丝素蛋白膜上褐藻糖胶的固定化及其体外抗凝血性能

以戊二醛为交联剂，将褐藻糖胶固定在NH3等离子体处理的丝素膜的表面上。用FTIR、UV分析了褐藻糖胶的结构；采用XPS分析了丝素膜表面元素；采用部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）和凝血酶时间（TT）对其体外抗凝血活性作了初步的评价。丝素膜表面固定褐藻糖胶后，抗凝血性有了一定的提高。经稳定性测试，固定的褐藻糖胶仍具有一定的抗凝血性。     

AG490对HEL细胞VEGF和HIF-1α表达的影响

 目的: 探讨JAK2抑制剂AG490对人红白血病(HEL)细胞迁移及对VEGF和HIF-1α表达的影响。方法: 用不同浓度的AG490处理HEL细胞,CCK-8法检测细胞活力,Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡及周期,Transwell小室检测细胞迁移能力,RT-PCR检测JAK2的mRNA水平,Western blot检测p-JAK2、VEGF和HIF-1α的蛋白水平。结果: AG490能够抑制HEL细胞的活力,不同浓度(20、40、60、80和100 μmol/L)AG490作用HEL细胞48 h后,细胞活力分别为88%、75%、48%、10%和0.12%(P<0.05);Hoechst 33342凋亡细胞染色显示80 μmol/L AG490处理细胞48 h后,亮蓝色凋亡细胞较对照组明显增多(P<0.05);流式结果显示80 μmol/L AG490作用细胞48 h后,凋亡率上升;细胞迁移实验结果显示20 μmol/L AG490处理细胞24 h后漏出细胞明显低于对照组(P<0.05);RT-PCR结果显示不同浓度AG490处理HEL细胞48 h后JAK2 mRNA呈剂量依赖性减低;Western blot结果显示实验组细胞的p-JAK2、VEGF和HIF-1α蛋白水平较对照组明显减低(P<0.05)。结论: AG490可通过抑制JAK2信号通路,抑制HEL细胞血管新生因子VEGF和HIF-1α的表达。     

褐藻糖胶对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用

目的：研究褐藻糖胶对体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其凋亡机制。方法:不同浓度(100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L)褐藻糖胶处理MCF-7细胞48h后，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞的增殖；Hoechst 33258染色、琼脂糖凝胶电泳法观察细胞的凋亡的形态学及生化改变；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印迹分别测定细胞〖STBX〗bcl-2〖STBZ〗和bax mRNA及其蛋白的表达。结果:不同实验浓度(100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L)的褐藻糖胶均能抑制MCF-7细胞的增殖（P<0.01），抑制率呈浓度依赖性增大；褐藻糖胶诱导MCF-7细胞凋亡数增加，且可见明显的、凋亡特有的DNA梯形条带；在褐藻糖胶存在下，〖STBX〗 bcl-2〖STBZ〗 mRNA和蛋白表达减少，而bax mRNA和蛋白表达增加，Bcl-2/Bax比值下降（P<0.05）。结论:褐藻糖胶可抑制MCF-7细胞增殖，且诱导其凋亡，其凋亡机制是下调Bcl-2和上调Bax蛋白的表达。     

bFGF通过促进心脏血管新生改善心肌梗死后小鼠心脏重构

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)对心肌梗死小鼠心脏的保护作用及机制。方法:采用异氟烷麻醉C57/B6小鼠(8~12周龄)后,侧开胸结扎冠状动脉左前降支,建立小鼠心肌梗死模型;设立假手术组为对照,心肌梗死模型小鼠随机分为心梗组和bFGF给药组,其中bFGF组小鼠心梗7d后给予5μg b FGF隔天腹腔注射给药;在小鼠心梗第28天时采用心脏多普勒超声检测心功能,以左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左心室射血分数和左心室短轴缩短分数评价心脏功能改变;28 d后处死小鼠,行病理切片观察心肌纤维化程度和心肌梗死区内血管新生的情况;Western blot检测血管新生指标。结果:bFGF给药组小鼠心肌纤维化程度较心梗模型组明显减少;第28天行超声心动图检查结果示,心梗组小鼠心功能较假手术组差,而bFGF给药组小鼠心功能与心梗组比较有明显的改善;小鼠心肌病理切片免疫荧光观察结果发现,bFGF给药组心肌梗死区的新生血管比心梗组明显增多;Western blot实验表明,bFGF能够激活AKT/HIF-1α/VEGF通路。结论:隔天腹腔注射bFGF能够减少心肌梗死小鼠心肌纤维化,改善心功能。bFGF可能通过AKT/HIF-1α/VEGF信号通路促进血管新生,从而保护心脏。     

重组人血管内皮抑素对人多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226增殖和相关蛋白表达的影响

 目的： 研究重组人血管内皮抑素（恩度）在体外对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226细胞增殖、细胞周期及细胞相关蛋白表达的影响。方法： 用CCK-8检测恩度对RPMI 8226细胞增殖的影响;流式细胞术检测凋亡和细胞周期的改变;Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3表达变化;以实时定量PCR和Western blotting检测RPMI 8226细胞血管细胞粘附因子 1（VCAM-1）、白细胞介素 6（IL-6）和血管内皮生长因子（VEGF）mRNA以及蛋白表达变化;ELISA检测细胞上清液中细胞因子IL-6和VEGF水平。结果： 恩度对RPMI 8226细胞有增殖抑制作用,250 mg/L恩度对RPMI 8226细胞 72 h增殖抑制率为（59.5±5.6）%（P<0.05）,细胞G1期比例增加（P<0.05）,但对细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3表达无显著影响;经恩度作用后RPMI 8226细胞 VCAM-1表达下降（P<0.05）,IL-6和VEGF表达及分泌降低（均P<0.05）。结论： 恩度能通过改变细胞周期变化抑制RPMI 8226细胞增殖,并能减少VCAM-1表达及IL-6、VEGF分泌,对细胞凋亡无明显改变。     

落新妇苷对高糖刺激的血管内皮细胞SDF-1α表达的影响

 目的: 分析落新妇苷对高糖刺激的血管内皮细胞间质细胞衍生因子1α(SDF-1α)表达的影响。方法: SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素后诱导成急性糖尿病模型,采用硫代巴比妥酸法测量血浆丙二醛(MDA)浓度,采用紫外分光光度法检测血浆H₂O₂浓度,采用免疫荧光检测大鼠胸主动脉内皮细胞中SDF-1α的表达。人脐静脉内皮细胞(HUVECs)经高糖刺激后,用real-time PCR、ELISA和免疫荧光检测SDF-1α的表达,流式细胞术观察细胞周期分布情况,免疫荧光检测p65的表达和细胞内定位。结果: 糖尿病大鼠血浆MDA和H₂O₂水平均高于正常对照组,其胸主动脉内皮细胞SDF-1α的表达较正常组减弱;落新妇苷能降低糖尿病大鼠血浆MDA及H₂O₂的水平并增加胸主动脉内皮细胞SDF-1α的表达。体外高糖刺激呈浓度和时间依赖性减少HUVECs中SDF-1α表达,落新妇苷能一定程度地恢复SDF-1α表达。高糖刺激增加HUVECs S期比例,而落新妇苷减少其S期分布。高糖刺激HUVECs中p65蛋白核转位,落新妇苷抑制高糖诱导的p65核转位。结论: 落新妇苷能增加高糖刺激下内皮细胞表达SDF-1α,减少高糖状态下的氧化应激和NF-κB的活化。     

丙戊酸钠对RPMI8226和U266细胞增殖及IL-6/JAK/STAT信号通路的影响

 目的：探讨丙戊酸钠(valproic acid sodium, VPA)对人骨髓瘤RPMI8226和U266细胞增殖及IL-6/JAK/STAT信号通路的作用。方法： RPMI8226和U266细胞经不同浓度VPA处理12及24 h后进行实验,MTT法检测VPA对细胞增殖的影响,流式细胞术检测VPA处理后的细胞周期及凋亡率,ELISA法检测培养细胞上清IL-6的浓度,半定量RT-PCR检测VPA作用后RPMI8226和U266细胞中STAT3、STAT5、Bcl-xL、Mcl-1、c-Myc、CCND1和VEGF mRNA表达水平。Western blotting检测JAK2和STAT5总蛋白及磷酸化蛋白表达水平。结果：(1) 10、20及40 μmol/L VPA处理RPMI8226和U266细胞12 h及24 h后,细胞存活率值显著下降,与各对照组比较均有显著差异（P<0.05）,各对照组之间无显著差异。(2) VPA处理RPMI8226和U266细胞 24 h后,G1/G0期细胞增多,S期细胞减少,细胞凋亡率增加,且凋亡率与VPA的作用剂量相关。(3) VPA处理RPMI8226和U266细胞24 h后,上清IL-6浓度与VPA浓度呈负相关。(4) RPMI8226和U266细胞组在40 μmol/L VPA处理后其STAT3、STAT5、Bcl-xL、Mcl-1、c-Myc、CCND1和VEGF mRNA表达减低,与未处理组比较有显著差异。(5) 与对照组比较,VPA处理组p-JAK2、JAK2、p-STAT5和STAT5蛋白表达均显著降低。结论：(1) VPA对多发性骨髓瘤细胞有体外抑制作用; (2) VPA对骨髓瘤细胞株的体外抑制可能是通过调节IL-6/JAK/STAT信号通路来实现的。     

高压氧预处理通过HIF-1α/VEGF通路减轻大脑缺血再灌注损伤

目的:探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)通路在高压氧(HO)预处理减轻缺血再灌注(IR)模型大鼠大脑损伤过程中的作用。方法:选择SPF级健康雄性成年SD大鼠32只,使用随机数字软件将其分为对照组(control组)、IR组、HO-IR组和HO-IR-HIF-1α抑制剂组(HO-IR-I组)。IR模型通过大脑中动脉栓塞法制作,对照组仅分离暴露相应血管。HO-IR组和HO-IR-I组大鼠均在制模前在动物高压舱内进行HO治疗4周(每天1次);HO-IR-I组每天在HO预处理前,经腹腔注射4 mg/kg的HIF-1α抑制剂YC-1[3-(5’-hydroxymethyl-2’-furyl)-1-benzylindazol]。在制作模型第1天和第7天行神经行为学评估,第7天观察结束后麻醉处死大鼠,取脑组织测量梗死体积,Western blot检测HIF-1α/VEGF通路相关蛋白及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的水平,TUNEL法检测凋亡细胞数。结果:与control组比较,IR组、HO-IR组和HO-IR-I组大鼠的神经功能评分降低,脑梗死体积比例及HIF-1α、VEGF、Bax和Bcl-2的蛋白表达均增加,凋亡细胞数量亦增加(P0.05);与IR组比较;HO-IR组和HO-IR-I组的神经功能评分升高,HIF-1α、VEGF和抑凋亡蛋白Bcl-2表达上调,脑梗死体积比例降低,促凋亡蛋白Bax表达下调,凋亡细胞数量减少(P0.05);与HO-IR组比较,HO-IR-I组的神经功能评分降低,HIF-1α、VEGF和抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调,脑梗死体积比例升高,促凋亡蛋白Bax表达上调,凋亡细胞数量增加(P0.05)。结论:HO预处理减轻大脑IR损伤的机制可能与通过诱导HIF-1α/VEGF通路调节凋亡进程有关。     

人多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞条件培养液诱导破骨前体细胞的分化成熟

目的: 探讨人多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞条件培养液对破骨前体细胞RAW264.7的影响。方法: Western blotting检测可溶性核因子κB 受体激活剂配体(soluble receptor activator of NF-κB ligand, sRANKL)的蛋白表达。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate－resistant acid phosphatase, TRAP)染色观察RAW264.7细胞的分化成熟情况。RT-PCR法检测RAW264.7细胞TRAP和cathepsin K mRNA的表达。结果: Western blotting法证实RPMI 8226细胞条件培养液中含有sRANKL。TRAP染色发现RPMI 8226细胞条件培养液能诱导RAW264.7细胞分化为TRAP阳性的多核成熟破骨细胞。人抑制性RANKL单克隆抗体拮抗30%RPMI 8226细胞条件培养液中sRANKL的作用,且具有剂量依赖性。30% RPMI 8226细胞条件培养液能刺激RAW264.7细胞上调TRAP和cathepsin K mRNA表达。结论: 人多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226条件培养液中的sRANKL具有促RAW264.7破骨前体细胞分化成TRAP阳性的多核成熟破骨细胞的生物活性。人抑制性RANKL单克隆抗体阻断30%RPMI 8226细胞条件培养液中sRANKL的诱导分化作用,且具有浓度依赖性。     

三氧化二砷对多发性骨髓瘤细胞生物学特性的影响

目的探讨三氧化二砷(As2O3)对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞生物学特性影响的分子机制。方法用人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞作为体外实验对象。应用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡峰、死亡受体DR4和DR5分子及黏附分子VLA4(CD49d)的表达;用聚合酶链反应测定靶细胞CXCR4基因表达;免疫组化染色和荧光显微镜检测DR4和DR5分子的表达情况。结果5μmol/L的As2O3可以明显上调RPMI8226细胞DR4、DR5分子的表达(P<0.01),明显下调CXCR4基因和VLA4分子表达;还可以诱导RPMI8226细胞凋亡、增加G1期细胞比例,出现明显凋亡峰。结论As2O3诱导RPMI8226细胞凋亡,可能与死亡受体DR4、DR5分子过度表达有关;As2O3抑制靶细胞CXCR4基因和黏附分子VLA4的表达,从而影响细胞的增殖、迁移与归巢能力。     

Rapid induction of IAP family proteins and Smac/DIABLO expression after proapoptotic stimulation with doxorubicin in RPMI 8226 multiple myeloma cells

We studied the expression dynamics of inhibitor of apoptosis protein (IAP) family members and Smac/DIABLO after treatment with doxorubicin in human multiple myeloma cell line RPMI 8226 and its doxorubicin-resistant variant DRR. Proapoptotic stimulation with doxorubicin rapidly induced the overexpression of mRNA as well as protein for IAPs in RPMI 8226 cells followed by a gradual decrease of their expression. Smac/DIABLO, which is known to neutralize IAPs, showed increased expression at the mRNA level after treatment; however, Western blot analysis revealed a slight decrease of the amount of protein. Immunoprecipitation analysis revealed the association of Smac/DIABLO with cIAP1 or XIAP after treatment with doxorubicin. In contrast to the RPMI 8226 cells, DRR cells did not undergo apoptosis in response to doxorubicin treatment. The DRR cells had higher levels of IAPs expression at the mRNA level and did not show a remarkable peak or decrease in the expression of mRNAs for cIAP1, cIAP2, XIAP, and survivin after treatment with doxorubicin. Furthermore, the expression of Smac/DIABLO mRNA was not up-regulated after treatment. These findings indicate that the suppression of IAPs expression by Smac/DIABLO shortly after proapoptotic stimulation might play a role in the mechanisms of apoptotic induction, and that the maintenance of high IAPs expression and low Smac/DIABLO expression after treatment might lead to the doxorubicin-resistance of multiple myeloma cells.     

Rab1A对多发性骨髓瘤细胞系8226增殖和凋亡的影响

目的 探讨Rab1A对多发性骨髓瘤(MM)细胞系8226增殖和凋亡的影响.方法 采用siRNA干扰RabIA表达,将多发性骨髓瘤细胞8226分为空白对照组、阴性对照组和Rab1A siRNA组.其中空白对照组的多发性骨髓瘤细胞8226不做任何处理,阴性对照组的多发性骨髓瘤细胞8226转染阴性对照siRNA.Rab1A ...     

Abnormal cytokine production by bone marrow stromal cells of multiple myeloma patients in response to RPMI8226 myeloma cells

INTRODUCTION: Recent studies indicate that bone marrow stromal cells (BMSCs) derived from patients with multiple myeloma (MM) differ from those of healthy donors in their expression of extracellular matrix compounds and in cytokine production. It is not known whether these abnormalities are primary or are acquired by BMSCs on contact with MM cells. MATERIALS AND METHODS: Interleukin (IL)-6, IL-11, IL-10, and tumor necrosis factor (TNF)-alpha production by CD166+ mesenchymal BMSCs and the CD38+/CD138+ RPMI8226 myeloma cell line cultivated in vitro in monocultures or co-cultivated under cell-to-cell contact or non-contact conditions in the presence of a tissue culture insert were measured. Intracellular cytokines were measured by flow cytometry analysis as the percentage of cytokine-producing cells or by mean fluorescence intensity as the level of cytokine expression in cells. Additionally, ELISA was used to measure IL-6, soluble IL-6 receptor (sIL-6R), IL-11, IL-10, TNF-alpha, B-cell-activating factor of the TNF family (BAFF), hepatocyte growth factor (HGF), and osteopontin (OPN) production in the supernatants of the cultures and co-cultures. RESULTS: A higher ability of the BMSCs of MM patients than in controls was detected to produce IL-6, IL-10, TNF-alpha, OPN, and especially HGF and BAFF in response to the RPMI8226 cells. Moreover, the BMSCs of the MM patients significantly enhanced the production of sIL-6R by the RPMI8226 cells. DISCUSSION: Cytokines over-expressed by BMSCs of MM patients can function as growth factors for myeloma cells (IL-6, IL-10, HGF), migration stimulatory factors for tumor plasma cells (TNF-alpha, HGF), adhesion stimulatory factors (HGF, BAFF and OPN), stimulators of osteoclastogenesis (IL-6, TNF-alpha), and angiogenic factors (TNF-alpha). The results of this experiment strongly suggest that the BMSCs from MM patients differed in spontaneous and myeloma cell-induced production of cytokines, especially of HGF and BAFF, and these abnormalities were both primary and acquired by the BMSCs on contact with the MM cells. This in turn suggests the presence of an undefined, autocrine stimulation pathway resulting in a prolonged production of cytokines even in long-term cultures in vitro and in vivo. These abnormalities might provide optimal conditions for the proliferation and differentiation of residual tumor cells or their precursors in the affected bone marrow.     

力达霉素诱导人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡和周期阻滞

目的研究力达霉素(LDM)的抗骨髓瘤作用,并探讨抗骨髓瘤的作用机制。方法处于对数增殖期人多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226细胞随机分为空白对照组及0.1、0.5和1 nmol/L LDM组,用MTS法和流式细胞术检测细胞增殖率、细胞周期分布和凋亡情况,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白和周期相关蛋白的表达量。结果细胞培养48 h后,不同浓度LDM组细胞增殖数显著低于空白对照组数(P0.05),LDM组S期和G2/M期的细胞数显著高于对照组数(P0.05),细胞凋亡率显著高于空白对照组数(P0.05),LDM的增殖抑制作用和凋亡诱导作用呈剂量依赖性。不同浓度LDM组细胞caspase-3、caspase-7、caspase-9和poly ADP-ribose polymerase(PARP)的蛋白被切割明显高于对照组(P0.05),P21和P27蛋白的表达量明显高于对照组数(P0.05)。结论 LDM能诱导人多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226细胞凋亡并诱导S期和G2/M期阻滞,其诱导凋亡和周期阻滞的机制有待于进一步深入研究。     

双功能基因APE1对多发性骨髓瘤疗效的影响

目的探讨MM细胞APE1基因表达及定位对MM疗效的影响。方法采用双标免疫荧光结合激光共聚焦显微镜和免疫细胞化学分析MM细胞系KM3,并在32例MM患者和10例正常自愿者骨髓标本中检测APE1蛋白表达及定位。结果MM患者骨髓标本有APE1和CD38蛋白共表达;在作为阳性对照的MM细胞系KM3中胞核、胞核/胞浆、胞浆均有APE1表达,其中尤以胞核明显;APE1胞浆阳性分度在正常对照组、初治组、复发或难治组间依次增高(P<0.01或0.05)。结论APE1蛋白表达强度与MM疗效有关,APE1基因表达增强可能是MM患者预后不良的指标之一。     

miRNA-181a对多发性骨髓瘤细胞增殖和迁移的作用

目的:通过沉默人多发性骨髓瘤细胞株RPM18226中miRNA-181a的表达,观察RPM18226细胞的增殖、迁移和细胞周期的变化,并探讨其可能的作用机制。方法:实时荧光定量PCR检测多发性骨髓瘤患者和健康者血清标本中miRNA-181a的表达水平;转染miRNA-181a inhibitor后,CCK-8法与集落形成实验检测细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞的迁移能力,流式细胞术检测细胞的周期变化,Western blot法检测cyclin D1、p-PI3K和pAkt蛋白水平的变化。结果:多发性骨髓瘤患者血清中miRNA-181a呈高表达,显著高于正常人;转染miRNA-181a inhibitor后,RPM18226细胞的存活率和集落形成能力下降,迁移能力降低,G_0/G_1期细胞比例明显减少,S期细胞比例增多,cyclin D1蛋白表达显著低于正常对照组,PI3K和Akt的磷酸化水平明显低于正常对照组。结论:沉默miRNA-181a的表达能够抑制RPM18226细胞的增殖,并降低细胞的迁移能力,可能与细胞周期及PI3K/Akt信号通路有关。