对检测乙型肝炎方法的研究

血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)是HBV感染的直接证据,是反映体内病毒复制的主要指标,在乙型肝炎传染性的判断、抗病毒药物疗效评价和监测中有着重要意义.临床常用检测HBV DNA技术有普通聚合酶链式反应(C-PCR)和荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR) 技术.我们用C-PCR和FQ-PCR分别检测249例乙型肝炎患者的血清HBV DNA,并用ELISA检测了HBV血清标志物,比较了不同HBV血清标志物阳性标本的2种HBV DNA检测结果以及HBV基因组在血清中的荧光波长阈值,并探讨C-PCR和FQ-PCR的临床应用价值.     

真核细胞DNA聚合酶

近年来,其核细胞DNA体外复制模型的建立及蛋白纯化技术的提高,DNA聚合酶基因的克隆,真核细胞DNA聚合酶研究取得了很大进展。迄今为止,已发现α、β、γ、δ、ε、ζ等6类真核细胞DNA聚合酶,分别在DNA复制和修复等事件中起到重要作用。     

近端结肠癌中微小卫星的不稳定性

作者用以聚合酶连反应(PCR)为基础的分析方法,在90例结直肠肿瘤中研究了分别位于染色体5q(Mfd27),17p(Mfd41),18q(Mfd26)和15q(635/636)4种微小卫星的变化。发现25例(28％)肿瘤具有与正常DNA不同的区带类型。变化的程度差别很大,从2bp到片段的改变不等。为了便于分析,作     

DNA聚合酶Y家族在跨损伤复制中的作用

普通的DNA聚合酶可以对正常的DNA完成复制,但是当DNA发生损伤,损伤位置就会成为DNA复制的阻滞点,普通的DNA聚合酶就无法完成基因组的复制。为了应对这种情况,生物体内还拥有另一类DNA聚合酶:聚合酶Y家族,又被称为跨损伤复制(TLS)聚合酶,它们的主要功能就是跨越损伤位点,完成基因组复制,解救濒死细胞。本文主要对Y家族聚合酶的结构特点、功能效应、作用机制等方面做一综述。     

跨损伤合成DNA聚合酶ζ-Rev7在肿瘤发展中的研究进展

跨损伤DNA合成(TLS)属于一种复制后修复过程,主要涉及DNA聚合酶κ、η和ζ等。跨损伤修复是细胞内一种DNA损伤耐受机制,DNA聚合酶ζ在这一过程中扮演着重要的角色,DNA聚合酶ζ主要由亚基Rev7和Rev3构成,在细胞代谢中的作用主要是参与跨损伤修复。Rev7(也称为MAD2L2)是一种多功能蛋白,能够与多种蛋白结合,参与DNA损伤修复、细胞的周期调节、基因表达和致癌作用。同时也参与调控多种不良肿瘤的预后过程。     

聚合酶3′外切活性对3′硫化修饰引物聚合反应的影响

目的 探讨硫化修饰的次3′末端不配对引物能否引发高保真DNA聚合酶介导的聚合反应的非成熟性终止,即所谓聚合反应的“关”效应。方法 采用配对及非末端不配对的3′硫化修饰引物,研究其对不同保真度DNA聚合酶引物延伸反应的影响。结果 非末端不配对的3′硫化修饰引物也能引发高保真DNA聚合酶介导的聚合反应非成熟性终止,而对低保真DNA聚合酶所介导的聚合反应则无明显影响。同时,3′硫化修饰的配对引物对不同保真度DNA聚合酶引物延伸反应均无影响。结论 硫化修饰的次3′末端不配对引物与3′末端不配对引物对引物延伸的影响相似,同样能引起高保真DNA聚合酶介导的聚合反应的“关”的效应。显然,在单基因遗传病的诊断及单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SHIP)的高通量分析等方面,硫化修饰的碱基特异性引物与高保真DNA聚合酶所构成的对SNP敏感的“开／关”系统,具有广阔的应用前景。     

依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ与基因表达和基因治疗

依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ (polⅢ )能催化 5SrRNA、tRNA、U6SnRNA等一些小的、稳定的RNA的合成。文章综述了依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ的启动子和转录复合物 ,并介绍了RNA聚合酶Ⅲ的转录在基因表达和基因治疗 (核酶、反义核酸、RNA干扰技术等 )研究中的应用价值。     

IgA肾病组蛋白H3K4三甲基化和DNA甲基化基因修饰的相关性

目的: 探讨IgA肾病(IgAN)外周血单个核细胞(PBMCs)组蛋白H3赖氨酸4 (H3K4)三甲基化与DNA甲基化之间的关系。方法: 采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(ChIP-chip)对40例IgAN患者和40例健康者的PBMCs H3K4三甲基化进行高通量筛选,染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶链反应 (ChIP-qPCR) 验证芯片结果,定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测阳性基因的mRNA表达水平,采用甲基化DNA免疫共沉淀定量聚合酶链反应(MeDIP-qPCR)检测DNA甲基化水平。结果: IgAN病人PBMCs 基因组H3K4三甲基化水平升高,基因组DNA甲基化水平降低。 4个阳性基因H3K4三甲基化水平和DNA甲基化水平与正常对照组相比,显著差异(P<0.05)。结论: IgAN患者PBMCs基因组H3K4三甲基化和DNA甲基化水平存在显著改变,DNA甲基化和组蛋白H3K4三甲基化基因修饰存在相互作用。     

大白鼠肝脏中依赖RNA的DNA聚合酶

1970年Temin和Baltimore发现在劳氏鸡肉瘤病毒(RSV)存在依赖于RNA的DNA聚合酶(RD-DP),即反向转录酶,从而修正了遗传信息流的“中心法则”,尔后又在病毒或其他生物中发现逆转录酶。本文作者应用Lewis的方法,成功地在哺乳动物大白鼠的肝脏中分离出RDDP,并对其特征进行了生化分析。将Wistar大白鼠肝脏置于甘氨酸缓冲液中并使之匀浆化,离心得到上清液部分(100,000g)然后用Lewis法分离鼠肝中RDDP,据Lewis的资料,反向转录酶和DNA聚合酶β首先是通过DE-52层析洗脱得到,但在此阶段不能将这两种酶分离开来;因     

支原体科病原体分子检测方法学研究

支原体科微生物感染不仅可致人体炎症及并发症(不孕不育、妊娠不良结局等),近年并发现支原体是HIV感染的协同因子。支原体体外培养困难,且不同的支原体感染可有相同的疾病谱。为此我们建立了以外套通用扩增、内套种特异扩增的9种支原体套式聚合酶链反应(nPCR)检测方法,为满足进一步确认和变异株研究并建立了nPCR产物全自动DNA测序方法。方法学考核结果为本nPCR检测技术为支原体种特异、灵敏度可达1fg支原体DNA(约一个支原体菌体)。nPCR检测全流程仅需5小时。     

互隔交链孢酚对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β的致突变作用*

背景：近年来研究发现食管癌细胞中存在DNA聚合酶β的突变。 目的：观察互隔交链孢酚对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β基因序列的影响,研究互隔交链孢酚致细胞变异的机制。 方法：用不同浓度(2,4,6,8 μmol/L)的互隔交链孢酚作用于NIH/3T3细胞,并设置对照组。用RT-PCR法从细胞总RNA中扩增出DNA聚合酶β基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆至pGEM-T载体后进行测序,分析其序列变化。 结果与结论：2 μmol/L互隔交链孢酚处理后的细胞内DNA聚合酶β基因序列无任何变化。而4 μmol/L组中DNA聚合酶β基因有1个位点发生突变,8 μmol/L组和16 μmol/L组中各有2个位点发生突变,此3组的突变存在相同的位点。结果证实,互隔交链孢酚可导致NIH/3T3细胞中的DNA聚合酶β发生点突变,互隔交链孢酚浓度越高,点突变的数量越多,且存在突变活跃位点。                               

~(32)P-HBV DNA探针的制备

<正> 自从1973年Kaplan和1974年Ro-binson证实乙型肝炎病毒(HBV)内含有内源性DNA聚合酶(DNAP)活性以来,许多研究者利用其内源性DNAP活性,以原HBV DNA为模板,用放射性核素标记制备HBV DNA探针来进行HBV DNA分子生物学的研究。     

一例脊髓小脑共济失调疑似肝豆状核变性患者的基因检测分析

目的应用聚合酶链式反应及Sanger测序法对一例神经系统性疾病患者进行鉴别诊断,辅助临床确诊。方法对患者进行外周血DNA提取后,使用聚合酶链式反应和Sanger测序法分析基因组DNA改变,并对其家系以及100例正常人进行DNA分析,从而辅助临床进行疾病确诊。结果基因组DNA分析发现,患者携带肝豆状核变性相关基因ATP7B的3个突变(11号外显子c.36GA、12号外显子c.125GA?和13号外显子c.108TG),但是家系内成员和正常人也有携带。同时发现患者脊髓小脑共济失调相关基因ATXN3中CAG重复次数为27/57,超过正常重复次数(12-40)。结论通过基因检测技术对患者基因组DNA进行分析,结合相应临床症状,确诊该患者为3型脊髓小脑共济失调。因此,对于临床上难以鉴别的疑难病例,可以考虑使用分子生物学检测辅助诊断。     

荧光定量聚合酶链反应检测HBV-DNA的意义

目的　研究HBV DNA与HBV M、乙型肝炎临床类型的相关性 (意义 )。方法　用荧光定量聚合酶联反应 (FQ PCR)检测 10 5例乙型肝炎患者HBV DNA含量 ,分析其在乙型肝炎 5项指标(HBV M)中的检出率 ,在乙型肝炎不同类型中的分布。结果　HBV DNA与HBV M对比 ,HBsAg( )、HBeAg( )、HBcAb( )患者的检出率为 97% ,HBsAg( )、HBeAb( )、HBcAb( )患者的检出率为75 % ,HBsAg( )、HBcAb( )患者的检出率为 6 0 % ,HBsAg( )患者的检出率为 4 0 % ,HBsAb( )、HBeAb( )、HBcAb( )的 (或HBsAb阳性、HBcAb阳性 )病例未检测到HBV DNA。表明HBV DNA与HBV M的抗原呈正相关 ,组间差异有非常显著意义 (P <0 0 5 )。急性乙型肝炎血清HBV DNA检出率为 72 2 % ,慢性乙型肝炎检出率为 75 % ,肝硬化检出率为 70 %。血清HBV DNA与乙型肝炎不同临床类型差异无显著意义 (P >0 0 5 )。结论　HBV DNA的复制状态与不同乙型肝炎临床类型无明显相关性。与乙型肝炎抗原呈正相关。     

DNA聚合酶Pol(t)在紫外损伤诱导基因组高突变中的作用

目的 研究DNA聚合酶Polt在紫外损伤耐受及基因组高突变产生中的生物学作用.方法 紫外线照射稳定高表达DNA聚合酶iota(DNA polymerase iota,Pol(t))的HEK293T细胞系(Pol(t)-HEK293T),MTT法检测紫外损伤后细胞的存活率;supF报告基因体内突变检测系统检测基因的突变频率.结果 MTT法结果提示紫外照射后稳定高表达Pol(t)的细胞系与对照组相比细胞存活率没有显著差异;supF报告基因结果显示稳定高表达Pol(t)的细胞系其基因突变频率高于对照组细胞.结论 DNA聚合酶Pol(t)的高表达对紫外损伤后细胞的存活率没有显著影响,不能提高细胞对紫外损伤的耐受,在紫外损伤中pol(t)主要参与诱发体内基因组高突变的产生.     

PCR技术的研究进展与临床应用

聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reactionm ,PCR)是一项体外基因扩增技术 ,1985年美国 PE公司人类遗传研究室 Mullis等人发明了该项技术 ,Saiki等首先应用于镰状红细胞贫血的产前诊断〔1〕 ,但由于操作方法繁琐未能全面推广应用。直到 1988年耐热 DNA聚合酶 (Taq酶 )的发现和应用〔2〕 ,使 PCR技术变得极为简单 ,才被迅速应用于分子生物学、生物工程、医学、法医学领域 ,也使人类疾病的基因诊断进入了临床实用阶段。历经十余年 ,PCR技术已由当初只能对样品中的 DNA和 RNA定性分析发展到能够进行定量分析。本文对 PCR技术的研究…     

提高SAF基因启动子区DNA模板聚合酶链式反应的扩增效率

背景：血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区鸟嘌呤和胞嘧啶的含量偏高,常规聚合酶链式反应扩增不易成功。 目的：探索提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区富含鸟嘌呤和胞嘧啶的DNA模板聚合酶链式反应扩增方案及优化的扩增体系。 方法：提取THP-1细胞基因组DNA作为模板,通过97 ℃高温预变性及最佳退火温度的探索优化聚合酶链式反应的反应条件,在聚合酶链式反应扩增体系中添加不同浓度的增强剂二甲基亚砜改善反应体系。建立提高血清淀粉样蛋白A 转录激活因子基因富含鸟嘌呤和胞嘧啶的启动子区聚合酶链式反应扩增效率的方法,同时评估不同浓度二甲基亚砜对聚合酶链式反应扩增结果的影响。 结果与结论：97 ℃高温预变性使模板DNA充分解链,同时提高退火温度至60 ℃,有利于提高聚合酶链式反应扩增产率;反应体系中添加2%二甲基亚砜可以提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区聚合酶链式反应产物的特异性和产率,但是鸟嘌呤和胞嘧啶含量不同对增强剂的依赖不一样。结果证实,高温预变性和较高的退火温度可以保证充分解链的模板DNA与引物特异性结合,但是DNA模板鸟嘌呤和胞嘧啶含量的不同对增强剂二甲基亚砜的依赖有差异。     

应用PCR和ELISA法检测血清HBV的结果分析

在1985年美国Cetus公司遗传部Mullis等发现聚合酶链反应(PCR)技术并用其可检测到fg水平后,从基因测得了HBV DNA与HBV血清学标志物的相互关系.本文对本地区1368例(名)各类患者及正常人血清HBV DNA、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb进行了检测,现将其结果报道如下. 材料与方法 1 HBVDNAPCR检测采用美国MJ公司生产的PTC-100型DNA扩增仪,PCR引物由上海复生生物工程研究所提供,严格按说明书操作.     

特纳综合征患者Y染色体序列的检测

目的观察特纳综合征患者Y染色体序列出现的频率。方法研究本院23位有特纳综合征且知情同意的患者,其中,细胞遗传学是通过培养外周血淋巴细胞进行染色体核型分析,每个病人分析100个核型。基因组DNA是通过提取外周血淋巴细胞DNA,通过聚合酶链式反应扩增基因序列DYZ1、DYZ3、ZFY和SRY。结果细胞遗传学分析显示其中9位病人(39.2%)是45,X的核型,14位病人(60.8%)是嵌合的核型。8.7%(2/23)的病人被发现有Y染色体序列。这个比率与之前报道的近似。在细胞遗传学分析中并没有发现有Y染色体片段,但是通过淋巴细胞DNA分析却发现有Y染色体特异性序列。结论PCR技术显示2位特纳综合征病人(8.7%)有Y染色体序列,而其细胞遗传学分析均存在标记染色体。     

生物医学检测的PCR技术及其应用

聚合酶链反应或多聚酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)检测技术,又称体外基因扩增技术,最早由美国Cetus公司的Kary Mullis及其同事于1985年发现并研究成功.它是通过聚合酶促寡核苷酸引物的延长,反复循环,使目的DNA成指数扩增,是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法,也是体外酶促合成特异DNA片段的新方法.经过PCR过程,可在数小时内使几个拷贝的DNA序列扩增107-109倍.它已广泛应用于基因分离、基因克隆、核酸序列分析和测序,应用于研究基因表达和调控、基因多态性分析以及探讨基因与疾病等生物医学体外检测的各个领域.