载脂蛋白A-I模拟肽D4F通过抑制caspase-12减轻氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡

目的:探讨载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,Apo A-I)模拟肽D4F对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的巨噬细胞凋亡和内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)凋亡途径关键分子caspase-12的影响,并阐明其可能的分子机制。方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,给予12.5、25和50 mg/L D4F、5 mmol/L ERS抑制剂4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA)或5μmol/L二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium,DPI)预处理1 h后,再加入100 mg/L ox-LDL或4 mg/L ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)继续培养24 h。MTT法检测细胞活力;TUNEL法检测细胞凋亡情况;试剂盒测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶活性;Western blot法检测caspase-12的表达变化。结果:与ERS抑制剂PBA相似,D4F可抑制ox-LDL或TM所致的巨噬细胞活力降低和凋亡,且呈浓度依赖性(P0.05)。与氧化应激抑制剂DPI相似,D4F显著抑制ox-LDL诱导的氧化应激反应,表现为ROS和MDA生成减少(P0.01)、SOD活性增加以及NADPH氧化酶活性降低(P0.05);与PBA和DPI相似,D4F可减轻ox-LDL诱导的巨噬细胞caspase-12活化,且呈浓度依赖性(P0.05);另外,D4F还可抑制TM诱导的caspase-12活化(P0.05)。结论:D4F能够抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡,其机制至少部分是通过减轻氧化应激继而抑制caspase-12活化实现的。     

大蒜素通过抑制caspase-12减轻巨噬源性泡沫细胞凋亡

目的:研究大蒜素对巨噬源性泡沫细胞凋亡和内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)凋亡通路关键分子半胱天冬酶-12(caspase-12)的影响,并探讨可能的分子机制。方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,分别给予大蒜素(12.5、25和50 mg/L)和4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA;4 mmol/L)预处理1 h后,加入氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL;100 mg/L)或衣霉素(tunicamycin,TM;4 mg/L)处理24 h。分别采用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞活力和凋亡情况;采用相应的试剂盒测定细胞内caspase-3和培养液中乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)的活性;采用Western blot技术检测caspase-12的表达变化;油红O染色检测细胞内脂质蓄积;酶比色法测定细胞内总胆固醇含量。结果:与ERS抑制剂PBA相似,大蒜素可减轻oxLDL所致的巨噬细胞损伤,表现为细胞活力增加、LDH漏出减少、细胞凋亡率和caspase-3活性降低(P0.05);ERS诱导剂TM可导致巨噬细胞活力下降,LDH漏出增多及细胞凋亡率升高(P0.05),大蒜素可明显阻断TM的上述作用;大蒜素明显抑制ox-LDL所致的caspase-12活化(P0.05);与TM组相比,大蒜素也可显著抑制TM所诱导的caspase-12活化(P0.05)。另外,大蒜素还可显著抑制ox-LDL所诱导的巨噬细胞内脂质蓄积和泡沫细胞形成(P0.05)。结论:大蒜素可减少ox-LDL所致的巨噬源性泡沫细胞凋亡,其机制可能与抑制caspase-12活化有关。     

糖尿病患者低密度脂蛋白通过激活caspase-12途径诱导小鼠巨噬细胞凋亡

目的:研究糖尿病患者低密度脂蛋白(low density lipoprotein from diabetes mellitus patients,DM-LDL)对小鼠巨噬细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)凋亡途径关键分子caspase-12的影响,以探讨其对鼠巨噬细胞凋亡的诱导作用及机制。方法:体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,给予DM-LDL(25、50和100 mg/L)处理24 h;分别以正常人来源的低密度脂蛋白(normal low density lipoprotein,n-LDL;50 mg/L)和ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM; 4 mg/L)处理24 h的巨噬细胞作为阴性和阳性对照组;另外以ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA; 5 mmol/L)预处理细胞1 h,然后给予DM-LDL(100 mg/L)处理24 h。分别采用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞活力和凋亡情况,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒测定培养液中LDH的活性,Western blot法检测caspase-12蛋白的表达。结果:与TM相似,DM-LDL明显导致细胞活力下降、LDH释放和细胞凋亡率增加(P0.05),同时显著增强caspase-12的活性,在50和100 mg/L浓度时作用更明显(P0.01)。PBA预处理可抑制DM-LDL所诱导的巨噬细胞活力下降、LDH释放和凋亡增加(P0.05),同时抑制DM-LDL所致的caspase-12活化(P0.05)。结论:DM-LDL可导致小鼠巨噬细胞RAW264.7的凋亡,其机制可能与活化caspase-12途径有关。     

蜂胶醇提物通过抑制C/EBP同源蛋白表达减轻氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡

目的:研究蜂胶醇提物(ethanol extract of propolis,EEP)对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用,并探讨可能的分子机制。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),给予EEP(7.5、15和30 mg/L)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA;4 mmol/L)预处理1 h,再加入ox-LDL(100 mg/L)或衣霉素(tunicamycin,TM;4 mg/L)继续培养24 h。分别采用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞活力和凋亡情况;试剂盒测定培养液乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)和细胞内caspase-3活性。分别采用Western blot和real-time PCR技术检测内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)凋亡途径关键蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)和Bcl-2的表达变化。结果:与ERS抑制剂PBA相似,EEP呈剂量依赖性地减轻ox-LDL所诱导的HUVECs损伤,表现为细胞活力增加(P0.01或P0.05),LDH漏出、凋亡率和caspase-3活性降低(P0.05或P0.01),且可抑制ERS诱导剂TM所致的HUVECs活力下降(P0.05),以及LDH漏出、细胞凋亡率和caspase-3活性增加(P0.05或P0.01);与PBA相似,EEP可抑制ox-LDL所诱导的CHOP上调和Bcl-2下调(P0.05或P0.01);另外,与TM组比较,EEP预处理组CHOP蛋白和mRNA表达上调也受到明显抑制(P0.05或P0.01)。结论:EEP可减轻oxLDL所诱导的HUVECs凋亡,其机制可能与抑制CHOP介导的ERS凋亡途径有关。     

沉默CXCL12抑制ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7泡沫化和凋亡

目的探讨CXC趋化因子配体12(CXCL12)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7泡沫化和凋亡的作用及其机制。方法用60 mg/L的ox-LDL诱导RAW264.7泡沫化,记为ox-LDL组,不添加ox-LDL的作为对照(NC)组;将si-con和si-CXCL12转染至RAW264.7细胞中再用60 mg/L的ox-LDL处理,分别记为ox-LDL+si-con组、ox-LDL+si-CXCL12组。油红O染色法检测细胞泡沫化; Western blot检测ABCA-1、SRB-1、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、CXCL12、p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达;流式细胞计量术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测CXCL12 mRNA表达。结果 ox-LDL处理的RAW264.7细胞体积增大,形状变为圆形,胞质中可明显见到大量红色脂滴;ABCA-1和SRB-1表达水平显著升高(P0.05),cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达水平显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著升高(P0.05),CXCL12表达水平显著升高(P0.05),p-p38MAPK表达水平显著升高(P0.05)。沉默CXCL12,大部分细胞内未见红染脂滴,仅少数细胞内有部分脂滴,ABCA-1和SRB-1表达水平显著降低(P0.05),cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达水平显著降低(P0.05),细胞凋亡率显著降低(P0.05),p-p38MAPK表达水平显著降低(P0.05)。结论沉默CXCL12抑制ox-LDL诱导巨噬细胞RAW264.7泡沫化和细胞凋亡,其可能与p38MAPK信号通路有关。     

自噬通过抑制C/EBP同源蛋白表达减轻氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡

目的:研究自噬对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)所致巨噬细胞凋亡的影响,并探讨可能的分子机制。方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,分别给予3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA;3 mmol/L)、雷帕霉素(rapamycin,Rap;1μmol/L)或4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA;4 mmol/L)预处理1 h,再加入ox-LDL(100 mg/L)继续培养12 h。分别采用MTT法和Annexin V-FITC双染法检测细胞活力和凋亡情况;相应试剂盒测定培养液乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)和细胞内caspase-3活性;采用Western blot法检测自噬标志分子beclin-1和内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)及促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达的变化;采用激光共聚焦显微镜观测细胞内微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的变化。结果:ox-LDL处理可显著降低巨噬细胞活力,并增加LDH漏出、凋亡率及caspase-3活性;ox-LDL对细胞的上述损伤作用可被自噬抑制剂3-MA促进而被自噬诱导剂雷帕霉素拮抗。ox-LDL诱导巨噬细胞自噬反应,表现为beclin-1表达上调,LC3颗粒化显著;ox-LDL对自噬的诱导作用可被3-MA抑制而被Rap增强。另外,3-MA可促进ox-LDL所诱导的CHOP进一步上调,而Rap可明显拮抗ox-LDL对CHOP的诱导作用。PBA可显著抑制ox-LDL所诱导的GRP78上调,且明显减轻ox-LDL所诱导的自噬反应,表现为beclin-1表达下调,LC3颗粒化程度减弱。结论:内质网应激介导ox-LDL对巨噬细胞自噬的诱导作用,而一定程度的自噬可通过抑制CHOP表达从而减轻ox-LDL所诱导的巨噬细胞凋亡。     

氧化低密度脂蛋白通过CD36介导的氧化应激诱导巨噬细胞自噬

目的:研究氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)对巨噬细胞自噬的诱导作用,并探讨可能的分子机制。方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,给予抗CD36单克隆抗体(2 mg/L)、二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium,DPI;5μmol/L)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA;3 mmol/L)或雷帕霉素(1μmol/L)预处理1 h,再加入ox-LDL(100 mg/L)继续培养12 h。采用MTT法检测细胞活力,采用相应试剂盒测定培养液乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性以及活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,以评价细胞膜完整性和氧化应激反应。采用免疫印迹技术检测自噬标志分子beclin-1和微管相关蛋白1轻链3-II(microtubule-associated protein 1 light chain 3-II,LC3-II)表达变化。结果:ox-LDL诱导巨噬细胞自噬反应,表现为beclin-1和LC3-II上调;与自噬抑制剂3-MA相似,抗CD36单抗可显著抑制ox-LDL所诱导的LC3-II和beclin-1表达。抗CD36单抗明显抑制ox-LDL所诱导的氧化应激,包括抑制NADPH氧化酶活性和ROS、MDA水平以及升高SOD活性,其作用与NADPH氧化酶抑制剂DPI相似。另外,DPI显著抑制ox-LDL所诱导的beclin-1和LC3-II表达,且ox-LDL所诱导的细胞活力降低和LDH漏出可被3-MA促进并可被自噬诱导剂雷帕霉素拮抗。结论:ox-LDL可诱导巨噬细胞自噬,其机制可能与CD36介导ox-LDL摄取进而触发的氧化应激有关,且一定程度的自噬可减轻ox-LDL所诱导的巨噬细胞损伤。     

ox-LDL对巨噬细胞内皮脂肪酶表达的影响

目的: 探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对鼠源RAW264.7巨噬细胞内皮脂肪酶(EL)表达的影响。方法: 用ox-LDL(0~100 mg/L)孵育RAW264.7细胞24 h使其活化,或者用PDTC (NF-κB抑制剂)预孵育RAW264.7细胞30 min再与ox-LDL(50 mg/L)共同孵育24 h;应用Western blotting 检测EL和NF-κB p65的表达。结果: ox-LDL孵育RAW264.7细胞明显增加EL表达(P<0.05);ox-LDL(50 mg/L)孵育RAW264.7细胞15~30 min可激活NF-κB,用NF-κB 抑制剂PDTC处理后则明显抑制ox-LDL诱导的EL表达增加(P<0.05)。结论: ox-LDL可明显增加RAW264.7细胞EL的表达,可能与NF-κB活化有关。     

对甲苯磺酰维达列汀抑制巨噬细胞焦亡和促进其凋亡的研究

目的:探讨对甲苯磺酰维达列汀(PV)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞焦亡和凋亡的影响,及其可能的抗炎机制。方法:MTT法检测RAW264.7的细胞活力;细胞流式术检测RAW264.7细胞的凋亡;Western blot检测caspase-3和caspase-1蛋白的表达;ELISA检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6浓度;RT-qPCR法检测NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、caspase-11、caspase-3和Bax mRNA的表达。结果:PV显著抑制LPS刺激的巨噬细胞的活力,且呈剂量依赖性,同时促进RAW264.7巨噬细胞的凋亡(P0.01);显著减少巨噬细胞上清液释放TNF-α、IL-1β和IL-6(P0.01);减少caspase-1并增加caspase-3蛋白的表达(P0.01);下调细胞中NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18和caspase-11并上调caspase-3和Bax mRNA的表达(P0.01)。结论:PV可抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞发生细胞焦亡并促进其凋亡,使炎症因子释放减少。     

载脂蛋白A-I模拟肽D-4F对巨噬细胞源性泡沫细胞清道夫受体A1的抑制作用

 目的:研究载脂蛋白A-I模拟肽D-4F对氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）所诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞清道夫受体A1（scavenger receptor A1,SR-A1）的抑制作用及其机制。方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,给予不同浓度的D-4F（12.5、25和50 mg/L）、紊乱模拟肽sD-4F（50 mmol/L）处理1 h或者5 mmol/L内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）抑制剂 4-苯丁酸处理30 min后,再加入ox-LDL （100 mg/L）继续培养12 h。另外培养巨噬细胞给予50 mg/L D-4F 或sD-4F 处理1 h,再加入2 mg/L ERS诱导剂衣霉素（tunicamycin,TM）处理4 h。MTT法检测细胞活力;试剂盒检测细胞内总胆固醇含量;分别采用免疫印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）技术检测SR-A1和ERS标志分子葡萄糖调节蛋白78 （glucose-regulated protein 78,GRP78）蛋白和mRNA表达变化;采用多功能酶标仪检测DiI-ox-LDL摄取情况。结果:D-4F明显减轻ox-LDL所诱导的巨噬细胞损伤和细胞内的胆固醇蓄积。ox-LDL可显著上调SR-A1和GRP78表达,而D-4F对上述变化具有明显抑制作用,且呈浓度依赖性。D-4F显著抑制TM所诱导的SR-A1和GRP78蛋白水平以及巨噬细胞对ox-LDL的摄取。结论: D-4F可通过抑制SR-A1 表达减轻ox-LDL所诱导的巨噬细胞内胆固醇蓄积和细胞损伤,其机制可能与抑制GRP78介导的ERS信号途径有关。     

氢分子通过激活自噬抑制C/EBP同源蛋白介导的巨噬细胞凋亡

目的:研究氢分子对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导巨噬细胞凋亡的影响,并探讨可能的分子机制。方法:体外培养鼠源RAW264.7巨噬细胞,处理前更换为饱和含氢培养基,分别给予3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA;5 mmol/L)和雷帕霉素(rapamycin,Rap;3μmol/L)预处理1 h,再加入ox-LDL(100 mg/L)继续培养24 h。分别采用MTT法和Annexin V-FITC双染法检测细胞活力和凋亡情况,试剂盒测定培养基中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,Western blot法检测自噬标志分子beclin-1和内质网应激相关促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达的变化,激光共聚焦显微镜观测细胞内微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达变化。结果:氢分子显著抑制ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞活力降低、LDH漏出增加、细胞凋亡及CHOP表达上调;ox-LDL诱导巨噬细胞自噬反应,表现为beclin-1表达上调,LC3颗粒化聚集,而氢分子可进一步促进ox-LDL对细胞自噬的诱导作用,且氢分子的这种促进作用可被自噬抑制剂3-MA拮抗,而被自噬诱导剂Rap增强(P0.01)。另外,氢分子对ox-LDL所致的巨噬细胞凋亡、细胞活力降低及CHOP上调的抑制作用也可被3-MA拮抗,而被Rap促进。在体外培养的人源THP-1巨噬细胞中也观察到类似的结果,即氢分子不仅可抑制ox-LDL诱导的细胞凋亡和CHOP上调,也可使beclin-1表达进一步上调(P0.01)。结论:氢分子可通过下调CHOP表达抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡,其上游机制可能是通过激活自噬实现的。     

槲皮素对ox-LDL所致的小鼠巨噬细胞脂质蓄积和过氧化的影响

 目的：研究槲皮素(quercetin,QUE)预处理对氧化低密度脂蛋白 (oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)所致小鼠巨噬细胞脂质蓄积和过氧化的影响,并探讨可能的分子机制。方法：体外培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,给予20、40和80 μmol/L QUE预处理30 min,再加入ox-LDL (100 mg/L)继续培养24 h。采用油红O染色检测细胞内脂质蓄积,测定培养液乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,以评价细胞膜完整性和脂质过氧化程度。分别采用real-time PCR和免疫印迹技术检测清道夫受体CD36 mRNA和蛋白表达变化。结果：QUE (20,40和80 μmol/L)预处理显著抑制ox-LDL所诱导的巨噬细胞内脂质蓄积和泡沫细胞形成,且呈浓度依赖性。ox-LDL组细胞LDH释放增加,而QUE预处理则显著抑制ox-LDL的上述细胞毒性。与ox-LDL组比较,QUE预处理组细胞内ROS含量和培养液中MDA水平明显降低。另外QUE预处理在mRNA和蛋白水平均明显抑制ox-LDL所诱导的CD36表达上调。结论: QUE可减轻ox-LDL所诱导的小鼠巨噬细胞脂质蓄积和过氧化,其机制可能部分是通过下调CD36表达实现的。     

姜黄素抑制ox-LDL诱导HUVECs凋亡

目的研究姜黄素对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的保护作用及其可能机制。方法体外培养HUVECs,实验分为:对照组、ox-LDL组、ox-LDL加内质网应激(ERS)抑制剂PBA组、姜黄素组、ox-LDL加姜黄素组和ox-LDL加姜黄素加PI3K抑制剂LY294002组。CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡;激光共聚焦显微镜观察活化转录因子6(ATF6)转位;Western bolt检测ERS相关蛋白:糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶样内质网激酶(PERK)和肌醇激酶-1(IRE-1)以及相关通路蛋白:LOX-1、AKT和p-AKT的表达。结果与对照组相比,ox-LDL可增加细胞凋亡,提高ERS相关蛋白的表达(P0.01),促使ATF6向核内转位,以及提高LOX-1(P0.01)和降低p-AKT的表达(P0.01);与ox-LDL组相比,PBA可抑制ox-LDL诱导的细胞凋亡(P0.01),姜黄素可抑制ox-LDL诱导的ERS相关蛋白和LOX-1的表达(P0.01),ATF6的核转位,内皮细胞的凋亡(P0.01),同时它还可提高ox-LDL引起的p-AKT表达下调(P0.01);LY294002可部分削弱姜黄素抑制ox-LDL诱导ERS相关蛋白表达的作用(P0.05)。结论姜黄素可降低ox-LDL诱导HUVECs的凋亡,其可能机制是通过抑制LOX-1的表达和激活AKT通路减轻细胞ERS来实现的。     

PLIN2通过调控SREBP2促进RAW264.7巨噬细胞脂质蓄积

目的:探讨脂滴包被蛋白2(PLIN2)是否通过调控固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)影响小鼠RAW264.7巨噬细胞中脂质蓄积.方法:采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理RAW264.7巨噬细胞不同时间(0、6、12、24和48 h),Western blot检测PLIN2和SREBP2蛋白表达水平;过表达或敲...