恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白与真核表达质粒免疫特性的比较

目的　探讨以恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (PfHRP2 )为基础的不同形式的侯选疫苗诱导小鼠免疫应答的特性 ,为包含HRP2的恶性疟红内期疫苗的研制提供实验依据。方法　用重组蛋白TP HRP2及真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2免疫BALB c小鼠 ,对抗体应答的动力学及特异性进行分析 ,取脾细胞进行体外增殖实验 ,用免疫血清进行P f.体外生长抑制实验。结果　重组蛋白TP HRP2加福氏佐剂诱导BALB c小鼠产生了高水平的抗体 ,其抗体产生快、持续时间久 ,并具较高的特异性 ,细胞应答被同期激活 ,免疫血清可明显抑制红细胞内发育期疟原虫。重组真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2诱导BALB c小鼠产生了较高水平和具有一定特异性的抗体 ,其抗体的产生需要多次免疫和较长时间 ,初始化的脾细胞对抗原再刺激的回忆应答显著 ,但免疫血清对疟原虫的体外生长没有抑制作用。结论　HRP2重组蛋白与真核表达质粒在小鼠具有较为不同的免疫特性 ,HRP2重组蛋白疫苗具有潜在的应用前景     

重组恶性疟原虫醛缩酶鉴定及其单克隆抗体的制备

目的 鉴定重组表达的恶性疟原虫醛缩酶（ALD），制备针对此酶的单克隆抗体。 方法 用PCR法扩增恶性疟原虫海南株ALD基因，经大肠埃希菌表达并纯化的ALD免疫BALB/c小鼠，腹腔注射免疫3次,每次间隔2周，加强免疫后3d取免疫小鼠脾细胞制备单克隆抗体。同时用获得的免疫血清进行间接荧光抗体试验（IFAT）和蛋白质印迹（Westernt blotting）分析。 结果 ELISA检测表明，小鼠能产生较高的针对ALD免疫应答，3次免疫后血清中特异性抗体滴度达1∶10⁵，IFAT显示免疫血清能特异性识别疟原虫体内的抗原；Western blotting分析显示免疫血清识别的疟原虫蛋白相对分子质量（Mr）约41 000；所制备的免疫血清与人红细胞内醛缩酶无交叉反应。经ELISA检测 3次，筛选获得7株分泌针对ALD的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3株分泌的单克隆抗体能识别培养的恶性疟原虫；抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型。 结论 本实验构建并表达了重组疟原虫糖酵解醛缩酶，并获得特异性的单克隆抗体。     

新孢子虫NcGRA2蛋白多克隆抗体的制备及其亚细胞定位

目的制备重组新孢子虫NcGRA2t全蛋白去掉信号肽多克隆抗体并纯化,研究其在新孢子虫虫体内的定位。方法用新孢子虫NcGRA2t蛋白进行体外原核表达,纯化后免疫健康BALB/c小鼠,制备抗血清,采用Western blot分析抗体特异性,采用免疫荧光法检测NcGRA2蛋白在新孢子虫处于细胞内阶段和细胞外阶段时的亚细胞定位。结果Western blot检测,制备的鼠抗NcGRA2t多克隆抗体能与新孢子虫裂解抗原发生特异性反应。间接免疫荧光分析,NcGRA2蛋白在细胞内阶段和细胞外阶段的虫体细胞质中均呈现绿色荧光。结论本研究制备并纯化了新孢子虫NcGRA2蛋白多克隆抗体,用该抗体可检测到新孢子虫NcGRA2蛋白存在虫体的细胞质中。     

重组表达的恶性疟原虫顶端膜抗原1片段诱导小鼠保护性抗体应答

目的分析恶性疟原虫顶端膜抗原(apicalmembraneantigen1,AMA1)主要结构域在诱导保护性抗体应答中的作用,为正确选择疫苗应用片段提供依据。方法PCR扩增编码P.fAMA1相应结构域的基因序列,构建pET原核表达载体,用纯化重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA测定抗体效价,用免疫荧光和免疫印迹分析抗体的特异性,用小鼠免疫血清进行疟原虫体外生长抑制实验。结果成功表达并纯化了代表AMA1不同结构域的重组抗原片段,包括完整的胞外域片段E、结构域Ⅰ+Ⅱ、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,免疫小鼠后分别诱导出不同滴度的IgG抗体,免疫血清可特异地识别天然AMA1抗原,重组蛋白E和Ⅰ+Ⅱ免疫血清可明显抑制疟原虫的体外生长。结论AMA1胞外结构域的完整性是构成保护性抗体表位的重要基础,保护性抗体表位主要分布在结构域Ⅰ中。     

恶性疟原虫保护性抗原复合基因——痘苗病毒重组活疫苗 …

用恶性疟原虫－痘苗病毒重组活疫苗候选株的家兔免疫血清及纯化的ＩｇＧ进行了恶性疟原虫的体外培养抑制试验，并与该目的基因的原核表达蛋白及全虫抗原进行了比较。结果在疟原虫的第一个生长周期内，重组痘苗病毒组的免疫血清抑制虫作用最强，其次为全早主原核蛋白组，ＩｇＧ则在第一及第二个生长周期均以原核表达蛋白组抑虫作用最强，其次为重组痘苗病毒及全虫抗原组，说明重组痘苗病毒免疫血清及ＩｇＧ具有一定的体外抑制恶性疟原     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体的制备

目的制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体。方法克隆、表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,并以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,对所制备的单克隆抗体确定其亚类和效价,蛋白质印迹法(Western blotting)分析其特异性。结果成功克隆并表达了恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白作为免疫源制备单克隆抗体,共筛选了15株能高效分泌效价在1∶6 400～1∶51 200特异抗体的细胞株,抗体亚类为IgG1或IgG2。所有抗体均能唯一识别恶性疟原虫虫源蛋白Mr 33 000组分,而与疫区非疟疾发热病人的红细胞组分无交叉反应。结论以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白为免疫源成功制备了能识别天然恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的特异性单克隆抗体。     

大肠埃希菌表达的恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP1-42的免疫原性

目的纯化大肠埃希菌Rosettagami（DE3）表达的可溶性裂殖子表面蛋白1C末端蛋白（MSP1-42,3D7株）,检测其体外抑制恶性疟原虫生长的效果。方法利用大肠埃希菌Rosettagami（DE3）为宿主菌诱导表达MSP1-42,用带组氨酸标签的镍柱纯化可溶性的MSP1-42。6只新西兰白兔随机分为免疫组和对照组,每组3只。用MSP142与弗氏佐剂乳化后,皮下注射,抗原免疫剂量每次为200“g／只,共免疫4次,每次间隔2周。佐剂对照组以PBS代替抗原同法免疫。免疫前及末次免疫2周后取血,用酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验检测血清中特异性抗体及其与天然抗原的反应,用含10％和20％免疫血清的培养基体外培养恶性疟原虫（海南分离株,Fcc1／HN）,检测免疫血清体外抑制恶性疟原虫生长的效果。结果经镍柱纯化后获得纯度为95％以上的MSP1-42蛋白;免疫组个体在第4次免疫后血清特异性抗体的滴度依次为1：640000、1：640000、1：160000,间接荧光抗体试验检测表明MSP1-42免疫兔血清与恶性疟原虫表面蛋白有阳性反应;免疫血清能抑制恶性疟原虫在体外生长,在10％浓度时,3只免疫兔血清的抑制率依次为（51．94-24．2）％、（29．4±8．6）％和（86．7±7．4）％,在20％浓度时,抑制率分别为（93．3±7．5）％、（65．3±10．6）％和（96．4±1．0）％。结论大肠埃希菌Rosettagami（DE3）表达的MSP142蛋白免疫血清能识别恶性疟原虫天然抗原,体外培养能抑制恶性疟原虫的生长。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)与谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,测定重组蛋白的免疫活性。方法　采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫 (海南株 )乳酸脱氢酶基因 ,经双酶切后克隆入 pGEX 4T 1表达载体中 ,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清 ,并用琼脂双向扩散法检测效价 ,ELISA、Western bloting检测重组抗原的免疫活性。结果　得到了重组表达的蛋白抗原 ,表达产物能与兔抗恶性疟原虫血清发生反应 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,免疫琼脂扩散法抗体滴度为 1∶16。结论　LDHp在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

淋球菌MlaA重组蛋白表达及多克隆抗体的制备与应用

目的 原核表达、纯化淋球菌MlaA蛋白,制备并鉴定其多克隆抗体。方法 构建原核表达载体pET-28a-MlaA,转化BL21(DE3)大肠埃希菌,经IPTG诱导重组蛋白的表达。通过亲和层析法纯化目的蛋白,并进行Western blot鉴定。以纯化的重组蛋白作为抗原,与佐剂乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后取小鼠静脉血并分离血清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定抗体效价,用Western blot、间接免疫荧光试验(IFA)和流式细胞术(FCM)检测MlaA多克隆抗体的反应性和特异性。结果 Western blot显示,pET-28a-MlaA转化BL21后表达相对分子质量为35×10³的淋球菌MlaA重组蛋白。ELISA检测MlaA免疫小鼠血清抗体效价为1∶8 000～1∶32 000。Western blot、IFA和流式细胞术检测制备的抗体能识别淋球菌变性和非变性MlaA蛋白。结论 成功表达并纯化淋球菌MlaA重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,将制备的抗体血清作为一抗对淋球菌及其他不同类菌株进行Western Blot检测后发现,制备的多克隆...     

恶性疟原虫复合抗原重组真核表达质粒的构建与表达

目的　构建编码恶性疟原虫不同发育期抗原表位的复合抗原基因HGFSP的重组真核表达质粒。　方法　将HGFSP亚克隆于真核表达载体pcDNA3构建重组真核表达质粒 pc HGFSP ;琼脂糖凝胶电泳和限制性内切酶分析鉴定 ;脂质体介导转染HepG2细胞。取经G418筛选的阳性细胞克隆进行免疫学鉴定。 　结果　酶切及电泳鉴定证实pc HGFSP含有HGFSP。间接免疫荧光试验 (IFAT)、SDS PAGE及Westernblotting结果显示 ,pc HGFSP转染细胞含有可与HGFSP原核表达蛋白免疫血清产生特异性免疫反应的蛋白 (包含恶性疟原虫MSA1、MSA2、RESA和CSP中的抗原表位 ) ,其分子量与按HGFSP长度推算的蛋白分子量接近。　结论　用HGFSP成功构建恶性疟原虫复合抗原真核表达质粒 pc HGFSP ,其表达产物具免疫反应性。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因片段的亚克隆及表达

目的 构建恶性疟原虫FCC－1／HN株CSP基因的重组真核表达质粒pBK－CSP,在大肠杆菌中进行表达,并进行鉴定。方法 采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒pBCG5.6/CSP中分离出经过测序鉴定的CSP基因片段,将其亚克隆于pBK－CMV真核表达载体,构建重组真核表达质粒pBK-CSP.经IPTG诱导,重组质粒在大肠杆菌DH5α中进行表达,并进行SDS－PAGE及免疫印迹分析。结果 从pBCG5.6/CSP中分离出SP基因片段,成功构建pBK-CSP重组质粒;SDS－PAGE及免疫印迹分析结果显示特异性蛋白条带的相对分子质量约为42000。结论 从pBCG5．6／CSP中成功分离出CSP基因片段,并成功构建pBK-CSP重组质粒,诱导表达CSP非融合蛋白,为恶性疟原虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白的克隆表达及纯化

目的克隆肝螺杆菌（H.hepaticus）甲基基团接受趋化信号转导蛋白（MCP）基因,制备MCP重组蛋白,为以后检测我国人群肝螺杆菌感染率提供实验基础。方法利用PCR方法扩增目的基因片段,连接至原核表达载体pET22b（＋）,构建MCP的原核表达质粒pET22b＋/MCP。将质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组蛋白。结果构建了原核表达质粒pET22b＋/MCP,含有该质粒的大肠杆菌经1 mmol/L IPTG诱导4 h后表达一相对分子质量约14 kD的重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析系统纯化获得了MCP的纯化重组蛋白rhMCP。结论获得了肝螺杆菌MCP的纯化重组蛋白,为进一步利用血清学方法调查我国人群肝螺杆菌感染率提供可能。     

裂谷热病毒Gn蛋白主要抗原区的表达、纯化及抗原性分析

目的 通过原核表达系统制备裂谷热病毒Gn片段主要抗原区蛋白,获取纯化蛋白,并分析抗原性。方法 将合成的裂谷热Gn基因用PCR的方法扩增具有保护性抗原表位的两段Gn1和Gn2,并将其定向插入原核表达质粒pColdⅠ中,构建重组表达质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2,并将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态中,以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白和表达量,并利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果 所构建的质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白,Western-blot显示截断的Gn蛋白具有很好反应原性。结论 成功纯化了裂谷热病毒Gn主要抗原区的表达蛋白。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP1-42基因的合成及其表达

目的 利用大肠杆菌表达系统表达可溶性的恶性疟原虫(3D7株)裂殖子表面蛋白1C末端MSP1-42蛋白.方法 采用两步PCR法拼接合成全长msp1-42基因,将测序正确的msp1-42基因构建至pET32a(+)表达载体,获得pET32amsp表达质粒,热激转化至宿主菌Rosetta gami(DE3)中进行诱导表达,用免疫印迹法检测表达产物.结果 全合成了恶性疟原虫3D7株msp1-42基因,合成基因在Rosetta gami(DE3)中以可溶性形式高水平表达,所表达的重组蛋白能与识别MSP1-19构象表位的单克隆抗体mAb5.9、PfCP2.9兔血清及恶性疟患者血清发生免疫反应.结论 合成的msp1-42基因能在大肠杆菌表达系统中以可溶性的形式表达,所表达的重组蛋白MSP1-42具有抗原性.     

恶性疟原虫海南分离株裂殖子表面蛋白2真核表达重组质粒的构建

目的　构建恶性疟原虫海南分离株 ( FCC1/ HN)裂殖子表面蛋白 2 ( MSP2 )融合 HBs Ag基因片断真核表达质粒 p VX-ORF1- Pf MSP2 - HBS及重组真核表达质粒 p VXORF1- Pf MSP2 ,为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定基础。　方法　 ( 1)采用 PCR技术对恶性疟原虫 FCC1/ HN株 MSP2 原核表达质粒 PET2 8α- MSP2 的 MSP2 基因进行扩增 ,扩增产物经纯化后用 Bam H 酶切 ;质粒 p VXORF1- Pv MSP1 .1 9- HBS用相同的酶酶切 ,经纯化后用 T4DNA连接酶将其与酶切后纯化的 MSP2 基因连接 ;( 2 )分别用Bam H +Xho 双酶切 PET2 8α- MSP2 质粒 DNA和 p VXORF1质粒 DNA,纯化后将目的基因片断用 T4DNA连接酶连接 ;将 ( 1)、( 2 )连接产物分别转化大肠杆菌 DH5α。于氨苄青霉素阳性 L B培养平板上筛选阳性克隆 ,酶切电泳鉴定。　结果　筛选出的重组子为编码 FCC1/ HN MSP2 基因片断的重组质粒 p VXORF1- Pf MSP2 - HBS及 p VXORF1- Pf MSP2 。　结论　编码 FCC1/ HN MSP2 基因片断真核表达质粒 p VXORF1- Pf MSP2 - HBS和 p VXORF1- Pf MSP2 的构建为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定了基础。     

恶性疟原虫配子体期特异性蛋白Pfgdv1克隆表达及鉴定

目的克隆恶性疟原虫配子体期特异性基因(Plasmodium falciparum gametocyte development 1 gene,Pfgdv1),体外表达和鉴定重组Pfgdv1蛋白。方法通过PCR法从恶性疟原虫感染病人血液DNA样本中扩增Pfgdv1基因,插入到原核表达载体p ET28a(+),构建p ET28a-Pfgdv1重组表达质粒,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+),通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达重组蛋白,经Ni+-亲和层析柱纯化重组蛋白,纯化产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定。结果 PCR扩增的Pfgdv1基因长度约为1.65 kb,重组p ET28a-Pfgdv1质粒构建成功,插入方向正确无框移,转化至E.coli BL21(DE3+)所表达的重组蛋白分子量约为67 k Da,且能被抗His标签单克隆抗体识别。结论成功克隆了Pfgdv1基因,表达并纯化了重组Pfgdv1蛋白,为进一步研究恶性疟原虫配子体期传播阻断疫苗奠定了基础。     

亚洲牛带绦虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因(Ta PITPα),探索其应用前景。方法将亚洲牛带绦虫成虫PITPα克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-Ta PITPα重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清和感染了亚洲牛带绦虫的猪血清识别,表明其具有免疫活性。结论亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因可在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得具有免疫活性的高效表达,为进一步的功能研究奠定了基础。