HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

5-LO真核表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达的初步研究

目的构建5-LO真核表达载体并初步研究其在RAW264．7细胞中的表达,为建立5-LO高表达转基因小鼠模型提供表达载体。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增5-LO基因,分别构建5-LO目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,进行酶切、PCR和DNA测序鉴定,将重组融合表达载体pEGFP-5-LO稳定转染RAW264．7细胞,RT-PCR、western blot方法检测pEGFP-5-LO的表达情况。结果构建了重组克隆载体pUCm-5-LO和真核表达载体pEGFP-5-LO,经酶切、PCR及测序鉴定正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到pEGFP-5-LO融合蛋白的表达,RT—PCR和Westemblot结果表明转染pEGFP．5-LO的RAW264．7细胞中有5-LO的表达。结论成功克隆了5-LO基因,构建的表达载体pEGFP-5-LO在RAW264．7细胞中表达5-LO蛋白,为进一步5-LO高表达转基因鼠模型的建立和临床应用奠定了基础。     

人乳头状瘤病毒16E7在人喉癌细胞系中的转染及表达

目的:构建含人乳头状瘤病毒16E7(HPV16E7)基因的真核表达载体,观察HPV16E7对人喉癌HEp-2细胞系生物学特性的影响,为后续实验提供研究对象.方法:以含HPV16E7基因的中间质粒pET28a-HPV16E7为模板扩增出HPV16E7基因全长序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B中,并进行序列分析和酶切鉴定.电穿孔法将重组体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入喉癌HEp-2细胞中,Western 印迹法检测HPV16E7蛋白的表达,相差显微镜观察转染前后的HEp-2细胞系形态学变化,流式细胞仪检测转染前后细胞生长周期的改变.结果:成功构建并将pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入人喉癌HEp-2细胞中;转染后HEp-2细胞增生活跃,S期明显延长,并能够稳定表达HPV16E7蛋白.结论:HPV16E7有促进HEp-2细胞的致瘤活性;真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7可为下一步建立动物模型和喉癌体外治疗实验提供研究工具.     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

真核表达载体pcDNA6/myc-hisB-GFP的构建

目的 构建带绿色荧光蛋白(GFP)的pcDNA6/myc-hisB的真核表达载体. 方法 采用亚克隆的技术扩增得到GFP的开放阅读框序列,Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ双酶切后插入pcDNA6/myc-hisB,重组体经质粒PCR和酶切鉴定,并转染HEK 293T细胞后观察绿色荧光的表达,同时经Western blot检测GFP和标签蛋白myc的表达. 结果 PCR扩增得到特异的GFP开放阅读框序列,质粒PCR和酶切鉴定显示pcDNA6/myc-hisB-GFP构建成功,细胞转染结果 表明重组体可以表达GFP和myc蛋白.结论 获得带有绿色荧光蛋白的pcDNA6/myc-hisB-GFP的真核表达载体,为此载体的应用拓展了更大的空间.     

稳定表达细胞内病原体抗性基因1的RAW264．7细胞克隆的建立

目的：构建携带细胞内病原体抗性基因1（1pr1）,以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组真核表达载体,并导人鼠巨噬细胞RAW264．7中表达．方法：KpnⅠ和BamHⅠ双酶切重组质粒pET32a（＋）-Ipr1及真核表达载体pEGFP-C1,Ipr1基因定向克隆人pEGFP-C1载体,构建重组质粒载体pEGFP-C1-Ipr1．脂质法转染体培养的RAW264．7细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP-C1-Ipr1融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测Ipr1基因转录水平的表达;West-ernBlot方法验证Ipr1蛋白水平的表达．结果：酶切鉴定获得一条约4700bp空载体条带及一条约1338bp目的片段,证明pEGFP-C1-Iprl真核表达载体构建成功．pEGFP-C1-Ipr1转染RAW264．7细胞后,WesternBlot可以检测到约Mr77×10^3的融合蛋白在RAW264．7细胞中表达,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达．结论：成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-Ipr1,获得稳定的RAW264．7-Ipr1细胞克隆可表达Ipr1,为进一步研究Ipr1的功能奠定了基础．     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的构建含乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）X基因的真核表达载体，为探讨HBVX基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系提供实验依据。方法用PCR方法扩增含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列，对pcDNA3．1（＋）载体及X基因PCR产物双酶切，用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，并对其进行双酶切和测序鉴定，构建HBVX基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBx。用梭华-Sofast^TM基因转染试剂将其质粒转染THP-1巨噬细胞，细胞裂解液经SDS-PAGE及转硝酸纤维素膜后做Western blotting，鉴定目的蛋白。结果双酶切pcDNA3．1（＋）-HBx后，琼脂糖电泳可分别见到大小约为5．4kb和465bp片断，说明X亚克隆入pcDNA3．1（＋），经序列测定其含有完整的X基因片段；Western blotting结果显示pcDNA3．1（＋）-HBx能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBx，并能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。     

A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达

目的克隆A亚型人呼吸道合胞病毒（HRSV）G基因,构建G基因的真核表达载体,并进行表达和鉴定。方法自行设计引物,利用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中获得G基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体,经核酸序列分析,进一步亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,酶切鉴定后,脂质体法转染COS-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定基因转录和蛋白表达。结果真核表达载体pcDNA3．1（＋）G的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,RT-PCR检测到G基因有转录,Western blotting分析观察到G蛋白特异性的表达条带。结论成功克隆A亚型HRSVG基因,并在真核细胞中获得表达。     

人乳头瘤病毒16型 E6蛋白真核表达载体pGADT7-E6的构建与鉴定

目的 构建HPV16 E6基因的真核表达载体,为在酵母菌中表达以及进一步探讨HPV16 E6基因与宫颈癌发生的关系奠定前期实验基础.方法 用PCR扩增含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的E6基因序列,双酶切pGADT7载体与E6基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶将二者连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HPV16 E6基因的真核表达载体pGADT7-E6.结果 双酶切pGADT7-E6后,琼脂糖凝胶电泳显示2个片段,分别在约500 bp与8.0 kb处.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒含有477 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了HPV16 E6基因真核表达载体pGADT7-E6.     

pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-HPV16 E6.方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP～HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位,用Western blot方法验证其蛋白的表达.结果 在空载体pEGFP-C2转染组中,Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pEGFP-HPV16 E6转染组中,绿色荧光集中在细胞核中.结论 pEGFP-HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为HPV16 E6的功能研究提供了线索.     

GFP-HPV16 E2及其删除突变体融合蛋白在真核细胞中的表达与定位

目的构建人乳头瘤病毒16型E2(HPV16 E2)及其N端(TAD)、C端(DBD)删除突变体与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的真核表达载体,观察其在Hela细胞中的表达与定位。方法HPV16 E2基因经PCR扩增后,与pMD-T载体连接,经蓝白斑筛选、PCR、双酶切鉴定及序列分析后,将E2基因亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2。PCR扩增TAD、DBD基因片段,将其双酶切后插入pEGFP-C1,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD。将3种质粒转染Hela细胞,在荧光显微镜下观察融合蛋白的表达与定位。结果重组载体经PCR、双酶切鉴定及测序证明插入片段序列正确,且在Hela细胞中能表达目的蛋白;GFP-E2融合蛋白在细胞核与细胞质中都有表达,但主要分布于细胞核;而GFP-DBD融合蛋白仅在细胞核内;GFP-TAD融合蛋白仅在细胞质中。结论构建的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD均在Hela细胞中表达,并确定了各自在细胞内的定位。     

抗菌肽PR39真核表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达和抗菌作用

目的 构建抗菌肽PR39的真核表达载体,转染后观察PR39在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及抗菌作用.方法 采用拼接PCR法合成抗菌肽PR39基因,克隆到真核表达载体pIRES2-GFP中,经鉴定后用阳离子脂质体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过RT-PCR和免疫荧光法检测目的 基因的表达,并对其抗菌活性进行初步检测.结果 成功构建了抗菌肽PR39的真核表达载体pIRES2-GFP/PR39,并能在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达抗菌肽PR39.表达抗菌肽PR39的巨噬细胞杀灭和清除胞内菌的能力明显增强.结论 抗菌肽PR39基因能够在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达并发挥抗菌作用.     

人cbl 基因真核表达载体的构建及表达

目的: 构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体,并检测其在真核细胞中的表达.方法: 以含有人全长cbl cDNA的质粒pEFHAcbl 为模板,采用PCR方法扩增cbl基因,并在其N-末端带上含24 bp的flag标签,克隆到pGEM-T easy载体并测序,再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测flag-cbl在细胞中的表达. 结果: 测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flag-cbl融合基因的序列以及读框全部正确;重组质粒pcDNA3.1( )-flag-cbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段;脂质体法转染COS-7后检测到预期目的蛋白的表达.结论: 成功构建了N-末端带flag标签的cbl真核表达载体,并使其在真核细胞COS-7中表达.     

人乳头瘤病毒58型E7基因重组真核表达质粒的构建与序列分析

目的:构建含人乳头瘤病毒58型(HPV58)E7基因的真核表达质粒,获得HPV58感染人后病毒基因结构的基本信息。方法:用HPV型特异性引物扩增出HPV58型E7 DNA,将HPV58 E7 DNA与PBS-T载体连接,获得克隆重组体HPV58 E7-PBS-T,经双酶切鉴定后,将E7基因与真核表达载体PCDNA3.1连接,然后经双酶切、测序鉴定,通过GenBank的数据库分析软件对HPV58型E7基因进行同源性分析。结果:双酶切重组DNA结果显示,重组体中HPV58型E7基因片段和载体DNA大小与预期计算一致,经BLAST比对,与GenBank数据库中的HPV58型E7基因序列具有高度的同源性,其中与1991年日本学者最早报道HPV58型E7基因相比,仅125位一个碱基的差异,即C-T的突变;推导相应的氨基酸由脯氨酸(pro)变为亮氨酸(leu)。结论:构建了含HPV58型E7基因的真核表达质粒,其基因序列与报道的基因序列高度同源,其微小差异对功能有无影响有待探讨。该重组质粒的构建为HPV58型E7基因及表达蛋白的功能研究奠定基础。