CRISPR/Cas12系统在肿瘤检测中的应用

快速、灵敏、特异的检测方法对于提高肿瘤患者的生存率并改善预后至关重要。除了在基因编辑领域的贡献，近年来成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统以其特有的靶标核酸识别切割能力和反式切割活性为特点，已成为新一代核酸检测工具被广泛应用于病原体、肿瘤和转基因等检测领域。基于此，该文对CRISPR/Cas12系统原理及其在不同肿瘤标志物中的检测应用进展作一综述，并对其应用前景进行展望，以期为CRISPR/Cas系统更好地应用于肿瘤筛查和诊断提供参考及借鉴。     

基于CRISPR/Cas技术的核酸即时检测研究进展

鉴于目前核酸分子检测技术逐步从临床实验室向现场检测转移的发展趋势,急需建立一种高灵敏、高特异、高效和便捷的新型核酸诊断工具来满足临床即时检测（POCT）的需要。基于规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）的检测方法是一种有前景的新型核酸检测方法。该方法中Cas效应蛋白能够识别高度特异的...     

CRISPR-Cas13a系统在基因编辑和分子诊断领域中的研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统是一个强大的基因编辑工具。相对于Cas9,Cas13a可靶向多基因转录产物,从而调控基因功能表达,填补了Cas9仅限于DNA水平的编辑及脱靶效应等缺陷。不仅如此,利用Cas13a靶向RNA的特性,该系统被成功地改造成下一代核酸诊断工具。文章概述了CRISPR-Cas13系统在基因编辑及分子诊断领域的最新研究进展,并对该系统的应用前景进行了展望。     

CRISPR/Cas系统在分子检测中的应用

近年来,成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律短回文重复序列相关蛋白(CRISPR/Cas)系统凭借其简单、高效的基因编辑能力,已被广泛应用于生物、医学等多个研究领域。随着CRISPR技术的快速发展,CRISPR/Cas系统已被开发为一种快速、便携、低成本、高灵敏度的分子检测工具,在病原体检测、耐药性分析、单核苷酸多态性(SNP)分型、肿瘤基因突变检测等方面取得重大突破。文章就不同Cas蛋白在分子检测中的最新研究进展进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为从事相关领域的科研工作者提供参考与帮助。     

应用CRISPR/Cas9基因编辑系统对HEK293细胞系TSC1基因稳定敲除效果的实验鉴定

目的　利用成簇规律间隔短回文重复序列/ 成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白（clustered regularly interspacedshort palindromic repeat/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas9）基因编辑系统在HEK293 细胞系中对TSC1 基因稳定敲除,并对其敲除效果进行鉴定。方法　根据TSC1 基因的序列设计sgRNA,将sgRNA 克隆到载体lentilCRISPRv2 上,将连接产物转化至Stbl3 感受态细胞,对菌液进行测序鉴定。将鉴定成功的lentiCRISPRV2-sgTSC1 质粒转染至HEK293细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,挑选单细胞克隆进行PCR 鉴定,选取条带单一的细胞株用Western blot 鉴定TSC1 基因的表达。结果　成功构建lentiCRISPRV2-sgTSC1-1/2 重组质粒,并利用该质粒完成对TCS1 基因的定点切割,Westernblot 结果显示细胞中无TSC1 表达。结论　用CRISPR/Cas9 系统成功构建TSC1 基因敲除的稳定细胞株,为后续实验奠定了基础。     

基因魔剪CRISPR/Cas:核酸精准检测的新宠和利器

规则成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)系统是存在于大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫系统。作为一种高效的基因定点编辑工具,CRISPR/Cas系统不仅在基因敲出、基因治疗及基因修饰等领域炙手可热,而且正在发展成为核酸精准检测领域的新利器。随着众多研究者的不断探索,便携、快速、低成本、灵敏度高、特异性强的CRISPR/Cas核酸精准检测技术不断涌现。本文就CRISPR/Cas技术在核酸快速精准检测领域的最新成果作一概述,并总结展望其面临的困难和挑战。     

基于CRISPR/Cas蛋白的副溶血弧菌检测方法的研究

目的利用规律间隔性成簇短回文重复序列（CRISPR）免疫原理及Cas12a酶的特点构建一种快速检测副溶血弧菌（VP）的方法,实现对病原菌准确快速的检测和识别。方法本研究通过制备纯化Cas12a蛋白,筛选构建VP的gRNA,建立CRISPR-VP荧光检测系统,根据最终荧光扩增曲线判定CRISPR-VP检测方法的有效性。结果在CRISPR-VP检测方法中只在VP的序列存在时才会产生明显的荧光信号。结论本实验初步建立了基于CRISPR/Cas蛋白的VP的检测方法,为后续简易检测试剂的研制提供理论依据。     

Ⅰ型CRISPR系统参与细菌生物膜形成与耐药调控的研究进展

近年来细菌的耐药问题日益严重,其形成生物膜后更是具有极强的耐药能力,治疗难度极大提高。除屏障作用、微环境改变等理化因素外,生物膜中部分基因调控也特异地提高细菌耐药性。细菌耐药与形成生物膜的能力之间可能存在共同的调控机制。Ⅰ型成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统能够调节细菌耐药基因的获得和传播,其作用因种属、...     

CRISPR/Cas系统在新型冠状病毒肺炎快速诊断中的应用

近年来,基于规律成簇间隔的短回文重复序列（ clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）及其相关蛋白（ CRISPR-associated protein, Cas）系统的新型分子诊断工具,为病原体的诊断开辟了新的机遇。该文将关注现有和正在研究的 CRISPR/Cas系统用于新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）快速诊断的潜在能力,并重点探讨其在临床中的应用和面临的挑战。     

CRISPR/Cas技术在病原体检测中的应用

1987 年在大肠埃希菌基因组中首次发现了成簇间隔短回文重复序列(CRISPR),具有切割外来入侵病毒核酸的获得性免疫功能[1].CRISPR及其相关蛋白(CRISPR/Cas)系统是由编码 Cas 蛋白基因和由启动子加上重复序列与入侵核酸同源的间隔序列交替而构成[2].该系统的获得性免疫机制可以分为 3 个阶段:获得...     

基于CRISPR/Cas9技术构建人CLCN7基因编辑载体

目的为修复石骨症致病基因(CLCN7)进行前期探索,采用CRISPR/Cas9技术构建CLCN7基因编辑表达载体。方法根据sgRNA设计原则,在CLCN7外显子区设计一对sgRNA,合成四条单链DNA寡核苷酸,退火后连接于CRISPR/Cas9质粒的BspQ I酶切位点处,然后转染感受态大肠杆菌DH5α,并通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,扩大培养。结果最后经过PCR和Sanger测序鉴定获得了两个基因编辑表达载体CLCN7-sg1RNA-CRISPR-Cas9和CLCN7-sg2RNACRISPR-Cas9。结论基因编辑载体的成功构建为CLCN7突变修复提供了工作基础。     

基于CRISPR-Cas12a蛋白的副溶血弧菌及tdh基因检测分析

目的 将重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,建立一种快速检测并分型副溶血弧菌的检测方法.方法 通过纯化CRISPR相关蛋白Cas12a,设计和合成RAA引物、crRNA和单链DNA报告分子,建立副溶血弧菌的荧光和试纸条检测方法.采用煮沸法提取细菌核酸,经RAA扩...     

规律成簇的间隔短回文重复序列中间隔序列的噬菌体来源研究

目的 发现在现有的全基因组测序完成的原核生物中规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)系统中间隔序列分布规律以及间隔序列中噬菌体来源情况. 方法 整理现有CRISPR数据库中2762株细菌基因组中的CRISPR系统和其中的间隔序列数据,整理GenBank数据库中发表的1444个噬菌体基因组数据.利用BLASTN软件对间隔序列数据与噬菌体基因组进行相似性比较,计数资料比较使用2检验. 结果 在2762个细菌基因组中整理出1940个基因组存在确定或可能的CRISPR结构和90 096条间隔序列,多数基因组具有1~50条间隔序列(1414/1940,72.9%),间隔序列数量250条的仅有58个基因组(58/1940,3.0%).其中古细菌13株(13/150,8.6%),真细菌45株(45/2612,1.7%),差异有统计学意义(2=29.98,P 0.01).相似性比较结果共发现245个细菌基因组的1055条间隔序列,成功比对上363个噬菌体,比对成功率仅为0.12%. 结论 细菌基因组中的CRISPR系统中间隔序列数量存在较大差异,古细菌基因组中CRISPR系统存在更多的间隔序列.相似性比较中噬菌体来源的间隔序列所占比例低,提示与细菌和噬菌体基因组发现较少相关,进一步深入研究可以大幅度提高成功率.     

多重核酸检测技术的临床应用现状及未来

多重核酸检测技术具有可同时检测多个靶标、高通量、低成本等优势,满足大规模筛查、定量等检测需求。多重聚合酶链反应广泛应用于病原体、甲基化DNA和突变基因检测以及单核苷酸多态性分型;重组聚合酶扩增、环介导等温扩增等等温扩增技术在即时检测领域有很好的前景;基于规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（...     

利用成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞株的研究

目的:探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法:①选择 GATA1基因为目的基因,利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体...     

CRISPR/Cas系统在感染性疾病诊断中的应用

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统,作为原核生物的适应性免疫防御系统,近年来已经被开发成为一种高效的分子诊断工具,其特异、灵敏、快速、便捷等优势使得其在分子诊断领域,尤其是在感染性疾病的诊断上有着极佳的发展前景。本文旨在对CRISPR/Cas系统在感染性疾病诊断的应用现状、优...     

CRISPR/Cas系统在SARS-CoV-2检测中的应用

摘要:新型冠状病毒( SARS-CoV-2)全球流行,快速有效的检测方法对于疫情防控和患者救治极为重要。目前已有多种方法应.用于SARS-CoV-2的检测,但均存在一定的局限性。研究发现,采用CRISPR/Cas系统构建的SARS-CoV-2检测方法具有快速、便捷的优势。目前应用于SARS-CoV-2检测的CRISPR/Cas系统主要包括CRISPR/Cas9. CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13,多以SARS-CoV-2的核酸和蛋白质作为检测靶标。因此,该文对基于CRISPR/Cas系统的SARS-CoV-2检测方法分别从核酸和蛋白质2个角度进行综述,并就各自的优缺点及未来发展趋势进行分析，期望为CRISPR/Cas系统在传染病检测中的应用提供参考。     

基因编码技术应用研究进展

<正>基因编码是将基因插入、删除和替换基因序列的基因工程技术,是研究基因功能、了解疾病遗传机理、探索疾病基因治疗的新技术革命,该项技术于2020年获得诺贝尔奖。基因编码技术包括四种不同类型,分别是巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶和成簇规律间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR）系统。由于CRISPR技术操作简单,便于开发利用,本文着重对该项技术在医疗领域的应用进展作一综述。     

应用CRISPR/Cas 9 系统构建肺癌细胞系获得AMPKα1 基因敲除的稳定细胞株

目的 利用CRISPR/Cas 9 系统在人肺癌细胞系A549 和H460 中获得敲除腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1(adenosine monphosphate-activated protein kinase, AMPKα1) 的稳定表达细胞系。方法 根据CRISPR/Cas 9 靶点设计原则,设计三条引导RNA（sgRNA）,分别构建AMPKα1-CRISPR/Cas9 KO 及其HDR 质粒。将质粒转染至A549 和H460 细胞后,筛选稳定的单克隆细胞株。用Western blot 鉴定筛选获得的肺癌细胞株是否表达AMPKα1。实验被分为原始对照组和敲除组,采用MTT 法检测AMPKα1 的肺癌细胞增殖情况。结果 经过CRISPR/Cas 9 系统处理后,筛选获得的A549 和H460 敲除AMPKα1 稳定细胞株与原始细胞株A549 和H460 相比,Western blot 检测不到AMPKα1蛋白质的表达,差异具有统计学意义(t=137.7, 79.17, 均P ＜ 0.000 1)。MTT 结果显示,筛选获得的A549 和H460 敲除AMPKα1 的稳定细胞株与原始细胞株A549 和H460 相比,敲除细胞株的增殖速度明显减弱,差异具有统计学意义（t=3.956 ～ 28.16,均P ＜ 0.05）。结论 CRISPR/Cas 9 系统成功建立敲除AMPKα1 表达的稳定肺癌细胞株,为进一步研究AMPKα1 在肺癌发生发展中的作用提供细胞模型。     

RNA测序联合CRISPR/Cas9基因编辑技术鉴定调控维甲酸诱导分化功能的miRNA

目的:研究miRNA的敲除对全反式维甲酸(ATRA)介导的急性早幼粒细胞白血病髓系分化的影响,并鉴定具有诱导分化功能的miRNA.方法:首先应用miRNA测序技术分析ATRA作用后miRNA的变化水平.选取上调和下调的miRNA若干,设计合成针对miRNA前体基因序列的sgRNA,通过CRISPR/Cas9技术实现mi...