抗甲硝唑人源scFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选甲硝唑人源单链可变区（scFv）抗体,为研究快速检测试剂盒奠定基础.方法 采用噬菌体表面展示技术,以甲硝唑作为抗原,固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮＂吸附-洗脱-扩增＂筛选过程,随机挑选抗甲硝唑的90个克隆,利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与甲硝唑结合活性较强的scFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-Blue,提取质粒进行酶切鉴定分析.结果 经过筛选90个克隆中有16株克隆ELISA的490 nm波长吸光度（A490nm）值较高,将这些噬菌体上清与牛血清清蛋白（BSA）进行交叉反应,确定有4株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌感受态细胞XL1-Blue.结论 提取质粒酶切片段与目的相符,为下一步研究其特异性亲和力的研究创造了条件.     

三聚氰胺人源scFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选三聚氰胺人源单链可变区(scFv)抗体,为研究快速检测试剂盒奠定基础.方法 采用噬菌体表面展示技术,分别以三聚氰胺、生物素化三聚氰胺作为包被抗原,从噬菌体抗体文库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,随机挑选阳性克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应及竞争抑制实验,对比后获得与抗原结合活性较好的克隆提取质粒,亚克隆到pCANTAB5E载体,对其重组质粒进行分析.结果 质粒酶切片段与目的相符.结论 利用生物素化抗原筛选抗体创新了原有筛选方法,为下一步研究创造条件.     

人源性抗百草枯特异性单链抗体的筛选及初步鉴定

目的:从大型人源性噬菌体抗体库中直接筛选出百草枯特异性单链抗体(scFv)。方法:以百草枯人工抗原(PQ-h-OVA)为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"过程,采用固相化抗原免疫吸附筛选法,从大型人源性噬菌体抗体库中筛选出特异性百草枯单链抗体,通过ELISA法对其特异性结合性能进行初步鉴定。结果:经过5轮筛选,获得两株能与百草枯人工抗原特异性结合的阳性克隆。结论:利用噬菌体抗体技术可不经免疫制备人源性百草枯抗体,为临床治疗百草枯中毒研究提供了具有更广阔前景的人源小分子抗体。     

特异性抗cyclin D1人源单链抗体的筛选

目的从噬菌体抗体库中筛选人源性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体并进行鉴定。方法以原核表达并用Ni-NTA Agarose纯化的重组人cyclinD1蛋白为抗原,通过“吸附-洗脱-扩增”淘选过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体,通过ELISA方法对获得抗体的特异性和结合活性进行分析鉴定。结果经过4轮筛选,获得7株能与人cyclinD1蛋白结合的阳性克隆,其中3株噬菌体的可溶性表达单链抗体能与人cyclinD1蛋白有特异性结合活性。结论利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出特异性的人源性抗人cyclinD1抗体。     

人源化抗血小板膜糖蛋白Ⅵ单链抗体的研究

,形成4.1×107个克隆.用辅助噬菌体M13K07援救TG1后产生的抗体滴度为2.62×1010cfu/ml.亲和层析后得到的纯化抗体可抑制胶原诱导的血小板聚集而对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集无明显影响.结论 利用噬菌体抗体库技术表达的人源化抗血小板GPⅥ抗体ScFv片段可抑制血小板聚集功能.     

特异性抗人cyclin D1人源单链抗体的筛选

目的 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体并进行鉴定.方法 以原核表达并用Ni-NTA Agarose纯化的重组人cyclinD1蛋白为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"淘选过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体,通过ELISA方法对获得抗体的特异性和结合活性进行分析鉴定.结果 经过4轮筛选,获得7株能与人cyclinD1蛋白结合的阳性克隆,其中3株噬菌体的可溶性表达单链抗体能与人cyclinD1蛋白有特异性结合活性.结论 利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出特异性的人源性抗人cyclinD1抗体.     

盐酸克伦特罗生物素化单链抗体在大肠埃希氏菌中的表达

目的 提取盐酸克伦特罗(CLB)生物素化抗体片段蛋白进行表达,为下一步纯化及农兽药品快速检测奠定基础。方法 确定一株生物素化CLB噬菌体抗体 “pHEN1-BHNS-CLB1”对其进行蛋白表达,即从噬菌粒“PHEN1-BHNS-CLB1”切下scFv基因片段,亚克隆至能引导可溶性表达的载体pCANTAB5E上,完成了重组质粒的构建,将所构质粒转化大肠埃希氏菌感受态细胞BL21。命名“5E-BHNS-CLB1”,并对“5E-BHNS-CLB1”进行PCR及酶切鉴定后,测序分析。结果 ELISA结果证明其具有较好的亲和性,竞争抑制ELISA、与gp120蛋白及三聚氰胺的交叉反应ELISA结果均证明其具有很好的特异性,片段大小与预想目的片段大小一致,SDS-PAGE及Western blotting的结果显示,其分子量大小与目的一致,并能与抗E-tag标签抗体结合显色。结论 说明表达的蛋白能与表达载体5E后带有E-Tag标签的短肽作用,含有E-Tag标签,是我们要表达的目的蛋白,为下一步纯化蛋白创造了条件。     

抗AEG-1单链可变区抗体的原核表达及纯化

目的构建抗星形细胞上调基因1(AEG-1)单链可变区抗体(V23)的原核表达载体,并对表达蛋白进行纯化及免疫活性检测。方法应用Primer5软件设计针对抗AEG-1单链可变区抗体基因序列的引物,构建PRsetC/V23原核表达质粒,经限制性内切酶Pst1酶切以及DNA测序鉴定正确后,将原核表达质粒导入大肠杆菌BL21中,构建含V23基因的原核表达工程茵。经IPTG诱导后,用带His标签的磁珠纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳检测目的蛋白含量,Western blot及ELISA检测抗AEG-1单链可变区抗体的免疫活性。结果构建的原核表达质粒PRsetC/V23经单酶切和测序分析显示,构建的V23基因与设计序列100%一致。IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示在31×103处出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在80×103处出现AEG-1特异反应条带,ELISA检测显示阳性结果。结论成功构建了PRsetC/V23原核表达质粒及V23原核表达工程茵,该工程茵可表达抗AEG-1单链可变区抗体蛋白,且该蛋白具有良好的免疫活性。     

急性淋巴细胞白血病单链抗体(scFv)的筛选与鉴定

目的 筛选急性淋巴细胞白血病病人单链可变区scFv抗体,为进一步表达并得到其特异性强的抗体片段创造条件。方法 实验利用初诊急性淋巴细胞性白血病病人血清为包被抗原,采用噬菌体表面展示技术,从半合成的人源噬菌体抗体库中筛选其特异性噬菌体抗体,首先把靶抗原包被于免疫平板后,加入噬菌体抗体库,这样能与靶抗原特异性结合的噬菌抗体就被固定在免疫平板上,不能特异结合的噬菌体则被漂洗掉; 将特异结合的噬菌体洗脱下来,侵染大肠埃希菌,就可以得到含特异抗体基因的噬菌粒。结果 经过3轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原特异性较强的白血病病人可变区噬菌体抗体片段并鉴定。结论 获得了一株亲和性较好的抗体片段,为下一步片段表达、鉴定及临床应用研究创造了条件。     

乙型肝炎病毒表面抗原特异性结合肽的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定与乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg ）特异性结合的多肽。方法将酵母表达的HBsAg包被在微孔板上,加入噬菌体进行随机肽库筛选,经过4轮筛选后,随机挑取15个克隆进行DNA测序,并通过夹心ELISA方法鉴定其亲和力,采用剂量依赖结合实验和竞争抑制实验检测其与 HBsAg结合的特异性。结果经过4轮筛选,得到一优势克隆No ．3,展示肽段为SSYAPYVWQPIA ,与 HBsAg有较强的亲和力,剂量依赖结合实验和竞争抑制实验证明克隆No ．3与HBsAg的结合是特异性的。结论利用噬菌体展示肽库技术可以获得HBsAg特异性结合肽,此多肽可以作为靶向分子用于乙型肝炎的基因治疗,为乙型肝炎的靶向基因治疗奠定实验基础。     

人前列腺癌细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与人前列腺癌细胞系PC3M细胞特异结合的短肽，作为人前列腺癌靶向治疗的先导化合物。方法以PC3M细胞为靶细胞，正常人前列腺细为吸附细胞对噬菌体7肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫荧光细胞化学胞染色鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选，从随机挑选的10个噬菌体克隆中得到8个能特异性与PC3M细胞结合，而不与正常人前列腺细胞结合的阳性克隆。其氨基酸序列有一定同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合PC3M细胞的噬菌体克隆。本实验获得的短肽具有一定的肿瘤亲合力和特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

抗人Cyclin D1人源单链抗体AD9的表达及活性分析

目的 原核表达、纯化抗人cyclin D1人源单链抗体(AD9)并对其活性进行分析.方法 将含有AD9基因片段的噬菌粒转化大肠杆菌HB2151后,IPTG诱导表达,ELISA鉴定培养上清具有与cyclin D1蛋白结合活性后,经硫酸铵沉淀,His Trap HP亲和纯化,获得抗人cyclin D1人源单链抗体(AD9),进一步利用ELISA和Western blot对其进行鉴定和活性分析.结果 IPTG诱导AD9可溶性表达,培养上清经硫酸铵沉淀和亲和纯化后,获得纯度达95%的单链抗体蛋白,ELISA和Western blot结果表明,诱导上清及纯化的AD9均能够与人Cyclin D1蛋白有特异性结合,AD9的分子量约为30 kDa.结论 成功地可溶性表达和纯化了,具有较好的结合人Cyclin D1蛋白活性的抗人Cyclin D1人源单链抗体.     

结肠癌组织中差异表达基因的筛选和鉴定

目的 筛选和克隆结肠癌和正常结肠组织差异表达的基因片段,为探讨结肠癌的发病机制提供线索。方法 应用基因差异显示技术（DD—PCR）,比较结肠癌和正常结肠组织基因表达的差异,对其中一条有明显差异的基因片段进行克隆、测序,测序结果提交GenBank数据库中进行同源性分析,并用半定量RT—PCR进行初步鉴定。结果 同源性分析表明,该片段与已知基因DDX32高度同源（99％）。RT—PCR结果显示,在结肠癌组织中该基因mRNA的表达水平显著高于正常结肠组织（P〈0．05）。结论 DD—PCR是筛选差异表达基因的有效手段;在结肠癌组织中DDX32基因的表达显著高于正常结肠组织,此结果为研究DDX32基因在结肠癌发病中的作用提供了线索。     

Evaluation of the ID-gel test for antibody screening and identification

Summary. A gel technique for the detection of red blood cell (rbc) antigen-antibody reactions was evaluated for use in antenatal antibody screening and identification procedures. The evaluation was undertaken on 3,900 random antenatal samples. Results obtained in the gel test system were compared with those obtained from parallel testing using conventional serological methods. The ID gel system detected 148 (3·7%) red cell antibodies, compared with 95 (2·4%) using traditional techniques. The number of non-specific antibodies and false-positive screens were reduced using the gel test system. Antibody titres performed using the gel system were more sensitive than with our tube 1AT method. The gel system was easy to use and gave reliable, reproducible results. Antibody detection rates were enhanced compared with our existing routine techniques.     

晚期氧化蛋白产物模拟表位的初步研究

目的利用噬菌体展示肽库筛选技术获得模拟人晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products,AOPP）表位的序列,探索该表位的分布与表达。方法以抗晚期氧化蛋白产物多克隆抗体为靶,对噬菌体随机12肽库进行免疫亲和筛选,ELISA鉴定阳性噬菌体克隆特异性;对阳性克隆进行DNA测序并推导其氨基酸序列,利用生物信息学技术检索其分布与相似性。结果经3轮亲和筛选获得18株与靶分子特异结合的阳性噬菌体克隆,阳性率为62.07%。竞争ELISA结果表明,AOPP可有效抑制阳性噬菌体克隆与抗体结合,其中对No.6克隆的IC50达到0.2ug/ml,提示其能模拟AOPP表位。经DNA测序并推导氨基酸序列,得到LXDMLXD保守序列（X为任意氨基酸）;发现该序列不存在于正常人与哺乳动物的蛋白分子,但与某些真菌及寄生虫蛋白分子有同源性。结论通过噬菌体肽库筛选技术获得模拟AOPP表位并具良好抗原性的短肽序列;证实该结构不存在于正常人与哺乳动物蛋白分子,正如AOPP并非正常组织蛋白。     

The use of pooled red cells and column techniques for routine red cell antibody detection

Summary. The object of antibody screening is to detect all clinically relevant antibodies. In order to do this effectively red cells are selected with an appropriate antigen profile. The introduction of column techniques for antibody screening by indirect antiglobulin testing (IAT) and two-stage enzyme testing (ETC) is perceived to lead to an increased sensitivity and an ability to detect red cell antibodies more easily than by traditional tube techniques because reactions in columns are more easily read and are stable. We evaluated the use of a column technology with pooled red cells for routine antenatal screening. The pooled cells used contained at least one cell with homozygous antigen expression for the majority of clinically significant antibodies known to be present, except for Kell. Pooled cell results were not as easy to read in gel columns when compared with single cell results due to weaker reactions which were often diffused throughout the gel in the column. We concluded that the use of pooled cells led to a decreased sensitivity which proved problematic for the interpretation of results. We used a two-cell and a three-cell pool and found that detection of known antibodies was reduced in IAT and ETC methods.