ATG5敲低后抑制人肺癌细胞H1299自噬并增强南蛇藤素诱导的细胞凋亡

目的构建自噬相关基因5(autophagy-related gene 5,ATG5)低表达肺癌细胞株,观察肺癌细胞自噬活性,检测南蛇藤素对肺癌细胞凋亡的影响。方法用ATG5 shRNA技术构建ATG5敲低的人肺癌H1299细胞株作为ATG5敲低组,未敲低ATG5的H1299细胞作为对照组;荧光定量PCR和Western blot检测肺癌细胞中ATG5的表达和自噬标志物微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3)及死骨片蛋白1的(sequestosome 1,P62)表达,并转染红色荧光标记的LC3质粒观察LC3斑点聚集情况;经南蛇藤素刺激后,以流式细胞术检测细胞凋亡,最后使用Western blot检测cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax等蛋白的表达。结果慢病毒感染组ATG5较对照组mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05);ATG5敲低后LC3-Ⅱ水平下降,P62水平上升,并且转染后RFP-LC3斑点聚集减少(P0.05)。相比对照组,南蛇藤素明显促进ATG5敲低细胞凋亡(P0.01);ATG5敲低组中促凋亡分子Bax、cleaved caspase-3表达比对照组明显增加(P0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少(P0.05)。结论 ATG5敲低抑制肺癌细胞自噬后,南蛇藤素能够明显增强人肺癌细胞的凋亡,提示抑制肺癌细胞自噬可能为针对性处理肺癌细胞耐药提供新的思路。     

自噬在熊果酸抑制人肺癌PC9细胞增殖中的作用

目的:研究自噬在熊果酸(UA)抑制人肺癌PC9细胞增殖中的作用及机制。方法:应用MTT法和台盼蓝拒染法检测UA对PC9细胞增殖的影响。吖啶橙染色法在荧光显微镜下观察UA对PC9细胞自噬的影响。Western blot检测自噬相关蛋白LC3及ATG5的表达情况。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)观察UA对PC9细胞增殖的抑制作用。结果:UA可以显著抑制PC9细胞的活力(P0.05或P0.01),随着给药剂量和时间的增加,UA对PC9细胞的生长抑制率显著上升。UA诱导PC9细胞自噬体表达增加,并诱导自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和ATG5表达的增加(P0.01)。自噬抑制剂3-MA提高了UA对PC9细胞的抑制作用(P0.01)。结论:UA抑制PC9细胞的增殖,并诱导细胞发生自噬。UA诱导PC9细胞自噬的机制有可能依赖ATG5细胞自噬途径。自噬抑制剂3-MA能够增强UA对PC9细胞的增殖抑制作用,有望为肺癌的临床治疗提供新的联合治疗方案。     

千金藤素通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬

目的:研究千金藤素(cepharanthine)对人卵巢癌SKOV3细胞自噬的诱导作用,并探讨其可能的作用机制。方法:体外培养SKOV3细胞,CCK-8法检测cepharanthine(0、2、4、8、16和32μmol/L)对SKOV3细胞活力的影响;吖啶橙染色观察细胞酸性自噬泡;Western blot法检测cepharanthine作用后自噬相关蛋白LC3及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达的变化。结果:Cepharanthine抑制卵巢癌SKOV3细胞活力,呈一定的剂量依赖关系(P0.05)。Cepharanthine能显著增加SKOV3细胞内酸性自噬泡数量。Western blot结果表明在8和16μmol/L的cepharanthine作用下,卵巢癌SKOV3细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P0.01)。信号通路蛋白研究表明,cepharanthine显著降低p-AKT和p-mTOR的蛋白水平(P0.01),AKT和mTOR总蛋白水平均无明显变化。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可增强cepharanthine对SKOV3细胞活力的抑制作用(P0.01)。结论:Cepharanthine可诱导人卵巢癌SKOV3细胞自噬,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。     

小檗碱对人骨髓增生异常综合征细胞MUTZ-1自噬活性的影响及机制

为探讨小檗碱(Berberine, Ber)对人骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)细胞MUTZ-1自噬活性的影响及机制,以MTT法检测Ber对MUTZ-1细胞的增殖抑制率、半数抑制浓度(half inhibitory concentration, IC_(50)),并绘制增殖抑制率曲线;免疫荧光法测定细胞中LAMP1表达;Western blotting测定LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p-mTOR、Beclin-1、p-Akt、p-ERK、ATG3、ATG4、ATG5、ATG7蛋白表达。结果显示,Ber作用后MUTZ-1细胞增殖抑制水平随时间而增强,Ber对MUTZ-1细胞24、48 h的IC_(50)分别为265.1μmol/L和143.2μmol/L;LAMP1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值随时间而增加;Beclin-1、ATG3、ATG5表达水平增加,p-mTOR、p-Akt表达水平降低,p-ERK、ATG4、ATG7表达水平无明显变化。由此说明Ber可抑制MUTZ-1细胞增殖并诱导其自噬,自噬的诱导与Beclin-1、ATG3、ATG5表达上调和mTOR活性受抑制有关。     

阿糖胞苷对姜黄素诱导的人急性髓系白血病细胞自噬的影响

目的:观察化疗药物阿糖胞苷作用下姜黄素是否诱导人急性髓系白血病KG1a细胞产生自噬及可能的机制。方法:体外培养KG1a细胞,透射电镜观察不用药物处理后细胞超微结构的变化;用吖啶橙染色检测细胞内酸性自噬泡的变化;MTT法检测细胞活力变化;流式细胞术检测细胞周期的变化;RT-qPCR和Western blot检测自噬相关因子beclin-1和LC3 mRNA及蛋白的表达。结果:姜黄素对KG1a细胞的活力有明显抑制作用(P0.05),且呈剂量依赖关系,姜黄素联合阿糖胞苷组细胞活力抑制率明显高于单药组,且两组均高于对照组(P0.01)。电镜结果显示姜黄素能诱导细胞自噬小体的产生,阿糖胞苷能使姜黄素诱导的自噬小体增加。吖啶橙染色发现联合用药组能提高姜黄素诱导的细胞自噬,细胞内酸性自噬泡及含有自噬泡的细胞数均增加。细胞周期结果显示细胞主要被阻滞在G_0/G_1期。RT-qPCR结果显示联合用药组beclin-1和LC3的mRNA表达水平均比单药组及对照组明显升高(P0.01);Western blot结果显示联合用药组比单药组beclin-1的蛋白表达明显上调(P0.05),LC3-II/LC3-I的比值升高。结论:姜黄素能抑制KG1a细胞活力并诱导细胞发生自噬,阿糖胞苷能促进姜黄素诱导的细胞自噬,作用优于姜黄素单用组,可能与两药联合上调beclin-1和LC3-Ⅱ的表达有关。     

和厚朴酚通过mTOR信号通路诱导肺癌A549细胞自噬

目的:探讨和厚朴酚(honokiol)对人肺腺癌A549细胞自噬的诱导作用及可能的作用机制。方法:体外培养A549细胞,加入不同浓度(0、10、20、40、60和80μmol/L)的honokiol处理48 h,MTT法检测honokiol对细胞活力的影响;吖啶橙染色观察细胞酸性自噬泡情况;Western blot法检测honokiol及联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用后对自噬相关蛋白LC3及相关的信号通路mTOR蛋白表达的变化。结果:Honokiol剂量依赖地抑制肺癌A549细胞的活力(P0.05)。Honokiol处理肺癌A549细胞能显著增加细胞内发出亮红色荧光的酸性自噬泡的比例。在40μmol/L的honokiol作用下肺癌A549细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P0.01),3-MA作用则显著降低。Honokiol可显著降低p-mTOR蛋白表达水平(P0.01),而联合3-MA作用后则使p-mTOR蛋白水平显著升高(P0.01),mTOR总蛋白表达水平均无显著变化。结论:Honokiol可诱导肺癌A549细胞自噬,其机制可能与抑制mTOR信号通路相关。     

敲低Wnt7a抑制卡介苗诱导的小鼠肺泡上皮细胞自噬

目的 探究无翅基因7a(Wnt7a)对牛结核分枝杆菌卡介苗(BCG)感染的肺泡上皮细胞自噬水平的调控作用。方法使用干扰Wnt7a慢病毒及BCG单独作用或共处理TC-1小鼠肺泡上皮细胞，设置小干涉RNA对照(si-NC)组、 si-NC联合BCG组、 Wnt7a小干涉RNA(si-Wnt7a)组和si-Wnt7a联合BCG组。Western blot法检测Wnt7a、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 P62及自噬相关基因5(ATG5)蛋白表达水平，利用免疫荧光细胞化学染色检测LC3的分布以确定细胞自噬情况。结果 与si-NC组相比，BCG感染的TC-1细胞Wnt7a、 LC3和ATG5蛋白表达均升高、 LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著增加；与BCG组感染的TC-1细胞相比，si-Wnt7a联合BCG组Wnt7a、 LC3、 P62及ATG5蛋白表达均显著降低，LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著降低。结论 敲低Wnt7a抑制BCG诱导的肺泡上皮细胞自噬。     

人乳头瘤病毒16 E5(HPV16 E5)蛋白抑制角质形成细胞生长因子诱导的细胞自噬

目的研究人乳头瘤病毒16 E5(HPV16 E5)蛋白对角质形成细胞生长因子(KGF)诱导的细胞自噬的影响。方法构建HPV16 E5蛋白真核表达载体p CI-neo-E5,采用LipofectamineTM2000转染至Ha Ca T人角质形成细胞,实时定量PCR检测HPV16 E5 mRNA转录水平。转染p CI-neo-E5并以KGF刺激Ha Ca T细胞后,实时定量PCR检测自噬相关蛋白beclin 1、自噬相关基因5(ATG5)、ATG7及LC3B mRNA的水平,Western blot法检测LC3BⅡ蛋白的表达量,免疫荧光技术检测LC3B的分布。结果成功构建HPV16 E5真核表达载体p CI-neo-E5并可有效表达。角质形成细胞转染p CI-neo-E5,自噬相关蛋白mRNA的水平显著降低,抑制KGF诱导的LC3BⅡ表达水平升高和LC3B的聚集。结论 HPV16 E5蛋白通过下调自噬相关蛋白的表达,抑制KGF诱导的细胞自噬。     

阿霉素诱导下多发性骨髓瘤细胞中自噬和氧化应激的相互作用

 目的: 探讨阿霉素(doxorubicin,DOX)诱导对多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226细胞内自噬和活性氧簇(reactive oxidative species,ROS)生成的影响及其相互作用关系。方法: 不同浓度阿霉素诱导RPMI-8226细胞24 h,采用Western blot技术检测细胞内beclin 1、LC3等自噬相关蛋白的表达水平。采用DCFH-DA荧光染色法检测RPMI-8226细胞内ROS的水平,荧光显微镜采集图像。采用氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)及tempol处理RPMI-8226细胞后,通过Western blot技术检测阿霉素诱导下细胞内beclin 1、LC3等蛋白的表达水平。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理PRMI-8226细胞后,检测阿霉素诱导下细胞内ROS和凋亡的表达水平。结果: RPMI-8226细胞内beclin 1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平呈阿霉素剂量依赖性增加,当阿霉素诱导浓度达2 mg/L时,与对照组比较显著增加(P<0.05)。采用2 mg/L阿霉素处理RPMI-8226细胞,通过荧光显微镜观察,ROS水平较对照组明显增加。氧自由基清除剂NAC和tempol处理RPMI-8226细胞后,beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平较阿霉素处理组下降。采用自噬抑制剂3-MA处理细胞后,RPMI-8226细胞内ROS和凋亡的水平较阿霉素处理组及对照组增加。结论: 阿霉素能增加RPMI-8226细胞内自噬和ROS的生成,抑制自噬能增加阿霉素诱导下ROS和凋亡的水平,抑制ROS后能减少阿霉素诱导下多发性骨髓瘤细胞中的自噬。     

烟曲霉感染时NADPH氧化酶通过诱导活性氧活化巨噬细胞自噬

目的研究NADPH氧化酶(NOX)参与烟曲霉孢子诱导巨噬细胞自噬及其作用机制。方法取对数生长期的RAW264.7细胞,随机分为3组:以烟曲霉孢子刺激的处理组、烟曲霉孢子联合NOX抑制剂氯化二亚苯基碘鎓(DPI)的处理组和无处理的空白组。细胞作用2 h后荧光显微镜观察细胞内二氯荧光黄亮度以检测活性氧(ROS)水平,免疫印迹法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达量,免疫荧光技术观察LC3的表达与定位。结果烟曲霉孢子刺激后RAW264.7细胞的ROS与LC3BⅡ表达水平显著升高,同时LC3呈斑点状聚集并与烟曲霉孢子共定位;以DPI抑制后ROS与LC3 BⅡ表达量与空白组相比无明显变化,并且LC3在细胞内弥散分布。结论烟曲霉感染时NOX通过产生ROS活化巨噬细胞自噬。     

Cx43沉默对机械应力作用下调控的软骨细胞自噬介导软骨基质合成的影响

目的:探究机械应力作用下通过沉默缝隙连接蛋白43(Cx43)调控软骨细胞自噬对软骨细胞的基质代谢的影响。方法:对小鼠成软骨细胞系ATDC5加载机械应力,采用q PCR和Western blot法检测ATDC5细胞中Cx43的mRNA和蛋白表达。将细胞分为空白对照组、机械应力组、Cx43 siRNA转染组、scramble siRNA转染组、机械应力+scramble siRNA转染组、机械应力+Cx43 siRNA转染组和机械应力+Cx43 siRNA转染+3-MA组,CCK-8法检测细胞活力,q PCR检测软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达,1,9-二甲基亚甲蓝(DMMB)染色法检测细胞糖胺多糖(GAG)含量,Western blot法检测自噬相关蛋白beclin 1和LC3的表达。结果:机械应力刺激下,ATDC5细胞Cx43表达上调,细胞活性显著降低,II型胶原mRNA表达降低,GAG含量减少,beclin 1和LC3-II/LC3-I蛋白表达降低(P 0. 05)。转染Cx43 siRNA可下调Cx43的mRNA和蛋白的表达。机械应力作用下,Cx43沉默显著增强软骨细胞活力,提高II型胶原的mRNA表达和GAG含量,上调beclin 1和LC3-II/LC3-I的蛋白表达(P 0. 05)。此外,自噬抑制剂3-MA处理后,Cx43沉默对机械应力下软骨细胞的保护作用受到抑制。结论:Cx43沉默通过促进机械应力作用下小鼠软骨细胞自噬,从而促进软骨细胞的合成代谢,减轻软骨细胞在机械应力下的损伤。     

血管紧张素Ⅱ升高血管内皮细胞中ROS水平并激活自噬通路

目的: 研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管内皮细胞自噬的影响及其可能机制。方法: 以EA.hy926血管内皮细胞为研究对象,荧光酶标仪检测AngⅡ(10^-7mol/L)、AngⅡ联合N-乙酰半胱氨酸(NAC,50 μmol/L)作用24 h后细胞中活性氧簇(ROS)水平;用不同浓度(10^-8、10^-7、10^-6mol/L)AngⅡ作用24 h或10^-7mol/L AngⅡ作用不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h)后,通过Western blotting分析微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白变化、吖啶橙染色结合荧光显微镜观察自噬体形成情况来判断细胞中自噬发生情况;AngⅡ(10^-7mol/L)联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,2 mmol/L)或NAC(50 μmol/L)处理24 h后用同样方法检测细胞中自噬的发生情况。结果: 细胞经AngⅡ刺激后细胞内ROS的水平显著升高(P<0.05),LC3-Ⅱ蛋白表达明显增强(P<0.05),自噬体形成明显增加;3-MA或NAC可显著抑制内皮细胞中AngⅡ诱导的LC3-Ⅱ蛋白表达(P<0.05)与自噬体形成。结论: AngⅡ可以通过升高血管内皮细胞内ROS的水平从而诱导自噬的发生。     

白蛋白微泡促进报告基因在细胞表达的实验研究

目的: 探讨白蛋白微泡作为非病毒载体在基因传输中的作用。方法:6孔板培养脐静脉内皮细胞(EC)和血管平滑肌细胞(VSMC),每孔加pcDNA3.1/His/LacZ质粒20 μg,加不同浓度微泡或不加微泡,超声条件为连续波,频率2MHz,机械指数1.8,照射时间1 min,48 h后计算蓝染细胞百分率和β-半乳糖苷酶活性。另以不同浓度微泡及超声照射时间处理细胞,测定细胞增殖情况。结果:与单纯超声质粒组相比,含微泡组蓝染细胞率增加约10-15倍(其中内皮细胞组11.6倍,平滑肌细胞组15.2倍),报告基因表达定量增加近8倍。微泡浓度为10％时细胞转染效率最高。超声照射对细胞增殖无影响,微泡浓度为50％时有明显的细胞毒作用。结论:白蛋白微泡在超声作用下能明显增加基因的传输效率,有可能成为一种安全有效的基因治疗的载体。     

Carbon monoxide activates autophagy via mitochondrial reactive oxygen species formation

Autophagy, an autodigestive process that degrades cellular organelles and protein, plays an important role in maintaining cellular homeostasis during environmental stress. Carbon monoxide (CO), a toxic gas and candidate therapeutic molecule, confers cytoprotection in animal models of acute lung injury. The mechanisms underlying CO-dependent lung cell protection and the role of autophagy in this process remain unclear. Here, we demonstrate that CO exposure time-dependently increased the expression and activation of the autophagic protein, microtubule-associated protein-1 light chain-3B (LC3B) in mouse lung, and in cultured human alveolar (A549) or human bronchial epithelial cells. Furthermore, CO increased autophagosome formation in epithelial cells by electron microscopy and green fluorescent protein (GFP)-LC3 puncta assays. Recent studies indicate that reactive oxygen species (ROS) play an important role in the activation of autophagy. CO up-regulated mitochondria-dependent generation of ROS in epithelial cells, as assayed by MitoSOX fluorescence. Furthermore, CO-dependent induction of LC3B expression was inhibited by N-acetyl-L-cysteine and the mitochondria-targeting antioxidant, Mito-TEMPO. These data suggest that CO promotes the autophagic process through mitochondrial ROS generation. We investigated the relationships between autophagic proteins and CO-dependent cytoprotection using a model of hyperoxic stress. CO protected against hyperoxia-induced cell death, and inhibited hyperoxia-associated ROS production. The ability of CO to protect against hyperoxia-induced cell death and caspase-3 activation was compromised in epithelial cells infected with LC3B-small interfering (si)RNA, indicating a role for autophagic proteins. These studies uncover a new mechanism for the protective action of CO, in support of potential therapeutic application of this gas.     

丹酚酸B 通过mTOR / Ulk1 信号通路诱导胶质瘤细胞C6 自噬性死亡

目的:探究丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)对胶质瘤细胞自噬的作用机制。方法:不同浓度的Sal B 处理细胞,CCK8 检测细胞活性,流式检测细胞凋亡情况,Western blot 检测增殖、凋亡及自噬标记蛋白表达,免疫荧光检测LC3 含量。结果:Sal B 浓度达到100 μmol/ L 时能明显抑制细胞活性,因此,选择10、20、50 μmol/ L 三个剂量进行后续试验;Sal B 能显著促进C6 细胞凋亡和凋亡标记蛋白caspase-3、Bax 的表达,降低Bcl-2 及增殖标记蛋白Ki67 的表达水平,并具有量效关系;同时,Sal B 能显著促进自噬标记蛋白(Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1)的表达,升高LC3Ⅱ/ Ⅰ的比值,促进LC3 荧光斑点的形成并降低p62 的表达水平;此外,Sal B 可明显抑制mTOR/ Ulk1 通路蛋白mTOR 的表达,促进Ulk1 的表达。结论:Sal B 可通过mTOR/ Ulk1 信号通路诱导胶质瘤细胞自噬性死亡。     

谷氨酸诱导大鼠胃Cajal间质细胞自噬模型的建立

目的:通过谷氨酸诱导离体大鼠胃Cajal间质细胞(ICCs)建立细胞自噬模型。方法:使用高、中和低浓度(分别为10 mmol/L、5 mmol/L和2.5 mmol/L)的谷氨酸作用于原代培养的ICCs不同时间(3h、6h和24h),然后通过CCK-8法检测不同浓度谷氨酸对ICCs活力的影响;Western blot检测不同浓度谷氨酸在不同作用时点对ICCs自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达水平的影响;透射电镜观察谷氨酸干预后细胞内自噬体和超微结构的变化;免疫荧光检测谷氨酸诱导后自噬蛋白LC3的荧光表达。结果:与空白对照组相比,谷氨酸显著降低了大鼠胃ICCs活力(P0.01)。中、高浓度谷氨酸作用不同时间均可显著提高自噬蛋白LC3-II/LC3-I的比值(P0.01),其中以中浓度谷氨酸作用3 h的LC3-II/LC3-I比值最高(P0.01)。透射电镜检测中浓度谷氨酸干预3 h发现,细胞内自噬体数量明显增加,线粒体和内质网数量及结构遭到破坏。免疫荧光结果提示,与空白对照组比较,谷氨酸中浓度组平均每个细胞内自噬蛋白LC3荧光表达显著增强(P0.01)。结论:应用谷氨酸可成功诱导大鼠胃ICCs自噬,谷氨酸的最佳诱导条件为5 mmol/L作用3h。     

胞外高浓度ATP诱导SH-SY5Y细胞的自噬和凋亡

 目的：观察胞外高浓度ATP损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,探讨损伤中自噬和凋亡发生的规律和特点。方法：培养的SH-SY5Y细胞按照加入ATP的浓度和作用时间进行分组。CCK-8法检测细胞生存率,单丹磺酰戊二胺染色检测自噬空泡的变化,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率变化,蛋白质印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ）的表达。结果：（1）与对照组相比,不同浓度（3、6、9、12、15 mmol/L）的ATP作用3 h均使SH-SY5Y细胞存活率明显降低,且呈剂量依赖性;不同作用时间（1、2、3、6 h）ATP（6 mmol/L）也可使SH-SY5Y细胞存活率明显降低,3 h达高峰,呈时间依赖性。（2）ATP作用1 h时SH-SY5Y细胞自噬空泡显著增多（P<005）,随时间延长,6 h时降到对照水平;ATP作用1 h时,LC3-Ⅱ表达显著增强（P<005）,形成高峰,与自噬空泡增多的时点重合,2 h、3 h时LC3-Ⅱ表达水平逐渐减弱,6 h时降到对照水平。（3）与对照组相比,ATP作用3 h后细胞凋亡率达高峰（P<005）,6 h时仍然保持在3 h的水平;cleaved caspase-3表达量同步增强（P<005）,6 h时达高峰。结论：胞外高浓度ATP能够诱导SH-SY5Y细胞自噬和凋亡;自噬增强在前,凋亡高潮在后;随着ATP作用时间的延长,凋亡占主导地位。     

CircCBFB is a mediator of hepatocellular carcinoma cell autophagy and proliferation through miR-424-5p/ATG14 axis

This study aims to investigate the role of circCBFB in hepatocellular carcinoma (HCC) cell proliferation and autophagy. qRT-PCR and Western blotting analyses quantified the expression levels of circCBFB, miR-424-5p, and ATG14 in HCC tissues and/or HCC cell lines. After transfection with pcDNA3.1-CircCBFB, sh-CircCBFB, miR-424-5p mimic, miR-424-5p inhibitor, pcDNA3.1-ATG14, sh-ATG14, sh-CircCBFB?+?miR-424-5p inhibitor, pcDNA3.1-CircCBFB?+?miR-424-5p mimic, sh-CircCBFB?+?pcDNA3.1-ATG14, or pcDNA3.1-CircCBFB?+?sh-ATG14, the proliferation, cell cycle, and apoptosis of Huh-7 and HCCLM3 cells were detected, respectively, through MTT assay and flow cytometry. Western blotting measured the expression levels of ATG14 and autophagy-related proteins (LC3-ΙΙ/LC3-Ι, Beclin1, and p62). The interactions among circCBFB, miR-424-5p, and ATG14 were identified through RNA fluorescence in situ hybridization and RNA immunoprecipitation. In HCC tissues, circCBFB and ATG14 were highly expressed, and miR-424-5p expression was downregulated. Transfection of pcDNA3.1-CircCBFB, miR-424-5p inhibitor, or pcDNA3.1-ATG14 into HCC cells facilitated HCC cell proliferation and autophagy, while suppressing cell apoptosis, evidenced by elevated cell viability, increased protein levels of autophagosome markers (LC3-ΙΙ/LC3-Ι and Beclin1), repressed apoptosis rate, and suppressed protein level of autophagy receptor p62. miR-424-5p was a target gene of circCBFB, and miR-424-5p negatively mediated ATG14. CircCBFB inhibits miR-424-5p and upregulates ATG14, thus promoting HCC cell proliferation and autophagy.