“劳倦过度、房室不节”肾阳虚小鼠模型睾丸基因芯片研究

目的:应用基因芯片探讨劳倦过度、房室不节肾阳虚小鼠模型睾丸基因改变,从基因水平上探讨肾阳虚证和肾主生殖的现代科学机制。方法:连续4周采用雄雌鼠比例1:6同笼喂养和雄鼠每日游泳,建立劳倦过度、房室不节肾阳虚小鼠模型。用小鼠全基因组Oligo芯片检测对照组和模型组睾丸基因,以二者荧光信号相对强度比值≥2和≤0.5筛选差异表达基因,查阅北京博奥生物分子注释系统,进行基因功能分类。结果:成功建立劳倦过度、房室不节肾阳虚小鼠模型,绘制了对照组与模型组基因表达谱比较的散点图,筛选出差异表达基因,包括上调2425个,下调3080个。其中上调基因前百位中已知基因41个,下调基因前百位中已知基因62个,主要涉及细胞结构/功能、物质/能量代谢、信号转导/传递、炎症/免疫、细胞凋亡、转录/翻译、增殖/分化及细胞周期等。结论:肾阳虚小鼠睾丸基因发生广泛的改变,从基因水平对肾阳虚证的本质及肾主生殖的理论做出了一些诠释。     

"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠模型脑基因芯片研究

目的:应用基因芯片探讨"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠模型脑基因改变,试图说明传统中医建模方法及其肾阳虚表现,力求从基因水平上揭示肾阳虚的本质。方法:采用雄雌鼠比例1:6同笼喂养和雄鼠每日游泳4周,以诱导"劳倦过度、房室不节"肾阳虚鼠模型。用36K mouse genome array鼠脑芯片检测正常对照组和肾阳虚模型组鼠脑基因,并以二者荧光信号相对强度比值≥2和≤0.5筛选差异显著基因,并进一步查阅北京博奥生物分子注释系统,进行基因功能归类。结果:诱导成功"劳倦过度、房室不节"肾阳虚鼠模型,绘制了对照组与模型组基因表达谱比较的散点图。共筛选出186个差异表达基因,其中上调基因150个,下调基因36个。其中共有已知基因98个,上调已知基因71个,下调已知基因27个。下调基因中主要为生长激素、泌乳素、促性腺激素、黑色素和脑脂肪酸结合蛋白(B-FABP)相关基因;上调基因主要为炎症/免疫、促细胞凋亡相关基因以及影响多巴胺生成的限速酶、影响凝血纤溶机制和精子发育代谢的相关基因。结论:通过基因芯片对肾阳虚动物模型的检测,从基因水平上对肾阳虚证的本质做了一些诠释。     

金匮肾气丸对劳倦过度 房室不节肾阳虚小鼠模型影响的脑基因芯片研究

目的:本研究旨在应用基因芯片探讨金匮肾气丸对"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠模型脑基因改变,以期从基因水平上研究其药物作用机理。方法:对照组、造模组和治疗组(给予金匮肾气丸)雄性小鼠各为10只、15只和10只。3组均予正常喂养,对照组和造模组每天灌胃蒸馏水0.5mL/只,治疗组每天灌胃金匮肾气丸混悬液0.5mL/只,造模组和治疗组采用雄雌鼠比例1:6同笼喂养和雄鼠每日游泳30～40min达4周,以诱导产生"劳倦过度、房室不节"肾阳虚证。用36Kmousegenomearray鼠脑芯片检测正常对照组和肾阳虚模型组鼠脑基因,并以二者荧光信号相对强度比值≥2和≤0.5筛选差异显著基因,并进一步查阅北京博奥生物分子注释系统,进行基因功能归类。结果:造模组诱导成功"劳倦过度、房室不节"肾阳虚鼠模型,同时通过基因芯片检测,分别绘制了造模组/对照组与治疗组/造模组基因表达谱的散点图。造模组/对照组共筛选出186个差异表达基因,其中上调基因150个,下调基因36个。治疗组/造模组筛选出299个差异表达基因,其中上调基因114个,下调基因185个。造模组/对照组上调基因而治疗组/造模组基因下调的有58个基因,其主要是与炎症/免疫、神经传递/信号转导、转录/翻译、代谢以及影响多巴胺生成限速酶有关的基因。造模组/对照组下调基因而治疗组/造模组基因上调的基因9个,其主要与生长激素、黑色素、细胞周期/细胞结构、神经传递/信号转导和代谢相关的基因。结论:金匮肾气丸可使肾阳虚小鼠模型显著下调的生长激素、黑色素显著上调并促进细胞增殖,从而在基因水平上探讨了金匮肾气丸的药物作用机理。     

右归丸对“劳倦过度、房室不节”肾阳虚小鼠脑基因芯片的影响

目的 研究右归丸对"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠模型脑基因的影响,以期从基因水平上研究其药物作用机理.方法 对照组、模型组和治疗组雄性小鼠各为10只、15只和10只.对照组和模型组每日每只灌胃蒸馏水0.5ml,治疗组每日每只予右归丸混悬液0.5ml,模型组和治疗组雄雌鼠比例1∶6同笼喂养且雄鼠每日游泳30～40分钟共4周,以诱导产生"劳倦过度、房室不节"肾阳虚证.用36K鼠脑芯片检测3组鼠脑基因,并各以二者荧光信号相对强度比值≥2和≤0.5筛选差异显著基因.结果 模型组/对照组共筛选出186个差异表达基因,其中上调基因150个,下调基因36个.治疗组/模型组筛选出155个差异表达基因,其中上调基因64个,下调基因91个.模型组/对照组上调而治疗组/模型组下调的基因有32个,主要是炎症/免疫、神经传递/信号转导等基因.模型组/对照组下调而治疗组/模型组上调的基因有12个,主要是与黑色素、孤儿核受体相关的基因.结论 右归丸可使肾阳虚小鼠模型显著下调的黑色素显著上调,改善与孤儿核受体有关激素的作用并促进细胞增殖.     

金匮肾气丸对"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠睾丸结构功能的影响

目的:以"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠为模型.观察金匮肾气丸对肾阳虚小鼠睾丸结构功能的影响.方法:用强迫小鼠游泳法造成劳倦过度,以Colldege效应诱导雄性小鼠房室不节,建立肾阳虚小鼠模型.设正常组、模型组与金匮肾气丸治疗组.计算睾丸指数,光镜观察睾丸大体结构,透射电镜观察睾丸超微结构,放射免疫分析法测定睾酮(T)含量.结果:模型组睾丸指数和睾酮的分泌量比正常组有明显下降,而经治疗后均有明显升高;模型组睾丸大体结构及超微结构均有不同程度的损害,金匮肾气丸治疗组未见结构明显改变.结论:金匮肾气丸可使肾阳虚小鼠睾丸受损结构得以一定程度的恢复,可改善睾丸的分泌功能.     

“劳倦过度、房室不节”肾阳虚模型小鼠睾丸乳酸脱氢酶-X活性的测定

[目的]观察"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠睾丸乳酸脱氢酶(LDH)总活性及精子特异酶LDH-X活性的改变.[方法]睾丸匀浆用2,4-二硝基苯肼显色法测定丙酮酸的生成量[1],计算每克睾丸湿组织LDH总活性和LDH-X同工酶活性.[结果]"劳倦过度、房室不节"肾阳虚造型组LDH总活性显著低于正常对照组(P＜0.05.P＜0.01),金匮肾气丸治疗组较"劳倦过度、房室不节"肾阳虚造型组则显著升高(P＜0.05,P＜0.01);LDH-X活性造型组第2周较对照组有下降的趋势,但无统计学意义,第4、第6周下降显著(P＜0.01);治疗组较造型组第2周有升高趋势,但无统计学意义,第4、第6周则显著升高(P＜0.01).[结论]从精子特异酶LDH-X活性改变,证明了"肾主生殖"有现代科学依据,该模型系肾阳虚模型.     

金匮肾气丸对肾阳虚小鼠睾丸组织端粒酶活性的促进作用

目的探讨金匮肾气丸对肾阳虚小鼠睾丸组织端粒酶活性的影响。方法以"劳倦过度,房事不节"制备肾阳虚小鼠模型,随机分为模型组及金匮肾气丸治疗组(治疗组),每组15只,另选取15只正常雄鼠作为正常组。正常组常规饲养,每天灌胃蒸馏水0.1mL/10g;模型组造模同时每天灌胃蒸馏水0.1mL/10g;治疗组造模同时每天灌胃金匮肾气丸混悬液0.1mL/10g(浓度0.241g/mL)。共干预4周。4周后采用ELISA法检测各组小鼠睾丸组织端粒酶活性。结果 "劳倦过度、房事不节"法复制肾阳虚模型成功,同时金匮肾气丸对肾阳虚模型小鼠的体征有一定的改善作用。与正常组比较,模型组小鼠睾丸端粒酶活性降低(P<0.01);与模型组比较,治疗组端粒酶活性升高(P<0.01)。结论 "劳倦过度、房事不节"肾阳虚小鼠睾丸端粒酶活性较之正常小鼠明显降低,金匮肾气丸可使肾阳虚小鼠睾丸端粒酶活性得以恢复。     

基于Fas/FasL途径的金匮肾气丸对肾阳虚模型睾丸细胞凋亡的影响

目的以"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠为模型,从Fas/FasL途径探讨肾阳虚小鼠睾丸组织细胞凋亡发生机制及金匮肾气丸的治疗作用。方法以Colldege效应诱导雄性小鼠房室不节,用强迫小鼠游泳法造成劳倦过度,建立肾阳虚小鼠模型。4周后,分别用普通光学显微镜和电子显微镜进行睾丸组织的形态学观察,TUNEL法测定小鼠睾丸生殖细胞的凋亡率,利用RT-PCR检测小鼠睾丸组织Fas/FasL mRNA表达,用免疫组织化学分析Fas、FasL蛋白表达差异。结果1模型组小鼠睾丸组织曲细精管内支持细胞及各级生精细胞层次不清,结构破坏明显,金匮肾气丸组和睾酮组小鼠睾丸生殖细胞较模型组有一定程度改善。2在透射电镜下,模型组小鼠睾丸细胞中,可以观察到处于凋亡不同阶段的初级精母细胞,凋亡小体。3模型组TUNEL阳性细胞较正常组显著增加,主要为精原细胞和初级精母细胞,并可见精子细胞凋亡。金匮肾气丸治疗组睾丸细胞凋亡率明显低于模型组,但高于正常组,凋亡细胞类型以精原细胞和初级精母细胞为主。4模型组与正常组相比,Fas/FasL的mRNA表达量明显增高,金匮肾气丸组和睾酮组Fas、FasL mRNA表达较正常组稍高,但与模型组比较,明显降低。5模型组Fas在支持细胞和精原细胞及初级精母细胞高表达增多,精子细胞高表达增加明显;模型组FasL高表达细胞明显增多,在支持细胞、各级生精细胞及精子细胞、精子中均有分布,无明显定位特异性;金匮肾气丸组和甲基睾酮对肾阳虚模型小鼠的Fas/FasL均有明显的抑制作用。结论房劳-倦劳所致肾阳虚小鼠的睾丸内生殖细胞凋亡率上升,通过Fas、FasL的外源性死亡通路引起生殖细胞凋亡。金匮肾气丸可以通过调节Fas/FasL表达,降低小鼠睾丸生殖细胞凋亡。     

金匮肾气丸、右归丸对肾阳虚小鼠模型以药反证的脑基因芯片研究

目的:在基因水平上探讨补肾中药金匮肾气丸、右归丸对肾阳虚小鼠模型的作用机制.方法:昆明种小鼠分为正常组、模型组、金匮组和右归丸组.正常组和模型组每天灌胃蒸馏水0.5 mL;金匮组和右归丸组每天分别灌胃金匮.肾气丸混悬液和右归丸混悬液0.5 mL,含生药129 mg·kg~(-1).造模组和治疗组均采用雄雌鼠比例1:6同笼喂养,雄鼠每日游泳1次,直至无力下沉时捞出,达4周,以诱导产生"劳倦过度、房室不节"肾阳虚证.观察动物的畏寒、活动及反应、饮食和皮毛等情况.用36K mouse genome array鼠脑芯片检测正常组和肾阳虚模型组鼠脑基因,并以二者荧光信号相对强度比值≥2和≤0.5筛选差异显著基因,用qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证.结果:模型组/正常组上调基因,二药治疗组/造模组基因下调23个基因,主要是与炎症/免疫、神经传递/信号转导等相关基因;造模组/对照组下调基因而治疗组/造模组基因上调的基因有6个,其主要是与细胞周期/细胞结构、神经传递/信号转导、转录等有关基因.qRT-PCR也证实了金匮组/模型组、模型组/正常组的GH和Scgb3a1的差异表达.结论:金匮肾气丸、右归丸可使肾阳虚小鼠模型显著下凋的激素、黑色素显著上调并促进细胞增殖,从而在基因水平上探讨了金匮肾气丸和右归丸的药物作用机制及其差别.     

“房室不节”所致肾虚证动物模型造模方法探讨

目的：探讨单纯房室不节动物模型的造模方法。方法：以李震创立的“劳倦过度,房室不节”肾虚模型作为对照,分别设立4周、8周、12周3个“房室不节”造模组进行造模,比较各组的精子活动率和计数,精子畸形率,母鼠怀孕胚胎数;睾丸的脏器称重及病理改变、睾丸乳酸脱氢酶X同功酶（LDH—x）相对活性。结果：“劳倦过度,房室不节”组精子活动率和密度、精子畸形率、母鼠怀孕胚胎数、睾丸重量及系数、LDH—X相对活性与空白对照组比较,有统计学意义;“房室不节”4周组、8周组试验参数接近空白对照组,12周组接近“劳倦过度,房室不节”组。结论：单独使用“房室不节”方法进行12周造模。能有效建立“房室不节”致肾虚证“肾主生殖”功能虚损雄性小鼠模型。     

冬虫夏草对小鼠生殖功能及睾丸形态影响的实验观察

目的观察冬虫夏草对小鼠生殖功能及睾丸形态的影响。方法用腺嘌呤制备肾阳虚小鼠模型,肾阳虚防治组动物在给腺嘌呤造模同时,喂饲冬虫夏草子实体细粉,观察雄性小鼠睾丸形态及配对雌鼠阴道阴栓出现率、受孕率、受孕时间、受孕雌鼠生育的仔鼠数和仔鼠平均体重。结果显示肾阳虚雄性小鼠的生殖功能明显受到抑制,而肾阳虚防治组小鼠睾丸形态明显改善,其配对雌鼠受孕时间有提前趋势,产出的仔鼠数和仔鼠平均体重明显高于肾阳虚模型组。结论冬虫夏草能改善腺嘌呤对小鼠生殖功能的抑制,具有提高性欲和生育作用。     

清胆胶囊对胆石病C57小鼠肝脏基因表达谱的影响

目的探讨清胆胶囊对胆石病C57小鼠肝脏基因表达谱的影响。方法将38只SPF级C57BL/6J雌性小鼠随机分为对照组（n=10）、模型组（n=15）及清胆胶囊组（n=13）。对照组喂以正常饲料,模型组和清胆胶囊组喂以高脂致石饲料,其中清胆胶囊组在予高脂饮食的同时,予清胆胶囊干预。于实验第8周末处死,应用Oligo GEArray芯片检测肝脏基因表达的改变。结果与对照组比较,模型组出现显著差异表达的基因共35条,上调基因34条,下调基因1条,为Col3a1;与模型组比较,清胆胶囊组出现显著差异表达的基因38条,其中下调基因36条,上调基因2条,为Il3和Ppard;与模型组比较,对照组和清胆胶囊组同时下调两倍的基因27条,主要为代谢酶相关基因、脂肪酸结合蛋白基因、炎症和纤维化相关基因等。结论从基因学角度分析显示,清胆胶囊可以改善肝脏的炎症损伤,减少胆汁中胆固醇结晶的形成,降低结石形成的几率。     

右归饮对肾阳虚小鼠模型的实验研究

目的：研究右归饮对小鼠肾阳虚模型的治疗作用。方法：将小鼠分为4组：正常组、模型组、治疗组高剂量组、治疗组低剂量组,除正常组外,其他组小鼠用醋酸泼尼松龙制备肾阳虚模型。正常组和模型组小鼠进行等体积的蒸馏水灌胃,而治疗组给予相应剂量的右归饮,持续2w。实验结束时,测算肾脏的脏器系数,同时测定血清中超氧化物歧化酶（SOD）、和丙二醛（MDA）含量。结果：与模型组相比,高剂量组动物脏器系数明显降低,血清中的SOD较明显升高,MDA含量显著降低。结论：右归饮对小鼠肾阳虚模型有一定的治疗作用。     

用基因芯片技术研究青少年肾阳虚体质差异表达基因

利用基因芯片技术筛选、分析青少年肾阳虚体质者外周血白细胞的差异表达基因，从基因水平初步探究青少年肾阳虚体质的机理。利用体外转录方法，将青少年肾阳虚体质组与同年龄段的正常体质组外周血白细胞mRNA合成为标记有不同荧光的cDNA探针，运用杂交互补原理筛选差异表达基因。结果：共筛选出127条符合标准的差异表达基因，其中63条呈上调表达，64条呈下调表达。提示：与青少年肾阳虚体质相关的基因表达涉及到免疫相：关、发育相关、细胞生长、细胞受体、细胞信号和传递蛋白、蛋白翻译合成等。     

千里光致小鼠肝损伤的基因表达谱分析

 目的在基因表达层次上探讨中药千里光对小鼠肝脏的毒性机制。方法实验小鼠分别灌胃千里光提取物15和30d后,以cDNA微阵列技术研究千里光对小鼠肝脏基因表达谱的影响,根据差异表达基因的生物学功能,探讨千里光对小鼠肝脏的毒性机制。结果千里光给药15d组小鼠相对正常对照组差异表达基因有39条,其中上调基因8条,下调基因31条,功能已知基因23条,功能未知基因16条。给药30d组小鼠差异表达基因有655条,其中上调基因337条,下调基因318条,已知功能基因213条,未知功能基因442条。两给药组共同的差异表达基因有21条,其中上调基因2条,下调基因19条。结论千里光可导致小鼠肝脏基因表达谱显著变化,且差异表达基因与其肝损伤间有高度关联性,这对阐明千里光属植物的肝损伤机制具有十分重要的作用。     

气虚证大鼠垂体一致下调的基因

目的：探索气虚证在大鼠垂体基因表达层面的物质基础。方法：采用16周龄Wistar大鼠、自发性高血压大鼠（SHR大鼠）、自发性糖尿病大鼠（GK大鼠）,综合应用标准化大鼠诊法,及GeneChip Rat Gene1.0ST Array等技术,检测正常Wistar大鼠、正常气虚Wistar大鼠、SHR气盛大鼠、SHR气虚大鼠、GK气盛大鼠、GK气虚大鼠等垂体基因的表达,重点关注3个气虚证垂体基因表达较正常对照一致下调的基因。结果：共筛选得到24个基因,（1）与基因转录、翻译和修饰有关的基因8个：Leo1、Aatf、Myst2、Ttc12、Mtfmt、Sdccag10、Nmt2、LOC364236;（2）与信号转导、细胞活动、细胞生命有关的基因10个：Plce1、Sgk1、Sema3a、Nrp1、Tagln、Rnf185、Arl5b、Pcdhb20、Stk17b、Sept1;（3）不属于以上两类的6个：Fdft1、Abca5、Aox1、Ccdc93、RGD131055、AB086234（mRNA号）。结论：气虚大鼠垂体有其特征性的下调基因群,其具体的调控机制及生理/病理意义,以及与那些上调基因群的关系,有待深入的研究。