌ＩＬ－２的成纤维细胞与６０Ｇｙγ射线照射的肝癌Ｈ２２细胞皮下植入三天前５×１０５或２．２×１０５肝癌Ｈ２２细胞皮下注射的ＢＡＬＢ／ｃ鼠。结果分泌ＩＬ－２的成纤维细胞治疗组能明显增加荷瘤小鼠的生存率（Ｐ＜０．０２５），抑制肿瘤生长（Ｐ＜０．０５），在肿瘤植入第７０天无肿瘤形成的小鼠再次注射１×１０６Ｈ２２细胞仍然不发生肿瘤。５１Ｃｒ释放试验表明来自照射Ｈ２２与分泌ＩＬ－２成纤维细胞混合液注射的小鼠脾细胞与５１Ｃｒ标记的Ｈ２２细胞共培养后，５１Ｃｒ特异释放明显高于对照组（Ｐ＜０．０５）。结论实验结果表明ＩＬ－２基因修饰的成纤维细胞能诱导针对肝癌的特异免疫反应。     

TNF基因转染后分泌不同水平TNF的LAK细胞克隆增殖能力和杀？…

在逆转录病毒介导下将ＴＮＦ基因转染入小鼠ＬＡＫ细胞中，采用Ｇ４１８抗性筛选和有眼稀释法，将ＬＡＫ细胞克隆化，并筛选出３株分泌不同水平ＴＮＦ的ＬＡＫ细胞克隆。结果表明，这３株ＬＡＫ细胞克隆分泌的ＴＮＦ水平、增殖能力和杀伤生均显著高于对照组ＬＡＫ细胞。而高分泌株的ＬＡＫ细胞克隆，其增殖能力和杀伤活性最高；中分泌株次之；低分泌株相对较低。抗ＴＮＦ单抗可显著抑制此３株ＬＡＫ细胞体外杀伤活性，表明基杀伤活性     

IL—11 cDNA－逆转录病毒载体的构建及亲本细胞细胞系的转染

本文采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导法，将构建的带有白细胞介－素１１（ＩＬ—１１）ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体导入制备人Ｂ细胞杂交瘤的亲本细胞系ＨＦ２、ＡＰ８．６５３和ＳＰ２／０中，Ｇ４１８筛选稳定表达的抗性细胞，经克隆化后获得稳定分泌ＩＬ－１１的新型亲本细胞系。     

逆转录病毒介导的人TNF在人肝癌细胞系（SMMC）中的表达

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含人ＴＮＦａ基因的重组逆转录病毒载体Ｌ－ｔｎｆＳＮ。磷酸钙沉淀法将重组载体引入病毒包装细胞ＰＡ３１７，挑选Ｇ４１８抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。应用这一重组病毒感染人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１，经Ｇ４１８筛选获得抗性克隆。ＰＣＲ可从转导的细胞ＤＮＡ中扩增出ＴＮＦａ基因片段，提示目的基因完整地整合在细胞基因组中。测定转导细胞培养上清中ＴＮＦａ活性，结果显示ＴＮＦａ有相对稳定的表达（１５０～３７０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／２４小时）。实验还表明转导细胞的体外生长能力无明显变化，但是其在裸鼠中的致瘤性却明显降低，提示逆转录病毒介导ＴＮＦａ基因对人原发性肝场可能有一定的治疗作用。     

抗人重组IL－1单克隆抗体的制备及初步鉴定

以重组人ＩＬ－１免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞６５３融合，得到一组分泌抗人重组ＩＬ－１单克隆抗体的杂交瘤细胞。对其中的３株ＹＡ１３３、ＹＡ１４０和ＹＡ１６３进行了初步鉴定；抗体类别为ＩｇＧ，亚类均为ｌｇＧｌ；免疫转印显示，３株抗体均能特异性地识别分子量为１７．５ｋＤ的ＩＬ－１蛋白条带；ＥＬＩＳＡ法证明与其它细胞因子如：ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＤ－α、ＩＦＮ－γ和ＧＭ－ＣＳＦ均无交又反应；放射免疫测定结果证实，３株抗体分别识别ＩＬ－１分子上两个不同的抗原决定簇。     

瘤体内注射脂质体包裹的IL—2基因的抗肿瘤作用及其局部…

脂质体可以介导体内的细胞因了基因治疗，将脂质体包裹的ＩＬ－２基因直接注射到小鼠黑色素瘤（Ｂ１６－Ｆ１０）瘤体内，结果发现，肿瘤的生长明显受到抑制，部分小鼠的瘤体完全消退，存活期明显延长，从瘤体中分离的肿瘤细胞经Ｇ４１８筛选后产生阳性克隆，其上清中分泌有ＩＬ－２，肿瘤局部浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）具有较高的杀伤活性，提示瘤体内注射质包裹的ＩＬ－２基因后，可增强肿瘤细胞的免疫原性，激活瘤体具部的抗肿瘤免     

人IFN—γcDNA逆转录病毒载体的构建及其在Lewis肺癌细胞的稳…

应用分子克隆技术构建了含８４３ｂｐ的全长人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ的逆转录病毒表达载体Ｎ２／ＩＦＮ，采用磷酸钙共沉淀方法转染包装细胞ΨＣＲＥ和ΨＣＲＩＰ，并能得到较高滴度的含病毒颗粒上清。然后应用ΨＣＲＩＰ细胞培养上清的复制缺陷性病毒颗粒感染Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞（ＬＬＣ），经过Ｇ４１８筛选克隆得到了一株能稳定分泌ＩＦＮ（６４００Ｕ／ｍｌ）的克隆，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹证实ＩＦＮ－γ基因已插入ＬＬＣ基因组。结     

白细胞介素2基因转移的肿瘤细胞克隆的建立及其体内外生长特性的研究

为了开展ＩＬ－２基因转移后免疫原性增强的新型瘤苗抗肿瘤作用的研究，须首先获得ＩＬ－２基因转移后、能够高分泌ＩＬ－２的肿瘤细胞并确定其生长特性。本室构建了含５６３ｂｐ的小鼠ＩＬ－２全长ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２，采用磷酸钙ＤＮＡ共沉淀法将ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２转移入Ｂ１６黑色素瘤细胞中，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及活性检测，获得一株高分泌ＩＬ－２（５０６Ｕ／ｍｌ）克隆，并经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法证实ＩＬ－２基因已转入该克隆中。结果表明ＩＬ－２基因转移的肿瘤细胞体外生长能力没有明显变化，但体内致瘤原性显著下降，从而为制备新型瘤苗打下了基础。     

TNF基因转染后分泌不同水平TNF的LAK细胞克隆增殖能力和杀伤活性的比较

在逆转录病毒介导下将ＴＮＦ基因转染入小鼠ＬＡＫ细胞中，采用Ｇ４１８抗性筛选和有限稀释法，将ＬＡＫ细胞克隆化，并筛选出３株分泌不同水平ＴＮＦ的ＬＡＫ细胞克隆。结果表明，这３株ＬＡＫ细胞克隆分泌的ＴＮＦ水平、增殖能力和杀伤活性均显著高于对照组ＬＡＫ细胞。而高分泌株的ＬＡＫ细胞克隆，其增殖能力和杀伤活性最高；中分泌株次之；低分泌株相对较低。抗ＴＮＦ单抗可显著抑制此３株ＬＡＫ细胞体外杀伤活性，表明其杀伤活性升高是由基因转染后所表达的ＴＮＦ介导的，所表达ＴＮＦ水平越高，其增殖能力和杀伤活性越高。     

抗人重组IL—1单克隆抗体的制备及初步鉴定

以重组人ＩＬ－１免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞６５３融合，得到一组分泌抗人重组ＩＬ－１单克隆抗体的杂交瘤细胞。对其中的３株 ＹＡ１３３、ＹＡ１４０和ＹＡ１６３进行了初步鉴定，抗体类别为ＩｇＧ，亚类均为ＩｇＧ１，免疫转印显示，３株抗体均能特异性地识别分子量为１７．５ｋＤ的ＩＬ－１蛋白条带，ＥＬＩＳＡ法证明与其它细胞因子如：ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＤ－α，ＩＦＮ－γ和ＧＭ－ＣＳＦ均无     

人类bcl—2cDNA在NIH／3T3细胞中的表达

将０．９１ｋｂ的含有完整开放阅读框的人类ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ以正向克隆于逆不病毒载体ｐＬ－ＸＳＮ的ＥｃｏＲ１位点，经ＰＡ３１７细胞包装后感染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞，筛选出Ｇ４１８抗性克隆，经免疫印迹证实人类ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ在ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中获得了表达，这一表达人类Ｂｃｌ－２蛋白的哺乳类细胞模型的建立探讨ｂｃｌ－２的作用机制及其与其它基因间关系的研究奠定了基础。     

人IFN－γcDNA逆转录病毒载体的构建及其在Lewis肺癌细胞的稳定表达

应用分子克隆技术构建了含８４３ｂｐ的全长人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ的逆转录病毒表达载体Ｎ２／ＩＦＮ，采用磷酸钙共沉淀方法转染包装细胞ΨＣＲＥ和ΨＣＲＩＰ，并能得到较高滴度的含病毒颗粒上清。然后应用ΨＣＲＩＰ细胞培养上清的复制缺陷性病毒颗粒感染Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞（ＬＬＣ），经过Ｇ４１８筛选克隆得到一株能稳定分泌ＩＦＮ（６４００Ｕ／Ｍ）的克隆，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹证实ＩＦＮ－γ基因已插入ＬＬＣ基因组。结果表明，该逆转录病毒载体系统能有效地介导基因转移，并能使目的基因在靶细胞稳定表达。结果为肿瘤基因治疗及制备新型肿瘤疫苗奠定了基础。     

白细胞介素11基因治疗促进造血的实验研究

白细胞介素１１是一种具有广泛生物学功能的造血生长因子，体内体外实验均显示ＩＬ－１１具有显著的造血促进作用。为了探讨ＩＬ－１１基因治疗应用于造血功能低下疾病的可能性，构建了含人ＩＬ－１１ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体，并转染小鼠成纤维系ＮＩＨ－３Ｔ３，经是筛选获得３株表达ＩＬ－１１ 转染细胞亚克隆。