荧光定量聚合酶链反应检测c—myc基因在乳腺癌诊断中的应用

目的 荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测c-myc基因表达,探讨其在乳腺癌诊断中的应用.方法 采用FQ-PCR法,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内对照测定15名健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和80例乳腺癌患者外周血中c-myc的表达量.结果 正常对照组和良性乳腺疾病组c-myc和c-myc/GAPDH差异无统计学显著性意义(P>0.05),乳腺癌组均显著高于前两组,差异有统计学显著性意义(P<0.05),GAPDH在三组间差异均无统计学显著性意义(P>0.05).若以c-myc表达量和c-myc/GAPDH高于正常对照组为阳性,乳腺癌组的阳性率为41.3%(33/80),良性乳腺疾病组则无1例阳性.27例乳腺癌患者手术前到化疗后第1,28 d和56 d c-myc和c-myc/GAPDH均呈下降趋势,但第1 d和第28 d与手术前比较,差异无统计学显著性意义(P>0.05),而第56 d与手术前比较,c-myc和c-myc/GAPDH均显著低于手术前,差异有统计学显著性意义(P<0.05).结论 FQ-PCR技术是高灵敏度、高特异度的快速定量检测c-myc方法,可有效监测乳腺癌的诊断、疗效和转移.     

荧光定量聚合酶链反应检测c-myc在乳腺癌诊断中的临床应用

目的建立荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）法检测核内原癌基因c—myc表达水平,探讨其在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用。方法建立FQ—PCR法,并以β2-微球蛋白作为内对照测定30名健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和81例乳腺癌患者外周血中c-myc的表达水平。结果c—myc表达水平在正常对照组和良性乳腺疾病组间差异无统计学意义（P〉0．05）,乳腺癌组均高于前2组（P〈0．05）,β2-微球蛋自在3组间差异无统计学意义（P〉0．05）。81例乳腺癌患者阳性率为40．7％,良性乳腺疾病组为0。c—myc表达水平与患者年龄和肿瘤大小和类型无关（P〉0．05）,与乳腺癌临床分期、组织学分级以及腋淋巴结转移相关（P〈0．05）。结论FQ—PCR技术是高灵敏度、高特异性的快速定量检测c—myc方法,可有效监测乳腺癌的诊断、疗效、转移和预后。     

荧光定量聚合酶链反应检测乳腺癌患者Bcl-2基因表达临床应用

目的研究荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在检测患者Bcl-2基因表达中的临床应用。方法采用FQ-PCR对50例非乳腺癌患者(其中包括21例健康妇女和29例被确诊为良性乳腺肿瘤的患者)和60例乳腺癌患者Bcl-2基因表达进行了相关的检测,运用化学发光的方法对癌胚抗原(CEA)、糖类抗原153(CA153)等进行了检测,并对检测的结果进行比较和分析。结果研究结果显示乳腺癌的患者与健康检查者以及良性乳腺疾病患者相比其Bcl-2、CEA、CA153水平差异均有统计学意义(P<0.05);同时,对患者Bcl-2基因的表达用FQ-PCR法加以检测的诊断灵敏度要明显高于CEA和CA153,其差异也具有统计学意义(P<0.05)。结论运用FQ-PCR法对乳腺癌患者Bcl-2基因表达水平加以检测,在临床上对于此类疾病的诊断、治疗和预后都有一定积极的意义。     

细胞角蛋白19联合B细胞淋巴瘤/白血病-2基因mRNA检测诊断乳腺癌的临床研究

目的探讨联合检测B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B cell lymphoma/leukemia 2 gene,BCL-2)与细胞角蛋白19(Nuclear oncogene,ck19)基因表达水平在乳腺癌诊断中的应用。方法建立荧光定量聚合酶链反应(Fluorescence Quantita-tive-Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)法,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehydes-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH)为内对照测定20名健康女性体检者(正常对照组)、35例良性乳腺疾病患者(良性乳腺疾病组)和89例乳腺癌患者(乳腺癌组)外周血中BCL-2和ck19的表达量。结果乳腺癌组患者BCL-2和ck19表达水平与GAPDH的比值显著高于正常对照组和良性乳腺疾病组(均P<0.05),而正常对照组与良性乳腺疾病组间BCL-2和ck19表达水平与GAPDH的比值差异无统计学意义(P>0.05)。3组GAPDH差异无统计学意义(P>0.05)。BCL-2与ck19联合检测的灵敏度高于单个基因的检测。结论FQ-PCR技术可以快速定量检测BCL-2和ck19 mRNA,两者联合检测可有效提高对乳腺癌诊断的灵敏度。     

荧光定量聚合酶链反应检测人乳腺癌C-erbB2基因扩增及过度表达的研究

目的建立荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测C-erbB 2基因表达水平,探讨其在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用。方法建立FQ-PCR法,并以2β-微球蛋白为内对照测定15名健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和81例乳腺癌患者外周血中C-erbB 2的表达量。结果C-erbB 2表达水平在正常对照组和良性乳腺疾病组间差异无显著性意义(P>0.05),乳腺癌组均高于前两组(P<0.05),2β-微球蛋白在三组间差异无显著性意义(P>0.05)。81例乳腺癌患者阳性率为50.6%,良性乳腺疾病组为0。C-erbB 2表达与患者年龄和肿瘤大小和类型无关(P>0.05),与乳腺癌临床分期、组织学分级以及腋淋巴结转移相关(P<0.05)。结论FQ-PCR技术是高度灵敏、高度特异的快速定量检测C-erbB 2方法,可有效地诊断乳腺癌并对其疗效、转移和预后进行监测。     

基于单基因的实时荧光定量反转录-聚合酶链反应定性检测猪霍乱沙门菌

目的 建立基于单基因的猪霍乱沙门菌的实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)检测方法。方法 通过对猪霍乱沙门菌基因组及其他血清型沙门菌基因组、人类基因组的生物信息学比对及普通PCR检测分析,获得猪霍乱沙门菌特有而其他细菌及人类基因组中不存在的特异基因SC 1242,针对该基因设计特异性引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的rRT-PCR方法,利用123株多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株RNA评价该方法的特异性及敏感性。同时对猪霍乱沙门菌全血模拟标本进行敏感性检测。结果 利用该方法检测20株猪霍乱沙门菌均为阳性,其余菌株均扩增阴性。对纯菌RNA检测中,rRT-PCR的最低检测限度为50 fg/反应,约为96个拷贝/反应。在以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中,敏感性达90 cfu/ml。结论 rRT-PCR方法检测猪霍乱沙门菌特异性好、灵敏度高,对猪霍乱沙门菌的早期诊断具有潜在应用价值。     

荧光定量聚合酶链反应检测细胞角蛋白19在乳腺癌诊疗中的应用

目的　探讨荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)技术检测细胞角蛋白 19(CK19)基因表达在乳腺癌诊疗中的应用价值。方法　采用FQ PCR法 ,以甘油醛 3 磷酸脱氢酶 (GAPDH)为内对照 ,测定 15名健康女性体检者、2 5例良性乳腺疾病和 76例乳腺癌患者外周血中CK19的表达量。结果　CK19和CK19/GAPDH在正常对照组和良性乳腺疾病组间的差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ,而乳腺癌组则显著高于前两组 (P <0 0 5 ) ,GAPDH在三组间的差异均无显著意义 (P >0 0 5 )。乳腺癌组的CK19和CK19/GAPDH阳性率为 5 3 9% (41/ 76 ) ,而另两组均为阴性。 2 7例乳腺癌患者术前 ,化疗后 1、2 8和5 6dCK19和CK19/GAPDH均呈下降趋势 ,但化疗后 1和 2 8d与术前比较 ,差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ,化疗后 5 6d则显著低于术前 (P <0 0 5 )。结论　FQ PCR技术是较灵敏和特异的快速定量检测CK19方法 ,可用于乳腺癌的诊断和疗效监测。     

外周血中检测乳腺癌细胞株hMAM表达的方法探讨

目的建立逆转录结合荧光定量PCR(FQ-PCR)检测外周血乳腺癌细胞hMAM基因表达方法,了解其监测乳腺癌细胞微转移的应用价值。方法克隆目的片段,制备标准品并作测序验证。培养乳腺癌MDA-MB453、MCF7细胞株,制成血液标本模型,GAPDH基因为内对照,逆转录结合FQ-PCR检测乳腺癌细胞株血标本模型和10例乳腺癌患者外周血的hMAM表达。结果电泳和测序证实,克隆产物系预期的目的片段。FQ-PCR标准曲线的相关系数为-1.0;用103copies/μl标准品重复检测5次,x±s:718.9±120.5,CV16.7%;MDA-MB453细胞的血标本作灵敏度试验,相当于104个血细胞中含1个乳腺癌细胞可检出阳性。未检测到MCF7细胞的hMAM表达。10例乳腺癌患者,淋巴结转移的5例中,3例hMAM表达阳性、2例阴性;无淋巴结转移的5例中,1例hMAM表达阳性、4例阴性。结论本方法可有效监测外周血中微转移的乳腺癌细胞,发现不同乳腺癌细胞系hMAM表达程度差异大。     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测白血病bcr/abl mRNA

目的　建立荧光定量RT PCR法检测白血病融合基因bcr ablmRNA的方法 ,为白血病临床诊断及微量残留病监测提供有用工具。方法　RT PCR扩增培养的K5 6 2细胞bcr abl融合基因 ,A T载体克隆法构建定量标准模板 ,用PE770 0型检测仪 ,建立荧光定量RT PCR方法 ,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定 ;定量检测 14例慢性髓细胞白血病 (CML)患者和 4例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血样本。结果　建立的荧光定量RT PCR方法 ,可检测出约 10 - 5μgK5 6 2总RNA中的bcr abl融合基因和 10个bcr abl重组质粒拷贝 ,重复性的CT值 (Cyclethreshold)管间、批间变异系数 (CV)分别为 :2 0 % ,3.7%。 14例CML患者bcr abl融合基因表达量中位数为 5 .15× 10 4 拷贝 μgRNA ,产物经电泳分析 ,其中 11例为b2a2 ,3例为b3a2 ,1例 12× 10 4 拷贝 μgRNA的CML患者 ,骨髓移植后 1个月变为 0 .2 3× 10 4 拷贝 μgRNA。 4例ALL患者中 1例有bcr abl融合基因的表达 ,为b2a2 ,表达量为 8.2×10 5拷贝 μgRNA。 结论　建立的荧光定量RT PCR方法灵敏、特异、重复性好 ,结果用拷贝数表示 ,准确可靠 ,利于统一标准。该方法能检测出b2a2、b3a2两种类型的融合基因 ,可广泛用于CML的诊断和微量残留病的检测     

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎白细胞介素2受体mRNA检测中的应用价值

目的利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）检测强直性脊柱炎（AS）患者外周血单个核细胞白细胞介素2受体α（IL-2Rα）mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析.方法根据GenBank提供的序列设计一对引物和一条TaqMan探针.提取外周血单个核细胞（PBMC）总RNA,加入FQ-RT-PCR反应体系,产物切胶回收与pUCm-T载体连接,用T7RNA聚合酶转成cRNA,制备系列浓度参照物.对其特异性、线性、精密度和探针稳定性进行评价.定量HLA-B27阳性组与阴性组AS患者PBMC的IL-2Rα mRNA基因表达并探讨与血浆可溶性白细胞介素2受体（sIL-2R）的相互关系.结果成功构建了IL-2Rα mRNA的cRNA参照物.线性范围7～107 cells/ml,批内CV 8.4%,批间CV 9.6%.对各30例HLA-B27阳性与阴性AS的IL-2Rα mRNA检测表明,与正常对照组结果比较,阳性组与阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R有明显差异（P〈0.01）.IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%.结论 FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL-2Rα mRNA比sIL-2R更能反映强直性脊柱炎患者的炎症活动程度.     

前列腺癌组织中DD3和PSA基因定量表达与临床意义

目的探讨DD3和PSA基因在前列腺癌组织中定量表达及其临床意义。方法用实时荧光定量RT-PCR方法对21例前列腺癌组织(PCa)、39例良性前列腺增生(BPH)组织中DD3mRNA和PSAmRNA含量进行检测,用ROC曲线对DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA等指标对前列腺癌诊断价值进行评价。结果LNCaP细胞株中PSAmRNA含量约为DD3mRNA的4000倍。PCa组织中DD3mRNA和PSAmRNA含量以及DD3mRNA/PSAmRNA比值均显著高于BPH组织,差异具有统计学意义(P<0·01),但PCa不同临床分期和分化程度间差异无统计学意义(P值均>0·05)。ROC曲线分析结果显示,DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA的曲线下面积(AUC-ROC)分别为0·937(95%CI:0·879~0·995)、0·755(95%CI:0·629~0·880)和0·839(95%CI:0·738~0·940)。当DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA临界值分别为1·4×105copies/mgtissue、3·0×107copies/mgtissue和5·0×10-3时,灵敏度分别为90·5%、81·0%和81·0%;特异度分别为85·0%、62·0%和66·7%。若将DD3mRNA和PSAmRNA联合用于PCa的诊断,其特异性与DD3mRNA相同,特异性均为85·0%,灵敏度可达100%。结论PCa组织DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA较BPH组织显著增高,DD3mRNA用于PCa的诊断性能均优于PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA,DD3mRNA和PSAmRNA的联合检测时特异度与DD3mRNA相同,但可明显提高灵敏度,对PCa的早期诊断具有重要意义。     

荧光定量聚合酶链反应检测在肺结核诊断中的应用价值

目的分析荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(TbDNA)在诊断肺结核中的应用价值。方法选择2018年1月-2020年1月湖南省儿童医院收治的21例肺结核患儿作为肺结核组,另外选择同时期21例排除肺结核感染的肺部疾病患儿作为非肺结核组。全部患儿均行痰涂片抗酸染色镜检、纤维支气管镜(纤支镜)痰涂片抗酸染色镜检和BALF中TbDNA荧光定量PCR检测。比较3种检测方法对肺结核诊断的特异度、敏感度、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。结果痰涂片抗酸染色镜检、纤支镜痰涂片抗酸染色镜检和荧光定量PCR的敏感度分别为19.05%、14.29%、76.19%,特异度分别为100.00%、100.00%、95.24%,PPV分别为100.00%、100.00%、94.12%,NPV分别为55.26%、53.85%、80.00%。荧光定量PCR检测BALF中TbDNA的敏感度明显高于痰涂片抗酸染色镜检和纤支镜痰涂片抗酸染色镜检(76.19%比19.05%、14.29%),差异有统计学意义(P<0.05);3种检测方法的特异度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论通过荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA,具有快速、敏感度高、特异度高的特点,利于早期诊断肺结核,尤其是对于痰涂片检测呈阴性及无典型影像学特征的患儿,可以明显提高确诊率,其结果能够作为诊断肺结核的主要指标。     

乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR的建立与应用

目的　建立血浆 (血清 )HBVDNA荧光定量PCR检测方法 ,探讨其临床应用价值。方法　用PUCm T载体和PCR纯化产物连接 ,转染DH5α菌 ,筛选阳性菌落 ,提取质粒 ,制作外标准品 ;在HBV基因组S区设计一对引物和TaqMan探针 ,严格优化反应物的组成和扩增条件 ,并对该方法进行评价。结果　建立的HBVDNA荧光定量PCR最低可检出 80 0拷贝 /ml;批内误差为 1 8%～ 6 5% ,批间误差为 2 6 %～ 9 1 % ;在 1 0 4 ～ 1 0 11拷贝 /ml之间与Ct值具有很好的线性 (Ct =- 1 .391 1ln(X) 4 1 .6 5,r =- 0 .9958) ;外周血HBVDNA临床定量检测发现 ,HBeAg阳性的 1 30例中 ,HBVDNA阳性率为 1 0 0 % ,含量为1 0 6 89± 1.6 9拷贝 /ml,抗HBe阳性的 96例中HBVDNA阳性率为 55 2 % ( 53/ 96 ) ,含量为 1 0 4 .0 9± 1.19拷贝 /ml;6 2例献血员未检出HBVDNA。乙肝临床治疗监测发现 ,外周血中HBVDNA含量检测可有效反映治疗效果 ,指导临床用药。结论　荧光定量PCR检测方法是一种相对准确、灵敏度高、特异性较强和较简便的HBVDNA定量检测技术 ,对乙肝诊断、指导临床用药和治疗监测方面具有实用价值     

双色荧光定量PCR快速诊断唐氏综合征

目的建立快速诊断唐氏综合征的荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）方法及其应用于产前诊断唐氏综合征的可能性。方法合成21号染色体单拷贝基因DSCR1特异的引物和TaqMan探针以及1对非21号常染色体单拷贝基因GAPDH特异的引物和TaqMan探针,其中检测DSCR1基因的探针标记6-羧基荧光素（FAM）,检测GAPDH基因的探针标记六氯（HEX）荧光素;提取患者和正常人外周血及胎儿羊水脱落细胞标本的DNA为模板,在同-PCR扩增管中同时进行2种基因的双色荧光定量聚合酶链反应（the double chromatography fluorescence quantitative polymerase chain reaction,DC—FQ—PCR）,分别定量测定DSCR1基因和GAPDH基因的含量,并计算每个标本2种基因剂量的比值;采用该基因检测技术检测23例唐氏综合征患者、20名正常人和100例羊水,与染色体检查诊断结果对比,判断该技术在唐氏综合征基因诊断和产前诊断中的应用价值。结果在30μLFQ—PCR反应体系中,加入最少约0．05ng基因组DNA能够稳定地获得扩增曲线;实验表明23例染色体检测为唐氏综合征患者的GAPDH与DSCRl的差值为0．65±0．17,以2^-△CT方法计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1．77～1．39。而20例染色体检测为正常人的GAPDH与DSCR1的差值为0．06±0．18,计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1．18～0．92;2组问的差异有统计学意义。在100例羊水细胞的检测中,以DSCR1与GAPDH拷贝数的比值大于1．35为唐氏综合征的判定标准,发现2例为患儿,其余98例为正常,与染色体检查结果一致。结论双色荧光定量PCR检测唐氏综合征是一个可行的、快速的、准确的、高通量的、费用较为低廉的检测方法,该法在唐氏综合症的基因诊断和产前基因诊断具有广阔的应用前景。     

逆转录—实时定量PCR检测CEA基因的表达在乳腺癌诊断中的应用

目的 通过检测乳腺癌病人外周血和乳房肿块细针穿刺中肿瘤细胞的CEAmRNA拷贝数对乳腺癌的进行诊断并对血行转移进行监测。方法 采用逆转录一实时定量PCR技术检测6l例正常人外周血和58例乳房肿块病人(其中38例乳腺癌病人，15例良性小叶增生，5例乳腺纤维腺瘤)外周血、乳房肿块穿刺标本及肿瘤组织中的CEAmRNA拷贝数。结果 6l例正常人外周血中均无CEAmRNA的表达。乳腺癌病人的乳房肿块穿刺标本中CEA表达为89．5％，CEAmRNA拷贝数在10^6～10^7／ml；38例乳腺癌病人外周血中的表达阳性率为52．7％，浓度范围为10^2～10^4拷贝／ml；癌组织中CEA表达为100％，CEAmRNA拷贝数在10^4～10^7／mg；20例良性乳房肿块病人外周血及细针穿刺标本中均无CEAmRNA的表达。结论 采用逆转录一实时定量PCR技术能特异、灵敏地诊断乳腺癌，并通过检测病人外周血中CEAmRNA来了解病人体内微转移的情况。     

逆转录-实时定量PCR检测CEA基因的表达在乳腺癌诊断中的应用

目的通过检测乳腺癌病人外周血和乳房肿块细针穿刺中肿瘤细胞的CEA mRNA拷贝数对乳腺癌的进行诊断并对血行转移进行监测.方法采用逆转录-实时定量PCR技术检测61例正常人外周血和58例乳房肿块病人(其中38例乳腺癌病人,15例良性小叶增生,5例乳腺纤维腺瘤)外周血、乳房肿块穿刺标本及肿瘤组织中的CEA mRNA拷贝数.结果 61例正常人外周血中均无CEA mRNA的表达.乳腺癌病人的乳房肿块穿刺标本中CEA表达为89.5%,CEA mRNA拷贝数在106～107/ml;38例乳腺癌病人外周血中的表达阳性率为52.7%,浓度范围为102～104拷贝/ml;癌组织中CEA表达为100%,CEA mRNA拷贝数在104～107/mg;20例良性乳房肿块病人外周血及细针穿刺标本中均无CEA mRNA的表达.结论采用逆转录-实时定量PCR技术能特异、灵敏地诊断乳腺癌,并通过检测病人外周血中CEA mRNA来了解病人体内微转移的情况.