ClC-3氯通道在二甲双胍抑制鼻咽癌细胞周期进程中的作用

目的:探讨ClC-3氯通道在二甲双胍抑制鼻咽癌细胞周期进程中的作用。方法:采用不同浓度二甲双胍处理低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot法检测ClC-3氯通道蛋白表达,全细胞膜片钳技术检测细胞氯电流。构建高表达ClC-3氯通道蛋白的质粒pEZ-M03-ClC-3转染CNE-2Z细胞,流式细胞术检测ClC-3氯通道对细胞周期分布的影响。结果:5、10和20 mmol/L浓度的二甲双胍均可有效抑制CNE-2Z细胞的活力。10 mmol/L二甲双胍可阻抑CNE-2Z细胞周期于G0/G1期,并抑制CNE-2Z细胞氯电流及ClC-3氯离子通道蛋白的表达。ClC-3氯通道蛋白高表达可逆转二甲双胍对CNE-2Z细胞周期分布的影响。结论:二甲双胍抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞周期进程可能与抑制ClC-3氯通道功能和蛋白表达有关。     

ClC-3氯离子通道对高分化鼻咽癌细胞突起形成的影响

目的：探讨ClC-3氯离子通道在高分化鼻咽癌CNE-1细胞突起形成中的作用。方法：采用免疫荧光技术（Alexa Fluor 488标记抗体）检测CNE-1细胞中ClC-3蛋白的分布；MQAE荧光探针检测细胞内氯离子浓度；吸附式单通道膜片钳技术记录氯离子单通道活动；采用FAM标记的siRNA转染细胞，实验分为对照组、阴性对照（NC） siRNA组和ClC-3 siRNA组；激光共聚焦显微镜观察转染后绿色荧光情况，流式细胞术检测转染效率，Western blot法测ClC-3蛋白的表达，倒置显微镜下观察CNE-1细胞突起形成情况。结果：ClC-3蛋白主要分布于细胞膜和细胞质，且在细胞膜突起形成部位明显聚集；细胞突起处MQAE荧光弱，氯离子浓度较高，而突起根部荧光强，氯离子浓度较低；突起根部记录到翻转电位为4.06 mV的单通道电流，在-120 mV钳制电压下，该通道电导约为78.4pS; siRNA转染细胞48 h后，ClC-3 siRNA组细胞ClC-3蛋白表达量显著降低（P<0.01），且ClC-3 siRNA组细胞无片状伪足伸出，而对照组和NC siRNA组细胞伸出明显的片状伪...     

顺铂通过ROS介导ClC-3上调诱导鼻咽癌细胞凋亡

目的:探讨ClC-3氯通道在顺铂诱导的鼻咽癌细胞凋亡中的作用及机制。方法:将不同浓度的顺铂作用于人低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z细胞);MTT法检测不同浓度的顺铂处理24 h和48 h后细胞活力;采用ClC-3-siRNA下调ClC-3的表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,多功能微孔板检测仪和流式细胞术检测细胞不同状态下的ROS水平。结果:(1)顺铂呈时间和浓度依赖性抑制CNE-2Z细胞生长,氯通道阻断剂DIDS显著抑制顺铂引起的细胞凋亡(P0.01);(2)顺铂促进CNE-2Z细胞ClC-3表达,下调ClC-3蛋白表达后,顺铂诱导的细胞凋亡率下降(P0.05);(3)顺铂促进CNE-2Z细胞ROS产生,用抗氧化剂抑制细胞产生ROS后,顺铂诱导的ClC-3蛋白表达和凋亡被抑制,而下调ClC-3蛋白表达对ROS水平影响不大。结论:顺铂可通过提升CNE-2Z细胞ROS水平,上调氯通道ClC-3蛋白水平,从而诱导细胞凋亡。     

乙醇激活的鼻咽癌细胞氯电流的分子机制

 目的：研究乙醇对低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞氯通道的影响并探讨其分子机制。方法：MTT检测乙醇对细胞生长的影响;全细胞膜片钳技术记录乙醇对氯电流的影响;应用氯通道阻断剂分析该电流的特性;siRNA干扰技术分析乙醇敏感氯通道的分子本质。结果：在等渗灌流液中记录到微弱的背景氯电流,随灌流液中乙醇浓度（0.17~170 mmol/L）的升高,所激活的氯电流呈倒U型曲线状,17 mmol/L的乙醇激活电流达到峰值,电流呈较明显的外向优势,能被高渗液及氯通道阻断剂5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid（NPPB）所阻断;干扰ClC-3氯通道基因表达后乙醇激活的氯电流明显减小。结论：乙醇可能通过激活CNE-2Z细胞的ClC-3氯通道,诱导氯电流的产生。     

蟾蜍灵激活低分化鼻咽癌细胞氯通道

目的: 研究蟾蜍灵(bufalin)对低分化鼻咽癌(CNE-2Z)细胞氯通道的激活作用以及通道的特性。方法: 采用全细胞膜片钳技术记录蟾蜍灵激活CNE-2Z细胞膜电流并分析其电流特征。结果: 细胞外灌流1 μmol/L 的蟾蜍灵可诱发CNE-2Z细胞产生一个氯电流,该电流潜伏期较长,为(12.1 ± 6.4)min, 其翻转电位接近氯离子平衡电位。该电流具有较明显的外向优势,没有明显的时间依赖性失活和电压依赖性失活。氯通道阻断剂他莫昔芬(tamoxifen)可完全抑制该电流, 细胞外灌流高渗液也可完全抑制该电流。结论: 蟾蜍灵可以激活CNE-2Z细胞氯通道产生氯电流,与容积激活性氯电流相比,该电流的潜伏期较长,并且有更明显的外向优势。     

沉默ClC-3氯通道基因对HeLa细胞周期分布的影响

目的:探讨沉默HeLa细胞的ClC-3氯通道基因后细胞周期分布的变化及其作用机制。方法:依照siRNA设计原则构建沉默ClC-3基因的ClC-3 siRNA并转染HeLa细胞;实验分为空白对照组(control组)、转染试剂对照组(Lipo组)、阴性对照组(negative siRNA组)和ClC-3 siRNA组。采用real-time PCR检测ClC-3 siRNA的沉默效率;流式细胞术检测细胞周期分布情况;Western blot检测ClC-3蛋白及相关细胞周期蛋白(cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4、CDK6、P21和P27等表达。结果:CIC-3 siRNA成功沉默HeLa细胞的ClC-3基因。和其它组相比,ClC-3 siRNA组的细胞周期被阻抑在G_0/G_1期。CIC-3 siRNA组的cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达水平明显下降,P21和P27蛋白表达水平明显上升。结论:沉默HeLa细胞ClC-3氯通道基因可影响cyclin D1、CDK4、CDK6、P21和27蛋白的表达水平胆抑HeLa细胞周期停滞在G_0/G_1期。     

氯通道在三氧化二砷诱导鼻咽癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨氯通道在三氧化二砷(arsenic trioxide,As_2O_3)诱导人鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡中的作用。方法:采用流式细胞术检测CNE-2Z细胞经As_2O_3作用24及48 h的凋亡率;应用膜片钳技术记录As_2O_3激活的细胞膜电流,并分析其电流特性;采用流式细胞术检测氯通道阻断剂DIDS对As_2O_3诱导的CNE-2Z细胞凋亡的抑制作用。结果:(1)5μmol/L As_2O_3能够时间依赖性地诱导的CNE-2Z细胞凋亡;(2)CNE-2Z细胞外灌流含5μmol/L As_2O_3的等渗溶液能够激活一个具有外向整流特征的电流,激活的电流无明显的时间及电压依赖性失活,翻转电位接近氯平衡电位;(3)As_2O_3激活的电流能够被氯通道阻断剂DIDS和NPPB完全抑制,细胞外灌流47%的高渗溶液能够完全抑制As_2O_3激活的电流;(4)氯通道阻断剂DIDS能够抑制As_2O_3诱导的CNE-2Z细胞凋亡。结论:As_2O_3可以激活CNE-2Z细胞的容积敏感性氯通道。氯通道在As_2O_3诱导的CNE-2Z凋亡中发挥重要作用。     

氯通道在不同生长周期的鼻咽癌细胞迁移中的作用

目的：研究不同生长周期的鼻咽癌低分化上皮细胞（CNE-2Z）的迁移能力及氯通道在迁移过程中所起的作用。 方法： 运用血清饥饿法、化学药物双阻断法、有丝分裂药物阻断及摇落法分别将CNE-2Z细胞同步化至细胞周期的G1、S、M期，流式细胞仪检测其同步化效果。结合应用迁移小室和图像分析法，测定迁移率。台盼蓝活细胞染色法测定药物的细胞毒性。 结果： 不同生长周期的细胞迁移能力不同，G1期细胞迁移能力最强，随后是M期， S期迁移能力最弱。氯通道阻断剂（ATP、NPPB、tamoxifen）抑制CNE-2Z细胞迁移，但不同的氯通道阻断剂对不同生长周期CNE-2Z细胞迁移的阻滞效应不相同。 结论： CNE-2Z细胞的迁移能力与其所在的生长周期密切相关，氯通道在各期CNE-2Z细胞的迁移过程中起着重要作用。     

卵巢癌顺铂敏感与耐药细胞ClC-3蛋白表达及通道功能的差异

目的:从分子和细胞水平研究卵巢癌顺铂敏感(a2780)及耐药(a2780cp)细胞中ClC-3氯通道蛋白表达及通道功能的差异。方法:MTT法检测人卵巢癌a2780和a2780cp细胞对顺铂敏感性的差异;real-time PCR法检测ClC氯通道家族在a2780和a2780cp细胞中的mRNA表达;Western blot检测ClC-3蛋白的表达;免疫荧光法观察ClC-3蛋白在a2780和a2780cp细胞的分布;全细胞膜片钳技术记录细胞氯电流。结果:(1) a2780和a2780cp细胞对顺铂的敏感性存在差异,其IC_(50)值分别为5μmol/L和20μmol/L(P0.01);(2)对ClC氯通道家族mRNA表达的检测结果显示,a2780和a2780cp细胞主要表达ClC-3,且在a2780cp细胞中ClC-3 mRNA表达显著减少(P0.01);(3)在蛋白水平上,与a2780细胞相比,a2780cp细胞的ClC-3蛋白表达量显著降低(P0.01);(4)免疫荧光显示ClC-3在a2780细胞中主要分布在胞膜上,而在a2780cp细胞中则主要表达在胞质内;(5)顺铂能激活a2780细胞的氯通道,产生ClC-3介导的氯电流,但在a2780cp细胞中则不能;(6)ClC-3 siRNA处理a2780细胞后,顺铂诱导的氯电流则不再出现。结论:ClC-3氯通道在顺铂敏感和耐药的卵巢癌细胞蛋白分布、表达和功能上存在差异,可能是引起顺铂耐药的潜在机制之一。     

敲低lncRNA LINC01296调节PD-L1抑制鼻咽癌细胞免疫逃逸的机制研究

目的 研究敲低长链非编码RNA(lncRNA)LINC01296调节程序性死亡配体-1(PD-L1)抑制鼻咽癌细胞免疫逃逸的机制。方法 分离培养人外周血淋巴细胞后与人鼻咽癌细胞CNE-2Z共培养,同时取C57BL/6小鼠皮下注射CNE-2Z细胞构建鼻咽癌移植瘤模型24只,均随机分为对照组、lncRNA LINC01296敲低组[转染lncRNA LINC01296小干扰RNA(siRNA)]、阴性对照组(转染lncRNA LINC01296 siRNA阴性对照和空载质粒)、lncRNA LINC01296敲低+PD-L1过表达组(转染lncRNA LINC01296 siRNA和PD-L1过表达质粒),分组转染后,流式细胞术检测人外周血淋巴细胞中活化CD8⁺T细胞比例;细胞计数试剂盒-8法检测人外周血淋巴细胞对CNE-2Z细胞杀伤率;测量移植瘤小鼠肿瘤体积;免疫荧光染色检测移植瘤小鼠肿瘤组织CD8和PD-L1阳性表达;实时荧光PCR实验检测CNE-2Z细胞和肿瘤组织lncRNA LINC01296、PD-L1信使RNA(mRNA)表达;蛋白印迹实验检测CNE-2Z...     

ClC-3氯通道蛋白磷酸化及其功能的研究进展

细胞容积调节广泛参与细胞的各种生理病理过程,如上皮细胞物质转运、物质代谢、细胞兴奋性、激素释放、细胞迁移、细胞增殖及细胞坏死凋亡等[1, 2].在低渗环境刺激下,容积激活性氯通道参与细胞容积调节,对维持细胞容积起着重要调节作用.     

氯通道ClC-2融合蛋白的原核表达及体外磷酸化

目的：检测ClC-2是否能被促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化，为进一步研究其在细胞增殖、分化过程中的调控机制提供基础。方法：从含有家兔ClC-2cDNA的质粒pSPORT1中PCR扩增ClC-2胞浆内的羧基端DNA编码序列，构建重组载体pGEX-4T-1／ClC-2CT；重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株；经异丙基β-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导后，通过Gluthathion Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白；并行融合蛋白的体外磷酸化实验。结果：酶切、测序鉴定重组载体pGEX-4T-1／ClC-2CT构建正确，并纯化得到GST／ClC-2CT融合蛋白。而且该融合蛋白能被MAPK磷酸化，而GST不能被MAPK磷酸化。结论：氯通道ClC-2能被MAPK磷酸化。     

ClC-3在人胶质瘤中的表达及分布

目的探讨ClC-3在人脑胶质瘤中的表达及其生物学意义。方法应用免疫组织化学染色技术检测24例人胶质瘤以及4例脑转移癌手术标本中ClC-3蛋白的表达;RT-PCR检测ClC-3蛋白表达阳性的手术标本中其mRNA表达。结果4例正常脑组织ClC-3蛋白的表达为阴性;而蛋白表达阳性的19例胶质瘤及4例脑转移癌中,ClC-3主要位于瘤细胞和微血管内皮细胞的胞浆或胞膜上。蛋白表达阳性的手术标本中16例胶质瘤和4例脑转移癌检测到ClC-3mRNA的表达。少突胶质细胞瘤Ⅲ级中ClC-3的mRNA和蛋白表达明显高于其Ⅱ级。结论ClC-3在人胶质瘤及脑转移癌组织中普遍表达,并且可能与少突胶质细胞瘤病理分级相关。     

ClC-3在人胶质瘤中的表达及分布

目的：探讨ClC-3在人脑胶质瘤中的表达及其生物学意义。 方法： 应用免疫组织化学染色技术检测24例人胶质瘤以及4例脑转移癌手术标本中ClC-3蛋白的表达；RT-PCR检测ClC-3蛋白表达阳性的手术标本中其mRNA表达。 结果： 4例正常脑组织ClC-3蛋白的表达为阴性；而蛋白表达阳性的19例胶质瘤及4例脑转移癌中，ClC-3主要位于瘤细胞和微血管内皮细胞的胞浆或胞膜上。蛋白表达阳性的手术标本中16例胶质瘤和4例脑转移癌检测到ClC-3 mRNA的表达。少突胶质细胞瘤Ⅲ级中ClC-3的mRNA和蛋白表达明显高于其Ⅱ级。 结论： ClC-3在人胶质瘤及脑转移癌组织中普遍表达，并且可能与少突胶质细胞瘤病理分级相关。