血管紧张素Ⅱ1型受体在脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞促炎性细胞因子产生中的作用

目的 探讨血管紧张素Ⅱ1型受体在脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞促炎性细胞因子产生中的作用和机制.方法 按照随机数字表法将小鼠单核巨噬细胞株（RAW264.7）细胞分为空白对照组、ZD7155组、LPS组和LPS ＋ZD7155组.酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的含量,逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测RAW264.7细胞内TNF-α和IL-1β mRNA表达,凝胶电泳迁移检测法（EMSA）检测RAW264.7细胞内核因子-κB（NF-κB）和活化蛋白-1（AP-1）活性的变化.结果 和空白对照组相比,ZD7155组培养上清液中的TNF-α和IL-1β含量差异没有统计学意义（P＞0.05）,但是LPS组细胞培养上清液中的TNF-α和IL-1β含量均显著高于空白对照组（均P〈0.01）和ZD7155组（均P〈0.05）.LPS组细胞内的TNF-α和IL-1β mRNA表达是空白对照组的2.19倍（P〈0.01）和1.77倍（P〈0.01）,细胞内NF-κB和AP-1活性是空白对照组的1.43倍（P〈0.01）和1.90倍（P〈0.01）.而LPS＋ZD7155组上清液中的TNF-α和IL-1β含量较LPS组下降（均P〈0.05）,细胞内TNF-α和IL-1β mRNA表达较LPS组下降了34.7%（P〈0.01）和49.72%（P〈0.01）,同时细胞内NF-κB活性和AP-1活性较LPS组下降了46.15%（P〈0.05）和48.42%（P〈0.05）.结论 血管紧张素Ⅱ1型受体通过活化转录因子NF-κB和AP-1,参与了LPS诱导巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的产生和释放.     

Aβ1-42通过TLR4影响小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子IL-1β和IL-6释放

目的探讨Aβ1-42对小鼠巨噬细胞RAW264.7向炎症性细胞转变的影响及机制。方法 RAW264.7细胞分别经过LPS与Aβ1-42刺激,RT-PCR和Western blot检测GM-CSF受体CSF2RA和CSF2RB的表达水平,ELISA检测在Aβ1-42刺激下的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平;采用TLR4抑制剂分别干预LPS和Aβ1-42处理后的RAW264.7,检测CSF2RA与CSF2RB受体的表达变化,炎症因子IL-1β、IL-6的释放。结果 RAW264.7细胞表面GM-CSF受体CSF2RB在LPS与Aβ1-42处理后表达水平均比对照组升高(P0.05),而CSF2RA表达没有显著性改变;炎症因子IL-6与IL-1β在Aβ1-42刺激后分泌增加,同时TLR4抑制剂抑制LPS和Aβ1-42对细胞的刺激。结论 Aβ1-42通过TLR4促进小鼠RAW264.7细胞炎症因子IL-6、IL-1β的分泌。     

GW4064 对LPS 诱导的RAW264.7 细胞中炎症反应的影响

目的:研究FXR激动剂GW4064对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子TNF-α、MCP-1和NO的分泌及IL-1β、TNF-α的表达,以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法:通过流式高通量多因子检测技术和Griess法检测炎症因子TNF-α、MCP-1和NO分泌的影响;采用qPCR技术检测炎症因子IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA的表达;Western blot检测iNOS及NF-κB蛋白的表达的水平。结果:GW4064能抑制LPS诱导的细胞促炎因子IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA的表达(P0.05),同时能不同程度的抑制细胞上清中TNF-α,MCP-1中的分泌量(P0.05);并且呈剂量依赖性的抑制NO的释放(P0.05);除此之外,GW4064(10、20μmol/L)可显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS蛋白的产生(P0.01),经过GW4064处理后,LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NF-κB的活性也显著下调(P0.01)。结论:FXR激动剂GW4064在巨噬细胞中具有一定的抗炎作用,抑制iNOS的表达及下调NF-κB的活性是其发挥抗炎作用的机制之一。     

TREM-1促进巨噬细胞的迁移并参与脂多糖诱导的小鼠心肌功能障碍

目的探讨髓系细胞触发受体-l(triggering receptor expressed oil myeloid cells-1,TREM-1)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠心肌功能障碍的作用以及对巨噬细胞RAW264.7迁移的影响。方法将健康C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组、LPS组、LPS+LP17组、LPS+TAK-242组并进行相应处理,6 h后超声心电图检测小鼠心功能指标,12 h取心肌组织HE染色观察病理改变,免疫组化染色观察巨噬细胞表面分子F4/80阳性表达,ELISA检测血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及IFN-γ的表达情况,实时荧光定量PCR检测TREM-1、BNP以及炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的mRNA水平;培养巨噬细胞RAW264.7,将细胞随机分为正常组、LPS组、LP17+LPS组、TAK-242+LPS组并进行对应处理,实时荧光定量PCR检测TREM-1与TLR4的mRNA水平,ELISA检测细胞培养液中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及IFN-γ的表达情况,Transwell小室观测RAW264.7细胞迁移情况,蛋白免疫印迹检测RAW264.7中TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白水平。结果与对照组相比,超声心电图检测结果显示LPS组小鼠的EF与FS下降,LVD增大,IVS减小,LVPW变薄,变化均显著(P0.05),实时荧光定量PCR结果显示TREM-1 mRNA与BNP mRNA表达水平上升(P0.05),免疫组化染色法显示F4/80有大量阳性表达(P0.01),ELISA检测显示炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的含量增加(P0.05),实时荧光定量PCR检测也表明这些炎性因子mRNA水平升高(P0.05);与LPS组小鼠相比,注射TREM-1抑制剂LP17使EF、FS上升,有效抑制了LVD增大、IVS减小以及LVPW变薄的现象(P0.05),TREM-1 mRNA与BNP mRNA表达水平均降低(P0.05),心肌损伤减轻,F4/80阳性表达减少(P0.01),炎症因子水平也明显下降(P0.05),与注射TLR4抑制剂TAK-242的效果一致。与对照组相比,LPS诱导RAW264.7细胞后,细胞中TREM-1 mRNA与TLR4 mRNA水平升高(P0.05),炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的含量增加(P0.05),细胞大量迁移(P0.01),细胞中TLR4、MyD88、NF-κBp65、p-IκBα蛋白水平升高(P0.05);与LPS组相比,TREM-1抑制剂LP17预处理后再给予LPS诱导,细胞中TREM-1 mRNA与TLR4 mRNA水平降低(P0.05),炎症因子的含量下降(P0.05),RAW264.7细胞迁移被抑制(P0.01),TLR4、MyD88、NF-κBp65、p-IκBα蛋白水平也明显降低(P0.05)。结论给小鼠注射TREM-1抑制剂可有效减轻LPS诱导的心肌功能障碍,抑制RAW264.7细胞TREM-1表达可抑制细胞的迁移,TLR4/NF-κB途径可能参与了这一过程。     

青蒿琥酯通过抑制ERK1/2蛋白活化负性调控HSC-T6细胞cyclin D1的表达和AP-1活性

目的: 通过观察青蒿琥酯(artesunate,Art)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的影响,探讨Art抗肝纤维化的分子机制。方法: 用血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB)诱导HSC-T6细胞的增殖。实验分为对照组、PDGF-BB组、PDGF-BB+Art组(Art终浓度6.25 mg/L、25 mg/L、50 mg/L)和PDGF-BB+ERK抑制剂PD98059组。ELISA法测定细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量,RT-PCR检测各组ERK1/2和cyclin D1 mRNA水平变化,Western blotting法检测各组p-ERK1/2和cyclin D1蛋白表达水平,凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测AP-1的活性。结果: (1)PDGF-BB 可明显促进HSC-T6细胞的增殖,PDGF-BB+Art各剂量组和PDGF-BB+PD98059均可抑制HSC-T6细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量(P<0.05,P<0.01)。(2)PDGF-BB+Art组(50 mg/L)ERK1/2 mRNA的表达低于PDGF-BB组(P<0.05),其中PDGF-BB+PD98059组ERK1/2 mRNA的表达最低(P<0.01);PDGF-BB+Art组(25 mg/L、50 mg/L)和PDGF-BB+PD98059组cyclin D1 mRNA的表达明显低于PDGF-BB组(P<0.05,P<0.01)。(3)p-ERK1/2、cyclin D1蛋白表达水平在PDGF-BB组最高,而PDGF-BB+Art各剂量组和PDGF-BB+PD98059组降低(P<0.05,P<0.01)。(4)Art可使AP-1与DNA结合活性下降。结论: Art可抑制HSC-T6细胞增殖,其机制可能与其抑制ERK1/2蛋白活化从而降低AP-1的活性和下调cyclin D1的表达有关。     

三百棒通过调控TLR4/NF-κB信号通路对脂多糖诱导的RAW264.7细胞极化的影响

目的：探讨三百棒醇提物(TAAE)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7极化趋向以及其对炎症反应的影响。方法：用LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型。CCK-8法检测细胞活力;ELISA检测细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10)的水平;Griess法检测细胞培养上清液中一氧化氮(NO)的分泌情况;荧光染色双标法观察巨噬细胞的极化状态;免疫荧光染色检测NF-κB定位及表达;Transwell检测TAAE对RAW264.7细胞迁移和趋化性的影响;RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB和TLR4的mRNA水平;Western blot检测iNOS、COX-2、TLR4、NF-κB、p-NF-κB、IκBα和p-IκBα蛋白水平。使用TLR4通路抑制剂TAK-242进一步验证TAAE对TLR4/NF-κB信号通路的影响。结果：与模型组相比较,TAAE降低LPS诱导的炎症模型RAW264.7细胞中M1型促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)及NO水平,促使M2型抑炎因子(IL-10和Arg-1)分泌...     

Rac1对巨噬细胞RAW264.7细胞生物学作用的影响

目的分析巨噬细胞RAW264.7的Rac1表达水平,通过构建Rac1载体和特异性siRNA探讨其对RAW264.7细胞生物学活性的影响。方法经反转录法克隆Rac1的cDNA并构建Rac1基因表达载体,Western blot技术检测Rac1的蛋白表达水平,定量荧光PCR(qRT-PCR)测定Rac1 mRNA,流式细胞术分析细胞表面膜分子表达的改变,Transwell法观察细胞的迁移能力,ELISA法检测细胞培养上清中相关细胞因子的表达。结果经测序等手段鉴定表明,Rac1载体构建成功,且将Rac1载体转入RAW264.7细胞可见其mRNA和蛋白表达均明显上调、细胞迁移能力增强,但对RAW264.7细胞膜表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达没有明显影响。然而,Rac1抑制剂及其特异性siRNA却可上调上述3种膜分子的表达。此外,Rac1转染的RAW264.7细胞分泌的IL-1β水平显著低于siRNA处理组及Rac1抑制剂组,而IL-6、IL-33、TNF-α的表达各组之间没有显著差异。结论 Rac1的表达有助于RAW264.7细胞的迁移和抑制IL-1β的分泌,而对细胞的抗原提呈作用无显著影响。     

IL-18和TNF-α增加3T3-L1脂肪细胞及RAW264.7巨噬细胞IL-18Rβ的水平

目的探讨白细胞介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)对3T3-L1脂肪细胞、RAW264.7巨噬细胞的白细胞介素18受体β(IL-18Rβ)表达的影响。方法采用反转录PCR和Western blot法检测不同浓度IL-18、TNF-α处理后3T3-L1脂肪细胞、RAW264.7巨噬细胞的IL-18RβmRNA及蛋白的表达。结果 10 ng/m L、100 ng/m L TNF-α显著增加3T3-L1脂肪细胞IL-18Rβ的mRNA及蛋白表达,10 ng/m L、100 ng/m L IL-18显著增加RAW264.7巨噬细胞IL-18Rβ的mRNA及蛋白表达。结论IL-18、TNF-α可能通过促进巨噬细胞、脂肪细胞IL-18R的表达参与糖尿病和肥胖的脂肪组织慢性炎症过程。     

原头蚴体外刺激巨噬细胞高表达PPARα/γ并调节其极化

目的:探讨原头蚴与RAW264.7 共培养后PPARα/γ的表达水平以及对巨噬细胞极化的作用。方法:原头蚴与RAW264.7 共培养12、24、36、48、72 h 取细胞。用Qrt-PCR 的方法检测RAW264.7 细胞PPARα/γ的表达水平,用qRT-PCR 的方法检测巨噬细胞M1 型相关因子TNF-α、MCP-1、IL-1β和M2 型相关因子Arg-1、TGF-α、Fizz-1 的水平,ELISA 的方法检测Arg-1 和MR 的表达量。结果:RAW264.7 细胞PPARα/γ的表达水平和M2 型相关因子Arg-1、TGF 、Fizz-1 和MR 均逐渐升高,72 h 表达最高(P<0.05);巨噬细胞M1 型相关因子TNF 、MCP-1、IL-1茁先升高后降低(P<0.05),Arg-1 和MR 的蛋白水平也逐渐增高。结论:原头蚴与RAW264.7 共培养后PPARα/γ的表达逐渐升高,可能促进巨噬细胞由M1 型向M2 型极化,从而在虫体免疫逃逸中发挥一定作用。     

基于 Caspase-1 细胞焦亡信号通路探讨栀子苷对脂多糖诱导 RAW264.7 细胞炎症的抑制作用

目的：探讨栀子苷对脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7 Caspase-1细胞焦亡经典信号通路的干预作用。方法：LPS诱导RAW264.7细胞构建炎症模型,以地塞米松为阳性对照,20、40、80μmol/L栀子苷干预细胞24 h。乳酸脱氢酶（LDH）细胞释放法检测细胞LDH释放;碘化丙啶（PI）荧光染色观察细胞存活情况;检测细胞上清中炎症因子IL-18、IL-1β、TNF-α和IL-6分泌水平;Western blot检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18和IL-1β表达。结果：与正常对照组相比,模型组RAW264.7细胞中LDH释放量明显升高（P<0.01）,细胞形态学观察到有大量细胞被PI染色,细胞上清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6分泌水平显著升高（P<0.01）;NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18和IL-1β蛋白表达显著升高（P<0.01）。与模型组相比,栀子苷各组和地塞米松组LDH释放减少（P<0.01）,有效抑制PI染色,细胞上清中炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6...     

罗格列酮对RAW 264.7细胞源性泡沫细胞炎症反应及SOCS1和SOCS3表达的影响

 目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）配体罗格列酮是否能够调节泡沫细胞促炎/抗炎反应以及细胞因子信号抑制物1（SOCS1）和细胞因子信号抑制物3（SOCS3）的表达。方法:采用ELISA法测定泡沫细胞培养液中肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-10的水平,并计算TNF-α/IL-10和IL-6/IL-10的比值。采用RT-PCR及Western blotting技术分别观察RAW 264.7细胞源性泡沫细胞SOCS1和SOCS3 mRNA及蛋白的表达。结果:RAW 264.7细胞源性泡沫细胞组细胞培养液中TNF-α、IL-6和IL-10的水平以及TNF-α/IL-10和IL-6/IL-10的比值均明显高于对照组（control）组。而罗格列酮加入泡沫细胞培养液24 h后,TNF-α、IL-6和IL-10的浓度以及TNF-α/IL-10和IL-6/IL-10的比值均明显低于泡沫细胞组。Control组和泡沫细胞组只有少量SOCS1和SOCS3 mRNA及蛋白的表达,罗格列酮作用于泡沫细胞后SOCS1和SOCS3 mRNA及蛋白的表达均明显高于control组和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)组。结论: 罗格列酮上调泡沫细胞SOCS1和SOCS3的表达,抑制泡沫细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-10,调节了泡沫细胞促炎/抗炎反应。     

NOD8对LPS诱导巨噬细胞释放NO、TNF-α和IL-1β的影响

 目的： 探讨NOD8对脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞释放一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）的影响。方法： pEGFP-C2及pEGFP-NOD8重组质粒分别转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,以LPS刺激RAW264.7细胞0、6、12、24 h后,采用Griess reagent法测定观察细胞分泌的NO水平;ELISA法检测IL-1β 和 TNF-α 的含量;荧光法测定活化的caspase-1水平; Western blotting检测NOD8蛋白表达及NF-κB  p65亚基的核转位情况。结果： (1)与转染pEGFP-C2空质粒组比较,转染pEGFP-NOD8质粒组NOD8蛋白表达明显增加。(2) LPS刺激6、12、24 h后,RAW264.7细胞释放NO、IL-1β及TNF-α均明显增加;而在pEGFP-NOD8+LPS组RAW264.7细胞, NO于12、24 h 的释放显著降低,IL-1β于6、12、24 h的释放也明显降低,TNF-α的释放则无明显变化。（3）在LPS刺激6、12、24 h后, RAW264.7细胞caspase-1活化水平均明显升高,胞浆NF-κB p65亚基表达明显减少,表明p65核转位增加;而pEGFP-NOD8+LPS组可显著抑制caspase-1的活化以及NF-κB p65亚基的核转位,差异有统计学意义。结论： NOD8可抑制LPS诱导的巨噬细胞NO与IL-1β释放,其作用机制可能与NOD8抑制caspase-1及NF-κB 的活化有关。     

氧化型低密度脂蛋白对RAW264.7细胞Siglec-1表达及分泌细胞因子的影响

目的 通过氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipopretein,ox-LDL)活化巨噬细胞系对Siglec-1(sialic acid-binding immunoglobuhn-like herin 1,唾液酸黏附素)表达及细胞因子分泌的影响探讨对动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发病的可能作用.方法 制备ox-LDL,并用不同浓度ox-LDL刺激小鼠巨噬细胞株RAW264.7,48 h后收集细胞和上清,分别用流式细胞仪和RT-PCR检测不同浓度ox-LDL刺激后细胞表面Siglec-1蛋白和基因表达水平,并测定培养上清液中巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和IL-8的浓度.结果 与对照组相比,ox-LDL能刺激RAW264.7细胞表面Siglec-1蛋白和mRNA表达升高(P<0.01),培养上清液中MIP-1α、MCP-1和IL-8的表达升高(P<0.01),并呈浓度依赖性.结论 ox-LDL可呈剂量依赖性刺激RAW264.7巨噬细胞诱导Siglec-1表达及分泌炎性细胞因子增加,在动脉粥样硬化的发生发展中可能起一定作用.     

咯利普兰通过NF-κB抑制MRP8/14在RAW264.7细胞中促炎性因子的释放

目的:探讨PDE4抑制剂咯利普兰抑制髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7中促炎性因子释放的刺激作用,并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法:MRP8/14刺激RAW264.7细胞,采用液相芯片技术和实时荧光定量PCR(q PCR)技术分别检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的蛋白和mRNA水平;咯利普兰预处理RAW264.7细胞后,MRP8/14刺激细胞,采用液相芯片技术和q PCR技术分别检测TNF-α和IL-6的蛋白水平和mRNA水平;Western blot法检测NF-κB P65蛋白磷酸化水平;间接免疫荧光法检测RAW264.7细胞内NF-κB P65蛋白核移位情况。结果:液相芯片及q PCR结果显示MRP8/14具有很强的促炎性因子TNF-α和IL-6释放的作用(P0.01),而咯利普兰可以显著减弱MRP8/14促炎性因子释放的作用(P0.05)。此外,MRP8/14能够诱导NF-κB P65蛋白发生磷酸化,胞核中P65蛋白增加;而咯利普兰显著减弱NF-κB P65蛋白磷酸化(P0.05)。结论:咯利普兰可能通过NF-κB途径显著减弱MRP8/14的促炎作用。     

Inhibition of Titanium Particle-Induced Inflammation by the Proteasome Inhibitor Bortezomib in Murine Macrophage-Like RAW 264.7 Cells

Wear particle-induced inflammatory osteolysis is the major cause of aseptic loosening after total joint replacement. The predominant cell type within periprosthetic tissues is macrophages. We investigate the anti-inflammatory effects of the proteasome inhibitor bortezomib (Bzb) on murine macrophage-like RAW 264.7 cells stimulated with titanium (Ti) particles. RAW 264.7 cells were cultured with 1 nM Bzb and 0.1 mg/ml Ti particles for 48 h; cells without Ti and Bzb or without Bzb were used as negative and loading controls. Results showed that the expression of inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6, and IL-10), chemokines [monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), macrophage inflammatory protein-1 alpha (MIP-1α)], and inflammatory enzymes [inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2)] increased in RAW 264.7 cells cultured with Ti. Bzb treatment significantly reduced the expression of TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1, MIP-1α, iNOS, and COX-2 and induced the expression of IL-10 in a time-dependent manner. These results suggest that Bzb inhibits Ti-induced inflammation in macrophages, and provide a promising therapeutic target for treating or preventing aseptic loosening.     

肺炎支原体经ROS激活NLRP3炎性体诱导RAW264.7细胞分泌IL-1β

 目的: 观察肺炎支原体(Mycoplasma pneunoniae,Mp)促进NLRP3炎性体的活化及下游促炎性细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)的表达是否与活性氧簇(ROS)有关。方法: 预先用5 mmol/L ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理RAW264.7细胞30 min,用10 MOI Mp分别感染RAW264.7细胞4、8、16和24 h。流式细胞术检测细胞内ROS水平;real-time PCR法检测细胞NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达;Western blot 法检测NLRP3、ASC和caspase-1 p20的蛋白水平;ELISA法检测细胞上清液IL-1β的分泌水平。结果: 与正常组比较,感染后4、8、16和24 h模型组ROS生成显著增加(P< 0.01);感染后8、16和24 h模型组NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达显著增加 (P<0.01),感染后16和24 h NLRP3、ASC和caspase-1 p20的蛋白水平上调(P<0.01),感染后24 h 细胞上清液IL-1β含量显著增加(P< 0.01);与模型组比较,NAC组在上述相应时点ROS生成降低,NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达下调,蛋白水平下降,细胞上清液IL-1β的含量减少。结论: Mp可能通过刺激RAW264.7细胞生成ROS而激活NLRP3炎性体。     

组蛋白的制备及其对巨噬细胞的影响

 目的： 用不同方法制备组蛋白并观察组蛋白在体外对巨噬细胞活力及细胞因子释放的影响。
方法： 用基因克隆的方法构建组蛋白H3和H4的原核表达质粒,分别表达和纯化带谷胱甘肽S-转移酶（GST）和组氨酸（His）标签的组蛋白（GST-H3、GST-H4、His-H3和His-H4）;用高盐法提取真核细胞（RAW264.7和293F细胞）组蛋白;用上述不同来源组蛋白（7.5~50 mg/L）刺激巨噬细胞4 h,利用MTT和流式细胞术检测巨噬细胞活力;用液相芯片方法检测不同来源组蛋白对巨噬细胞释放在培养上清中的细胞因子白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的浓度。
结果： His-H3/H4和真核细胞来源的组蛋白明显降低细胞活性,诱导RAW264.7细胞发生晚期凋亡和坏死;不同来源组蛋白对RAW264.7细胞释放IL-6和TNF-α均有不同程度的促进作用。
结论： 原核表达His-H3、His-H4及真核细胞提取的组蛋白均可抑制巨噬细胞活力,诱导巨噬细胞发生晚期凋亡和坏死。组蛋白可能通过促进炎症细胞因子的释放参与了炎症反应过程。     

NOX1在TNF-α诱导的肺泡上皮细胞氧化损伤和炎症中的作用研究

目的:探索NADPH氧化酶1(NOX1)在肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症中的作用。方法:以real-time PCR和Western blot法测定TNF-α处理后肺泡上皮细胞中NOX1的m RNA和蛋白表达水平。在肺泡上皮细胞中转染NOX1 si RNA及其阴性对照,以TNF-α诱导以后,用real-time PCR和Western blot测定细胞中NOX1水平。硫代巴比妥酸法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性,ELISA法检测细胞培养液中的白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素1β(IL-1β)含量,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡蛋白cleaved caspase-3的水平。结果:TNF-α诱导处理后A549细胞中NOX1 m RNA和蛋白水平均升高(P 0. 05),NOX1 si RNA转染可以下调细胞中NOX1的m RNA和蛋白表达(P 0. 05),转染si RNA阴性对照对细胞中NOX1的m RNA和蛋白表达没有影响。TNF-α处理后细胞中MDA含量升高,SOD活性降低,细胞分泌的IL-4、IL-6和IL-1β增多,细胞凋亡率和凋亡蛋白cleaved caspase-3水平均升高,与没有经TNF-α处理的细胞比较,差异有统计学意义(P 0. 05)。下调NOX1的细胞经TNF-α诱导后,细胞中MDA含量降低,SOD活性升高,细胞分泌的IL-4、IL-6和IL-1β减少,凋亡率及凋亡蛋白cleaved caspase-3水平降低,与只经过TNF-α诱导处理的细胞比较,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论:TNF-α诱导肺泡上皮细胞表达NOX1。下调NOX1表达可减少细胞氧化损伤和炎症因子分泌,减少细胞凋亡。     

Mitogen-activated protein kinase and activator protein-1 dependent signals are essential for Bacteroides fragilis enterotoxin-induced enteritis

The approximately 20-kDa heat-labile toxin produced by enterotoxigenic Bacteroides fragilis is known to be associated with the development of enteritis. However, the molecular mechanism involved is not yet fully understood. In this study, we assessed whether B. fragilis enterotoxin (BFT)-induced enteritis is related to mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways. In human colon epithelial cells, BFT activated three major MAPK cascades. The activation of p38 was sustained for a relatively long period, while the stimulation of extracellular signal-regulated kinases (ERK) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) was transient. BFT stimulation also activated AP-1 signals composed of c-Jun/c-Fos heterodimers. The p38 inhibitor SB203580 and the ERK inhibitor U0126 reduced not only AP-1 activity, but also decreased IL-8 and MCP-1 expression. In addition, the overexpression of superrepressors for c-Jun and Ras induced by BFT stimulation decreased the levels of IL-8 and MCP-1 production. Furthermore, SB203580 prevented BFT-induced colitis in the mouse ileum, as evidenced by significant decreases in villous destruction, neutrophil infiltration, and mucosal congestion. These results suggest that a pathway, including Ras, MAPK, and subsequent AP-1 activation, is required for IL-8 and MCP-1 expression in intestinal epithelial cells exposed to BFT, and can be involved in the development of enteritis.     

血管活性肠肽对RAW264.7小鼠巨噬细胞TREM-1功能的影响

目的　观察血管活性肠肽(VIP)对RAW264.7小鼠巨噬细胞髓样细胞表达的触发受体-1（TREM-1）功能的影响。 方法　以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为研究对象,细胞接种于培养板后采用TREM-1的单克隆激动抗体激活TREM-1,VIP预处理组采用10 nM的VIP进行干预。1 h后采用Western blot法检测胞内PLC-γ磷酸化改变,采用DCFH-DA荧光探针检测胞内活性氧簇（ROS）的含量;6 h后,采用real-time PCR法检测巨噬细胞TREM-1受体激活后下游靶基因肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的基因表达;12 h后,采用ELISA法检测细胞培养上清液TNF-α和MCP-1的蛋白含量。 结果　采用TREM-1单克隆激动抗体处理小鼠巨噬细胞后,可显著增高胞内PLC-γ磷酸化水平、ROS含量,以及TNF-α和MCP-1的mRNA与蛋白水平,而VIP预处理可明显抑制单克隆激动抗体所诱导的上述反应。 结论　VIP可抑制RAW264.7小鼠巨噬细胞TREM-1激活后诱导的功能改变,从而发挥抗氧化抗炎的作用。