HDAC1调控Wnt/β-catenin信号通路对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的:研究组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制。方法:RT-qPCR和Western blot法分别测定正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的m RNA和蛋白水平。在MDA-MB-231细胞中转染HDAC1 si RNA,RT-qPCR和Western blot测定HDAC1的表达水平,MTT法测定细胞活力,流式细胞术测定凋亡,Western blot测定细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和cleaved caspase-3的蛋白水平。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理下调HDAC1表达后的乳腺癌细胞,测定细胞活力和凋亡。结果:乳腺癌细胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的m RNA和蛋白水平均明显高于正常乳腺上皮细胞系MCF-10A(P 0. 01),并且MDA-MB-231细胞中的HDAC1水平最高。HDAC1 si RNA可以降低乳腺癌细胞中HDAC1的m RNA和蛋白水平。敲减HDAC1表达后的MDA-MB-231细胞活力降低,细胞凋亡率升高,细胞中cleaved caspase-3水平升高,β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白水平降低(P 0. 05)。Wnt/β-catenin信号通路激活剂可以逆转HDAC1下调诱导的MDA-MB-231细胞凋亡和细胞活力降低,减少cleaved caspase-3的水平(P 0. 05)。结论:敲减HDAC1的表达可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活诱导乳腺癌细胞凋亡。     

抑制HMGB1表达促进血管瘤内皮细胞凋亡的机制研究

目的:探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对血管瘤内皮细胞(HemECs)活力和凋亡的影响及机制。方法:分离培养人HemECs,将设计并合成的HMGB1小干扰RNA(HMGB1-siRNA)转染HemECs。CCK-8法检测各组细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率及活性氧(ROS)含量;Western blot检测HMGB1、NF-κB p65、p-IκBα、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和survivin的蛋白表达。结果:与空白对照组比较,转染HMGB1-siRNA的HemECs中HMGB1的蛋白表达显著降低(P0.05)。与NC组比较,转染HMGB1-siRNA的HemECs活力显著降低,凋亡率显著升高,ROS含量显著升高,NF-κB p65、p-IκBα、cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著降低(P0.05);且与si-HMGB1组比较,HemECs中加入NF-κB信号通路抑制剂PDTC后,细胞活力抑制、凋亡率和ROS诱导及NF-κB p65、p-IκBα、cyclin D1和survivin的蛋白表达下调更明显(P0.05)。结论:抑制HMGB1表达可降低人HemECs活力和诱导凋亡,机制可能是通过提高ROS含量及下调NF-κB信号通路。     

NOX1在TNF-α诱导的肺泡上皮细胞氧化损伤和炎症中的作用研究

目的:探索NADPH氧化酶1(NOX1)在肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症中的作用。方法:以real-time PCR和Western blot法测定TNF-α处理后肺泡上皮细胞中NOX1的m RNA和蛋白表达水平。在肺泡上皮细胞中转染NOX1 si RNA及其阴性对照,以TNF-α诱导以后,用real-time PCR和Western blot测定细胞中NOX1水平。硫代巴比妥酸法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性,ELISA法检测细胞培养液中的白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素1β(IL-1β)含量,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡蛋白cleaved caspase-3的水平。结果:TNF-α诱导处理后A549细胞中NOX1 m RNA和蛋白水平均升高(P 0. 05),NOX1 si RNA转染可以下调细胞中NOX1的m RNA和蛋白表达(P 0. 05),转染si RNA阴性对照对细胞中NOX1的m RNA和蛋白表达没有影响。TNF-α处理后细胞中MDA含量升高,SOD活性降低,细胞分泌的IL-4、IL-6和IL-1β增多,细胞凋亡率和凋亡蛋白cleaved caspase-3水平均升高,与没有经TNF-α处理的细胞比较,差异有统计学意义(P 0. 05)。下调NOX1的细胞经TNF-α诱导后,细胞中MDA含量降低,SOD活性升高,细胞分泌的IL-4、IL-6和IL-1β减少,凋亡率及凋亡蛋白cleaved caspase-3水平降低,与只经过TNF-α诱导处理的细胞比较,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论:TNF-α诱导肺泡上皮细胞表达NOX1。下调NOX1表达可减少细胞氧化损伤和炎症因子分泌,减少细胞凋亡。     

TNF-α激活Wnt信号通路促进人结肠癌干细胞侵袭

目的探讨炎症环境下Wnt信号通路对人结肠癌干细胞侵袭的影响。方法以人结肠癌细胞系HT29细胞为材料,用流式细胞荧光分选技术(FACS)分选CD44+CD133+的人结肠癌干细胞;流式细胞术及单细胞克隆形成实验对分选出的干细胞进行鉴定;肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理CD44+CD133+HT29细胞建立炎症细胞模型,噻唑蓝(MTT)实验筛选TNF-α作用的最适剂量及最佳作用时间; Wnt信号通路抑制剂Dickkopf相关蛋白1(DKK1)作用于CD44+CD133+HT29炎症细胞,实验分为空白组、TNF-α处理组、加DKK1的TNF-α处理组。MTT实验检测各组细胞增殖情况,Western blot法检测Wnt信号通路中相关蛋白β联蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、c-Myc及上皮间质转化(EMT)相关蛋白上皮钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的表达情况,TranswellTM侵袭实验检测各组细胞侵袭情况。结果流式细胞分选术成功分选出结肠癌CD44+CD133+HT29干细胞。MTT实验筛选出TNF-α作用的最适剂量为10 ng/m L,最佳作用时间为48 h。与空白组相比,TNF-α处理组中CD44+CD133+HT29细胞的相对存活率增加,TranswellTM穿膜的细胞数增加,β-catenin、cyclin D1、c-Myc表达升高,E-cadherin表达降低、vimentin表达升高;与TNF-α处理组相比,加DKK1的TNF-α处理组CD44+CD133+HT29细胞的相对存活率降低,TranswellTM穿膜细胞数减少,β-catenin、cyclin D1、c-Myc表达降低,E-cadherin表达升高、vimentin表达降低。结论TNF-α通过激活Wnt信号通路促进结肠癌干细胞的侵袭能力。     

Zeste基因增强子同源物2通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响脑胶质瘤细胞凋亡

目的:探讨zeste基因增强子同源物2(EZH2)通过调控Wnt/β-catenin信号通路对脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法:以RT-q PCR和Western blot检测胶质瘤U87、H4和U251细胞及正常人脑星形细胞(NHA)中EZH2的表达水平。在H4细胞中转染EZH2 siRNA和siRNA control,MTT测定细胞活力,流式细胞术测定细胞凋亡,分光光度计法检测caspase-3的活性,Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-连环蛋白(β-catenin)和下游靶分子c-Myc的蛋白表达。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理转染EZH2 siRNA的H4细胞,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定β-catenin和c-Myc的表达。结果:胶质瘤U87、H4和U251细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平均明显高于NHA(P0.05),并且H4细胞中EZH2 mRNA和蛋白水平高于U87和U251细胞(P0.05)。EZH2 siRNA可以明显下调H4细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平。EZH2表达下调后的H4细胞从48 h开始细胞活力降低,并且细胞凋亡率也明显升高,细胞中caspase-3活性也明显升高(P0.05),同时EZH2表达下调还可以抑制β-catenin和c-Myc的表达。Wnt/β-catenin信号通路的激活剂可以减少EZH2诱导的H4细胞凋亡,降低细胞中caspase-3的活性。结论:EZH2在脑胶质瘤细胞中过度表达,下调其表达可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活而诱导胶质瘤细胞凋亡。     

siRNA沉默WT1对小鼠足细胞Wnt/β-catenin和nephrin表达的影响

 目的:研究小干扰RNA(siRNA) 干扰WT1基因表达的小鼠足细胞Wnt/β-catenin信号通路的变化及其对足细胞活力和nephrin表达的影响。方法:采用RPMI-1640培养基在33 ℃条件下传代培养足细胞,在37 ℃条件下诱导足细胞分化。应用WT1基因的siRNA转染分化成熟的小鼠足细胞,用MTT法测定细胞活力,用实时qRT-PCR和Western blotting技术分别检测mRNA和蛋白的表达。结果:RNA干扰WT1可诱导小鼠足细胞Wnt1 mRNA和蛋白表达上调,p-β-catenin水平降低及足细胞活力下降,伴有足细胞nephrin mRNA和蛋白的表达明显下调。结论: 沉默WT1基因的表达可诱导足细胞活力下降和nephrin表达下调,可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

Wnt/β-catenin信号通路调控哮喘气道重塑的机制研究

目的:探讨Wnt/β-catenin信号通路调控哮喘气道平滑肌细胞(ASMC)的功能和参与哮喘气道重塑的机制。方法:建立大鼠哮喘模型,提取大鼠ASMC。Western blot法检测哮喘组和正常组大鼠ASMC中β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、原癌基因c-Myc和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白表达。抑制哮喘组和对照组ASMC中β-catenin和转录辅助因子p300/CBP间的相互作用后,采用CCK-8法和流式细胞术检测ASMC的细胞活力和周期变化。抑制P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性后,采用Western blot法检测c-Myc和cyclin D1的蛋白表达变化。结果:Western blot法显示哮喘组ASMC中β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白表达水平均明显高于对照组(P0.05),同时GSK-3β的蛋白表达水平则低于对照组(P0.05)。抑制β-catenin和p300/CBP间相互作用后,哮喘组ASMC的细胞活力下降幅度和细胞周期改变程度均较对照组更为明显(P0.05)。抑制P38 MAPK活性后,哮喘模型大鼠及对照大鼠ASMC中Wnt/β-catenin信号通路的靶蛋白c-Myc和cyclin D1的表达均下调,差异有统计学意义(P0.05)。结论:Wnt/β-catenin信号通路可能通过上调c-Myc和cyclin D1的表达、与P38 MAPK信号通路相互作用以及调控ASMC的生长和分化等途径,影响ASMC的功能,参与哮喘气道重塑。     

RNA 干扰抑制BAG-1 基因表达对皮肤鳞状细胞癌增殖及凋亡的影响研究

目的:探讨抑制BAG-1(Bcl-2-associated athanogene-1)基因表达对皮肤鳞状细胞癌增殖及凋亡的影响。方法:采用LipofectamineTM2000 将BAG-1 的siRNA 转染皮肤鳞状细胞癌A431,转染后48 h,RT-PCR 检测BAG-1 的mRNA 表达,Western blot 检测BAG-1 的蛋白表达;CCK8 和流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡情况;Western blot 检测B 细胞淋巴瘤/ 白血病-2(Bcl-2)家族促凋亡蛋白Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)及Wnt/β-catenin 信号通路β-连环蛋白(β-catenin)、Survivin 的蛋白表达;ELISA 试剂盒检测白介素6 (IL-6)、血管内皮生长因子(VEGF)含量。结果:与空白组和阴性对照组比较,转染BAG-1 的siRNA 可明显抑制BAG-1 在转录和翻译水平上的表达;与空白组较,BAG-1-siRNA 组细胞增殖显著降低,细胞凋亡率显著增加,Bax 蛋白表达上调, β-catenin、Survivin 蛋白表达下调,IL-6、VEGF 含量均显著降低(P<0.05)。结论:BAG-1 表达沉默可降低皮肤鳞状细胞癌增殖,促进细胞凋亡,上调Bax 及下调Wnt/ β-catenin 信号通路表达,降低IL-6、VEGF 因子的分泌。     

乌司他丁对脓毒血症大鼠肠黏膜屏障损伤的保护及其对Wnt信号通路的影响

目的 探讨乌司他丁（尿抑制素,UTI）能否对大鼠脓毒症肠黏膜损伤提供保护及其机制。 方法 选取SD大鼠100只,采用计算机软件随机分为对照组、脓毒症组、乌司他丁组、XAV939+乌司他丁组、氧化锂（LiCl ）+乌司他丁组。以经典盲肠结扎穿孔法建立脓毒症模型,检查评估空肠黏膜的损伤。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测炎症因子白细胞介素（IL-6）及肿瘤坏死因子（TNF-α）水平,采用Real-time PCR、Western blotting检测乌司他丁对β-连环蛋白（β-catenin）和细胞周期蛋白（cyclin D1）的表达情况;观察XAV939阻断或者LiCl激活Wnt信号通路对乌司他丁保护大鼠肠黏膜及Wnt信号通路相关蛋白的影响。 结果 脓毒症组IL-6、TNF-α水平及肠道黏膜损伤评分均显著高于乌司他丁组;脓毒症组β-catenin及cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平均较对照组显著升高,差异具有显著性（P<0.05）,给予乌司他丁处理之后,β-catenin及cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低,差异具有显著性（P<0.05）;与乌司他丁相比,XAV939促进了乌司他丁对大鼠肠黏膜的保护的作用,而且β-catenin和cyclin D1的蛋白表达降低（P<0.05）;LiCl减弱了乌司他丁对大鼠肠黏膜的保护作用,而且β-catenin和cyclin D1的蛋白表达升高,差异具有显著性（P<0.05）。 结论 乌司他丁通过下调β-catenin的表达抑制Wnt信号通路,降低炎症因子IL-6、TNF-α表达,从而改善脓毒症导致的肠黏膜屏障功能损伤。     

PRRX2通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌细胞活力和迁移

目的:研究配对相关同源框2(paired-related homeobox 2,PRRX2)基因对胃癌细胞活力和迁移能力的影响,并分析其调控Wnt/β-catenin信号通路的机制。方法:通过生物信息学分析在线数据库中胃癌和正常胃组织的PRRX2表达水平及PRRX2在胃癌组织中的表达与胃癌患者总生存率的相关性;将PRRX2小干扰RNA(si RNA)和过表达质粒分别转染到胃癌细胞MGC-803和SGC-7901中,敲低和过表达PRRX2基因;MTT法和Transwell实验检测胃癌细胞的活力和迁移能力;Western blot和TOPflash/FOPflash双萤光素酶报告基因实验检测Wnt/β-catenin信号通路的活化情况;免疫共沉淀实验检测PRRX2与β-catenin蛋白的相互作用。结果:敲低PRRX2能够减弱胃癌细胞MGC-803的活力和迁移能力(P0.05)。过表达PRRX2能够增强胃癌细胞SGC-7901的活力和迁移能力(P0.05),增加β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白的表达水平(P0.05),增强TOPflash/FOPflash双萤光素酶报告基因活性(P0.05)。PRRX2与β-catenin蛋白存在相互作用。结论:PRRX2可促进胃癌细胞的活力和迁移,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。     

干扰Yes相关蛋白表达调控Wnt/β-catenin信号通路影响膀胱癌细胞凋亡

目的:探讨干扰Yes相关蛋白(YAP)的表达对膀胱癌细胞凋亡的影响及机制。方法:以膀胱癌细胞T-24为研究对象,分为正常对照(control)组、siRNA阴性对照(siRNA-NC)组和YAP siRNA组。分别以real-time PCR和Western blot实验检测转染后各组细胞中YAP的mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测β-连环蛋白(β-catenin)和c-Myc表达水平。用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535处理YAP siRNA组细胞,并用MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:YAP siRNA组YAP的mRNA和蛋白水平均明显低于control组(P0.05)。YAP siRNA组的细胞活力及c-Myc和β-catenin水平均明显低于control组(P0.05),而细胞凋亡率明显高于control组(P0.05)。与未经FH535处理的YAP siRNA组细胞相比,YAP siRNA组的细胞经FH535处理后细胞活力明显下降,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:干扰YAP表达能够通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活而抑制膀胱癌细胞活力,并促进膀胱癌细胞凋亡。     

SPINK7对IL-22介导的角质细胞异常增殖及炎症应答的影响

目的:探讨SPINK7对IL-22刺激后角质形成细胞HaCaT的过度增殖及炎症应答的影响及其可能的机制.方法:采用IL-22刺激体外培养的HaCaT细胞.采用RT-PCR检测SPINK7和细胞炎症因子的mRNA表达;Western blot检测SPINK7,cyclin D1、survivin和Wnt/β-cateni...     

人参皂苷Rg1通过抑制Wnt/β-catenin通路促进退变人腰椎间盘髓核细胞的生长及胞外基质合成

目的:探讨人参皂苷Rg1对退变人腰椎间盘髓核细胞(HNPCs)生长的调控及其作用机制。方法:培养正常HNPCs,构建HNPCs的氧糖剥夺(OGD)模型模拟退变HNPCs的微环境。光镜观察正常HNPCs和OGD组细胞的形态。分别给予25、50和100μmol/L人参皂苷Rg1后,用real-time PCR和Western blot法分别检测II型胶原(collagen II)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的表达,CCK-8法检测细胞活力的变化,real-time PCR法检测增殖蛋白Ki67的转录水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平,caspase-3试剂盒检测caspase-3活性,Western blot法检测Wnt/β-catenin通路蛋白的表达。加入Wnt/β-catenin通路激活剂Li Cl后,检测其对Wnt/β-catenin通路蛋白、细胞活性、细胞凋亡及基质合成蛋白表达的影响。结果:正常HNPCs细胞贴壁快,形态呈类圆形,胞质丰富;OGD组细胞贴壁较慢,形态多为长梭形,胞质减少,初步证实了退变HNPCs模型构建成功。与HNPCs组相比,OGD组中collagen II和aggrecan的m RNA和蛋白表达均显著降低(P0.05),人参皂苷Rg1可升高collagen II和aggrecan的表达(P0.05)。与HNPCs组相比,OGD组的细胞活力显著降低(P0.05),Ki67表达下调(P0.05),而不同浓度的人参皂苷Rg1可增加细胞活力和上调Ki67的表达(P0.05)。同时,不同浓度的人参皂苷Rg1可减少OGD增加的细胞凋亡和caspase-3活性(均P0.05)。此外,100μmol/L人参皂苷Rg1可显著减弱OGD触发的Wnt/β-catenin通路的活化(P0.05)。而用Wnt通路激动剂Li Cl处理后可明显减弱人参皂苷Rg1对OGD细胞的保护作用(P0.05),提示该通路参与人参皂苷Rg1对退变HNPCs的保护作用。结论:人参皂苷Rg1可通过抑制Wnt/β-catenin通路促进HNPCs的生长和胞外基质合成。本研究将为退变HNPCs的防治提供新的思路。     

RARG对胃癌细胞活力和迁移能力的影响

目的:探讨视黄酸受体γ(retinoic acid receptor gamma,RARG)对胃癌细胞活力和迁移能力的影响及其机制。方法:采用生物信息学技术分析在线数据库中胃癌和正常胃组织的RARG表达水平及其与胃癌患者总生存率的相关性;利用过表达质粒转染和RNA干扰技术,在体外促进和抑制胃癌细胞中RARG的表达,并采用MTT和Transwell实验检测RARG对胃癌细胞活力和迁移能力的影响;通过Western blot和TOP/FOP双萤光素酶报告基因检测RARG对Wnt/β-catenin信号通路的调控;利用免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验检测RARG与β-catenin蛋白的相互作用情况。结果 :过表达RARG能够增强胃癌细胞SGC7901的活力和迁移能力(P0.05),敲减RARG能够减弱胃癌细胞MGC-803的活力和迁移能力(P0.05)。同时,过表达RARG能够增加β-catenin、c-Myc、cyclin D1、Twist和Snail的蛋白表达水平(P0.05),以及TOP/FOP双萤光素酶报告基因活性(P0.05)。另外,RARG与β-catenin蛋白存在相互作用。结论 :RARG通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌细胞的活力和迁移能力,其基因在胃癌的发生发展中扮演着癌基因的角色。     

梓醇促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖过程中Wnt信号通路的变化

 目的：观察梓醇促进大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖过程中Wnt信号通路的变化。方法：（1）采用机械分离及差速贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,将细胞分为空白对照组与梓醇（1.0 mg/L）处理组,流式细胞术检测各组细胞细胞周期分布情况,计算其增殖指数。（2）实时荧光定量PCR法检测各组细胞中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11及β-catenin mRNA的表达水平;Western blotting技术检测各组细胞β-catenin蛋白的表达变化。结果：（1）空白对照组与梓醇处理组BMSCs增殖指数分别为8.90%±0.46%和17.93%±1.68%（P<0.01）。(2）与空白对照组相比,梓醇处理组Wnt5a、Wnt11、β-catenin mRNA及β-catenin蛋白表达均明显提高,但Wnt3a mRNA表达无显著变化。结论：梓醇在促进BMSCs增殖过程中可同时激活经典与非经典Wnt信号通路。