PKCα参与高糖调节大鼠肾小管上皮细胞骨形态发生蛋白-7的表达

目的观察蛋白激酶Cα(PKCα)对糖尿病(DM)及高糖培养的大鼠肾小管上皮细胞骨形态发生蛋白-7(BMP-7)表达的影响。方法将大鼠分为对照组(control)和糖尿病组(DM),每组8只,饲养12周处死动物;将体外培养的原代肾小管上皮细胞,随机分为对照组(control)、高糖组(HG)、高糖+PKCα特异性抑制剂G6976 1μmol/L组(HG+G6976)和高渗组(HM),处理72 h后收集肾小管上皮贴壁细胞,免疫组化及免疫细胞化学观察肾小管上皮细胞BMP-7、PKCα、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和纤维连接蛋白(FN)蛋白表达;Western blot检测BMP-7蛋白的表达;RTPCR法检测BMP-7、PKCα和FN mRNA水平。结果对照组大鼠肾小管上皮细胞BMP-7蛋白及mRNA高表达,DM组或HG组BMP-7的表达明显低于对照组(P0.05),PKCα、AngⅡ和FN的表达较对照组明显增多(P0.05),BMP-7蛋白与PKCα呈显著负相关,HG+G6976组BMP-7蛋白及mRNA表达则较HG组增多(P0.05),AngⅡ和FN则较HG组减少(P0.05)。结论 PKCα可能参与高糖调节大鼠肾小管上皮细胞BMP-7的表达。     

Vasostatin-1对缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的影响

目的探讨血管生成抑制因子vasostatin-1(VS-1)对缺氧复氧肾小管上皮细胞的炎性损伤作用及机制。方法采用缺氧复氧方式制造肾小管上皮细胞炎性损伤。构建慢病毒载体并以脂质体法将shVS-1转染NRK-52E细胞。ELISA法检测细胞中LDH和IL-1β含量;Western blot检测细胞中VS-1、pro-caspase-1和caspase-1蛋白表达。结果与对照组相比,缺氧复氧组细胞LDH和IL-1β含量显著升高,且VS-1蛋白表达显著升高。成功构建沉默VS-1的慢病毒载体,且转染缺氧复氧NRK-52E细胞,可降低细胞中LDH和IL-1β含量、降低caspase-1蛋白表达,过表达VS-1则具有相反的功能。结论沉默VS-1可保护缺氧复氧肾小管上皮细胞的炎性损伤,可能与下调caspase-1有关,可为急性肾损伤的临床治疗提供依据。     

Snail1/IGF-1信号通路介导高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT

目的:观察高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E中锌指转录因子Snail1和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的表达变化,并初步探讨Snail1与IGF-1在糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)过程中的关系。方法:高糖培养大鼠近端肾小管上皮细胞系NRK-52E 72 h后,给予Snail1 siRNA和IGF-1 siRNA处理,分为高糖组、non-targeting(NT)siRNA组、Snail1 RNAi组和IGF-1 RNAi组,并设置对照组。于转染后48和72 h两个时点收获细胞。分别用实时荧光定量PCR检测细胞Snail1、IGF-1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的mRNA表达,用免疫荧光方法检测各蛋白的表达。结果:高糖诱导NRK-52E细胞E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显降低(P0.01),FN的mRNA和蛋白表达明显升高(P0.01);同时,Snail1和IGF-1的mRNA和蛋白表达也明显升高(P0.01)。Snail1 RNAi组与高糖组比较,细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显升高(P0.01),FN、Snail1和IGF-1的mRNA和蛋白表达明显降低(P0.01),Snail1的mRNA表达减少62.8%。与高糖组比较,IGF-1 RNAi组细胞IGF-1的mRNA表达减少61.1%,E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显升高(P0.01),FN的mRNA和蛋白表达明显降低(P0.01)。NT组E-cadherin、FN、Snail1及IGF-1的mRNA和蛋白表达与高糖组比较差异无统计学显著性。Pearson相关性分析显示,NRK-52E细胞中Snail1与IGF-1蛋白的表达呈显著正相关(r=0.852,P0.01)。结论:Snail1及IGF-1的mRNA和蛋白在高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT过程中表达升高,且沉默Snail1基因,IGF-1表达随之减少,提示Snail1/IGF-1可能促进DKD时肾小管上皮细胞EMT。     

反义RNA对培养的肾小管上皮

目的:探讨骨调素(OPN)反义RNA对培养的肾小管上皮细胞骨调素表达的影响。方法:脂质体介导将表达OPN反义RNA的逆转录病毒重组载体转染大鼠肾小管上皮细胞系NRK52E细胞,建立稳定表达OPN反义RNA的肾小管上皮细胞克隆,以转染了表达OPN顺义RNA和空白逆转录病毒载体的肾小管上皮细胞克隆为对照,以表皮生长因子(EGF)为刺激剂,通过核酸酶保护分析(RPA),WesternBlot,ELISA和OPN生物活性分析检测上述克隆细胞的OPN表达。结果:OPN反义RNA仅被反义克隆细胞表达,反义克隆、顺义克隆和空白克隆细胞均有OPNmRNA的表达,EGF能增加它们OPNmRNA的表达水平,但不增加反义RNA或顺义RNA的表达水平;加或不加EGF的反义克隆细胞和不加EGF的空白克隆细胞无OPN蛋白的表达,加或不加EGF的顺义克隆细胞和加EGF的空白克隆细胞有OPN蛋白的表达。结论:OPN反义RNA能抑制肾小管上皮细胞OPNmRNA的翻译而抑制OPN蛋白的表达,但不抑制OPNmRNA的转录。     

Gli2 对高糖条件下肾小管上皮细胞凋亡及ROS 水平影响

目的:探讨胶质瘤相关癌基因2(Gli2)对高糖条件下的肾小管上皮细胞凋亡及活性氧(ROS)水平影响。方 法:用肾小管上皮细胞NRK鄄52E 为研究对象,分别转染Gli2 过表达载体和对照载体,同时用不转染的细胞作为对照,RT鄄PCR 和Western blot 检测Gli2 水平,用高糖和低糖细胞培养液培养不转染的对照细胞,同时以高糖培养液培养转染Gli2 过表达载 体的细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针法检测ROS 含量,黄嘌呤氧化酶法检测超氧 化物歧化酶(SOD)含量,Western blot 检测Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、Ptch 相关跨膜蛋白Smoothened(Smo)水平。结果:NRK-52E 细胞转染Gli2 过表达载体后的Gli2 mRNA 和蛋白水 平均明显高于对照细胞(P<0.01),而转染对照载体后的NRK鄄52E 细胞中Gli2 mRNA 和蛋白水平与对照细胞相比没有差异 (P>0.05)。高糖培养后的不做转染的NRK鄄52E 细胞凋亡率升高,ROS 含量升高,SOD 含量下降,细胞中Bax、Cleaved Caspase- 3 水平升高,Smo 水平下降,与对照细胞相比差异具有统计学意义(P<0.01)。而过表达Gli2 后的NRK-52E 细胞经高糖培养 后,细胞凋亡率下降,ROS 含量降低,SOD 含量升高,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3 水平下降,Smo 水平升高,与单纯高糖培养 的NRK-52E 细胞相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:高糖诱导肾小管上皮细胞凋亡和氧化损伤,Gli2 可以降低高糖 诱导的肾小管上皮细胞凋亡,减轻氧化损伤。     

PPARγ通过PTEN调控AKT/FAK通路影响高糖条件下肾小管上皮细胞转分化

目的:探讨在高糖培养的肾小管上皮细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)对PTEN/AKT/FAK通路的调控机制及对肾小管上皮细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法:以高糖培养的肾小管上皮细胞NRK52E为研究对象,采用过表达及shRNA干扰技术分别上调和下调肾小管上皮细胞中PPARγ的表达,并培养48 h,应用细胞免疫荧光、Western blot和RT-qPCR方法检测PTEN及EMT相关蛋白的表达变化;然后,在过表达及敲减PTEN的情况下,分别给予PPARγ抑制剂GW9662及激动剂罗格列酮干预,进一步观察PPARγ对AKT/FAK通路的调节是否通过PTEN实现的。结果:过表达PPARγ组PPARγ和PTEN的mRNA及蛋白表达增加,E-cadherin的表达明显上调,而vimentin和α-SMA蛋白表达显著下调(P0.05);PPARγ敲减组PPARγ及PTEN的mRNA及蛋白表达水平明显降低,E-cadherin的表达也明显下调,而vimentin和α-SMA蛋白表达显著升高(P0.05)。GW9662干预组PTEN的表达减少,而p-AKT(Thr308)、FAK及p-FAK(Tyr397)蛋白水平均明显升高(P0.05);与GW9662组相比,GW9662+过表达PTEN组PTEN表达明显增加,并伴随p-AKT(Thr308)、FAK及p-FAK(Tyr397)蛋白水平的降低(P0.05);罗格列酮干预组PTEN的表达增多,而p-AKT(Thr308)、FAK和p-FAK(Tyr397)蛋白水平降低(P0.05);与罗格列酮组相比,罗格列酮+PTEN shRNA组PTEN的表达减少,相应的p-AKT(Thr308)、FAK和p-FAK(Tyr397)蛋白水平升高(P0.05)。结论:PPARγ能调节肾小管上皮细胞PTEN的mRNA及蛋白表达水平,并影响肾小管上皮细胞的EMT;PPARγ对AKT及FAK通路的调节及对细胞EMT的影响主要是通过PTEN实现的。     

化合物21(C21)抑制晚期糖基化终产物刺激引起的大鼠肾小管上皮细胞的细胞因子分泌

目的 研究2型血管紧张素Ⅱ受体(AT2R)激动剂化合物21(C21)对晚期糖基化终产物(AGE)刺激的NRK-52E大鼠近端肾小管上皮细胞分泌的细胞因子的影响及潜在机制。方法 培养NRK-52E细胞，分为正常对照组和(25、 50、 100、 200)mg/LAGE-牛血清白蛋白(BSA)刺激组。培养48 h后收集细胞，采用实时定量PCR检测NRK-52E细胞白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的表达。间接ELISA检测细胞培养上清液中的IL-6、 TNF-α蛋白水平。然后先用25 mg/L AGE-BSA刺激NRK-52E细胞48 h后分别给予(0.01、 0.05、 0.1)mmol/L C21分别处理24 h,采用实时定量PCR检测细胞蛋白激酶C(PKC)、核因子κB p65(NF-κB p65)及转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA的表达，Western blot法检测细胞中PKC、 NF-κB p65、 TGF-β1蛋白表达。结果 不同剂量的AGE-BSA刺激NRK-52E细胞均可明显增加IL-6、 TNF-α的mRNA表达，而以25 mg/L ...     

TLR4/NLRP3炎症复合体介导对比剂诱导的肾小管上皮细胞炎症和损伤

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)/Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症复合体是否介导了对比剂(CM)引起的肾小管上皮细胞炎症和损伤。方法:本研究运用碘普罗胺作用于大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E建立损伤模型。应用CCK-8法测定细胞存活率;Western blot测定TLR4、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1和cleaved caspase-3的蛋白水平;ELISA法检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18的水平;Hoechst 33258核染色法检测凋亡率;JC-1染色法测定线粒体膜电位。用小干扰RNA沉默NLRP3表达。结果:CM可降低NRK-52E细胞的存活率并上调cleaved caspase-3的蛋白水平(P0.05);此外,CM可上调细胞TLR4/NLRP3炎症复合体的表达并促进炎症因子IL-1β和IL-18的分泌(P0.05)。沉默NLRP3可以对抗CM诱导的炎症因子分泌;TLR4抑制剂TAK-242及沉默NLRP3能减轻CM引起的细胞凋亡和线粒体功能损伤。结论:TLR4/NLRP3炎症复合体参与了CM致急性肾损伤的发病机制,并介导了CM诱导的肾小管上皮细胞损伤和炎症。     

重组大鼠肝再生增强因子抑制庆大霉素诱导的肾小管上皮细胞凋亡的机制研究

目的： 探讨重组大鼠肝再生增强因子（rrALR）在体外对庆大霉素（GM）诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E细胞）凋亡的影响及其作用机制。方法: 将NRK-52E细胞分为正常对照组、庆大霉素处理组（GM 1.6 g/L）和rrALR干预组（分别加入GM 和不同浓度的rrALR）,培养细胞24 h、48 h。吖啶橙/溴乙啶（AO/EB）染色、DNA琼脂糖凝胶电泳及Annexin V/PI双染流式细胞术检测各组细胞的凋亡状态。Western blotting和RT-PCR检测各组细胞不同时点Bcl-2和Bax蛋白、mRNA的表达。结果: (1)rrALR对庆大霉素诱导的NRK-52E细胞凋亡具有抑制作用（P＜0．05）。 (2)rrALR能够呈剂量依赖方式增加细胞Bcl-2蛋白及核酸的表达（P＜0．05）、降低细胞Bax蛋白及核酸的表达(P＜0．05),使Bcl-2/Bax比值升高（P＜0．05）。结论: rrALR可以通过调节Bcl-2家族Bax和Bcl-2蛋白及核酸的表达水平,抑制庆大霉素诱导的肾小管上皮细胞凋亡,减轻肾毒性药物对小管上皮细胞的损伤。     

白细胞介素1β诱导肾小管上皮细胞转分化及其对细胞骨架的影响

目的:观察白细胞介素1β(IL-1β)诱导肾小管上皮细胞转分化及其对细胞骨架的调节作用。方法:选择永生化的大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E,经体外培养后以IL-1β(30μg/L)分别诱导3天及6天,观察细胞形态;RT-PCR半定量检测细胞α-平滑肌动蛋白(α-SMA)和细胞骨架成分β-actin、α-tubulin的mRNA表达;免疫荧光染色观察α-SMA蛋白表达及骨架蛋白β-actin、α-tubulin在细胞内的分布及排列。结果:培养的NRK52E细胞经IL-1β体外诱导3天及6天后,细胞中α-SMA mRNA及蛋白表达水平与相应的对照组细胞比较明显增多(P0.001),提示NRK52E上皮细胞出现了表型转化,此时培养细胞的形态也发生了改变,由典型的多边铺路石样变为成纤维细胞样,并有多个突起,细胞骨架蛋白β-actin mRNA的表达也稍有增多(P0.05);其蛋白的分布排列也发生了改变,由胞膜转移至核周及胞浆,形成束状纤维样结构。但IL-1β诱导组细胞的另一个骨架蛋白α-tubulin mRNA表达和分布与对照组比较无明显不同。结论:IL-1β能够诱导体外培养的NRK52E细胞转分化,此过程中细胞形态变为成纤维细胞样,多突起;骨架蛋白β-actin也表达增加,并出现了骨架重建;而α-tubulin在此过程中则没有明显变化。     

NaDC3过表达对人肾小管细胞能量代谢和活性氧产生的影响

目的:研究三羧酸循环中间代谢产物转运蛋白-高亲和力钠依赖性二羧酸转运蛋白(NaDC3)基因过表达对人肾小管细胞能量代谢与活性氧(ROS)产生的影响。方法:用重组NaDC3逆转录病毒载体感染人肾小管上皮细胞HKC。用Western blotting检测细胞中外源性NaDC3蛋白的表达水平。通过液体闪烁法测定细胞内同位素[3H]标记琥珀酸(NaDC3的转运底物)的浓度。分别用Clark电极法和反相高压液相法测定细胞内氧耗量和ATP含量。分别用荧光探针JC-1和CM-H2DCFDA处理细胞后通过激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位和细胞内ROS含量。结果:Western blotting结果显示导入外源NaDC3基因后可使细胞内NaDC3蛋白的表达水平明显增加。转运实验显示NaDC3病毒感染细胞内的[3H]-琥珀酸水平明显高于未感染和对照载体感染细胞。NaDC3病毒感染细胞中的氧耗量和ATP含量明显高于未感染和对照载体感染细胞。激光共聚焦检测显示,与未感染和对照载体感染细胞相比,NaDC3感染细胞的线粒体膜电位和ROS水平明显增加。结论:NaDC3过表达可通过转运过多的三羧酸循环中间代谢产物进入细胞内而加快肾小管上皮细胞能量代谢的速率、增加细胞内ROS的产生水平。     

siRNA干扰SLC7a8对NRK-52E细胞摄取左旋多巴的影响

目的:通过RNA干扰(RNAi)技术选择性下调高血压相关基因SLC7a8的表达,探讨对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)摄取左旋多巴的影响。方法:设计并合成3个针对大鼠SLC7a8基因的特异性siRNA片段(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),以含非特异性编码序列的siRNA-con为对照。将上述3个片段及阴性对照通过阳离子脂质体法转染至NRK-52E内,通过流式细胞仪估算转染效率后经RT-PCR初步筛选高效率干扰片段,用Western blotting检测蛋白水平的干扰效率,采用紫外分光光度法检测空白对照组(blank)、siRNA-con转染组和SLC7a8基因特异性沉默组不同时点(6、12、24、36、48、60、72、120min)NRK-52E内左旋多巴的浓度。结果:流式细胞仪测定siRNA转染NRK-52E效率为94%,RT-PCR初步筛选结果显示siRNA-1、3干扰效率较高,Western blotting检测显示siRNA-3组在蛋白水平的干扰效率较高,而对照组siRNA-con与空白对照组(blank)的SLC7a8表达差异不明显。通过紫外分光光度法检测NRK-52E对左旋多巴的吸收结果显示干扰组不同时点(6、12、24、36、48、60、72、120min)细胞内左旋多巴浓度均低于siRNA-con转染组和空白对照组;对照组siRNA-con与空白对照组相比则无明显差异。结论:RNA干扰技术能选择性下调大鼠肾小管上皮细胞SLC7a8的表达水平;SLC7a8基因特异沉默后NRK-52E对左旋多巴的摄取在各个不同时点(6、12、24、36、48、60、72、120min)均降低。     

槲皮素对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞细胞外基质积聚的影响

目的：观察转化生长因子（TGF）-β₁对大鼠肾小管上皮细胞MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ表达的影响，并探讨槲皮素的作用。方法:以大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）为研究对象，采用TGF-β₁(10 μg/L)刺激，部分实验中培养的细胞在刺激前用槲皮素(50 μmol/L)预处理90 min。MCP-1及COL-Ⅰ mRNA的表达采用RT-PCR检测。PAI-1mRNA和蛋白的表达分别采用RT-PCR和Western blotting 法检测。结果:NRK-52E 细胞在TGF-β₁刺激后MCP-1 mRNA显著上调，在2 h开始升高，8 h达高峰，呈时间依赖性；PAI-1 mRNA和蛋白的表达也显著增加；同时，TGF-β₁还显著上调Col-ⅠmRNA的表达，24 h为正常的2.4倍（P<0.05）。槲皮素预处理后，TGF-β₁诱导的MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ的上调表达均受到明显抑制（P<0.05）。结论:槲皮素能够通过抑制MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ的表达而部分逆转TGF-β₁诱导的肾小管上皮细胞细胞外基质的积聚，这可能有利于延缓肾间质纤维化的发生和发展。     

马兜铃酸诱导大鼠肾小管上皮细胞表型转化和胶原累积及垂盆草提取物的作用

 目的：研究垂盆草（SSB）提取物对马兜铃酸（AA）诱导的肾小管上皮细胞表型转化和胶原累积的作用,并初步探讨可能的分子机制。方法：将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）分为：(1) 溶剂对照组：未加入SSB和AA;(2) AA损伤组：只加AA,浓度为1~100 mg/L;(3) SSB提取物干预组：在加入10 mg/L AA基础上,同时加入SSB提取物（10~2 000 mg/L）。细胞培养24 h后,酶联免疫吸附试验检测转化生长因子β1(TGF-β1)含量;细胞免疫荧光染色检测肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、上皮细胞标志物E-cadherin和基质成分III型胶原的表达;实时荧光定量PCR检测α-SMA、E-cadherin、骨形成蛋白7（BMP-7）和I型胶原mRNA的表达。结果：AA可诱导NRK-52E细胞呈现纤维化样改变;1 mg/L和10 mg/L AA不仅可增加基质成分I型和III型胶原的表达量,同时也可促进α-SMA表达,抑制E-cadherin的表达。用SSB提取物干预后,AA所致的纤维化改变明显减轻;SSB提取物下调了α-SMA、I型和III型胶原的表达,并且促进E-cadherin和BMP-7的表达。此外,SSB提取物也抑制TGF-β1的分泌,并呈浓度依赖性。结论：应用SSB提取物干预可明显降低AA所致的肾纤维化效应,可能的机制为SSB提取物降低TGF-β1的表达,抑制小管上皮细胞的表型转化,进而抑制胶原的累积。     

环杷明对马兜铃酸诱导的肾上皮细胞表型转化及Hedgehog通路的影响

目的:探讨环杷明干预Hedgehog(HH)信号对马兜铃酸(AA)致肾小管上皮细胞表型转化和基质累积的影响。方法:根据干预措施将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E分为溶剂对照组、AA损伤组(分别用终浓度为1、5和10 mg/L的AA处理细胞)和环杷明干预组(10 mg/L AA基础上加入1、5和10μmol/L环杷明)。细胞培养24 h后,用real-time PCR检测HH信号关键分子Ptch1和Smo、表型转化相关分子α-SMA和E-cadherin、ZO-1、BMP-7和基质成分I型和III型胶原mRNA的表达;ELISA法检测Shh和TGF-β1的含量;细胞免疫荧光染色检测Ptch1、Smo、E-cadherin、α-SMA和III型胶原蛋白表达。结果:AA不仅增加了TGF-β1、α-SMA和III型胶原的表达,降低了E-cadherin和ZO-1的表达,而且诱导了Shh和Smo mRNA表达的升高和Ptch1 mRNA表达的下降,提示AA促进小管上皮细胞表型转化和胶原累积,同时也激活了HH信号通路。环杷明干预AA作用后,Smo mRNA或蛋白表达下调,Ptch1 mRNA表达升高,这说明环杷明抑制了AA诱导的HH信号通路的活化。此外,环杷明也降低TGF-β1、α-SMA、I型和III型胶原的表达,提高BMP-7、ZO-1和E-cadherin的表达,这提示环杷明抑制了AA所致的上皮细胞的表型转化和基质累积。结论:环杷明可抑制AA所致的肾小管上皮细胞表型转化和基质累积,可能是通过靶向抑制HH信号的活化来实现的。     

BMP-7对高糖环境下肾小管上皮细胞Id2和E2A蛋白表达的影响

 目的: 通过观察高糖环境下给予外源性骨形态发生蛋白-7(BMP-7)对肾小管上皮细胞(NRK-52E)表达分化抑制因子2(Id2)和转录因子E2A的影响,探讨BMP-7减轻高糖诱导的肾小管纤维化病变的可能机制。方法: 将体外培养的肾小管上皮细胞NRK-52E分为3组:对照(control)组、高糖(HG)组和不同浓度BMP-7(10 μg/L和20 μg/L)干预组,HG组和干预组分别设12 h、24 h和48 h 3个时点。Western blot方法检测Id2、E2A、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)蛋白的表达,real-time PCR方法检测Id2 mRNA的表达。结果: 与control组相比,HG组Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平明显下调,E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平明显上调(P < 0.05);与HG组相比,20 μg/L BMP-7干预组Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平均较同时点显著上调,E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平显著下调(P < 0.05)。相关性分析结果显示,Id2蛋白与E2A蛋白表达呈显著负相关(P < 0.05)。结论: BMP-7可阻断高糖诱导的肾小管上皮细胞的纤维化,其机制可能与促进Id2蛋白并抑制E2A蛋白的表达有关。     

氧化苦参碱抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮-间充质转化及其机制研究

 目的：探讨氧化苦参碱(OM)对高糖诱导的大鼠肾小管上皮-间充质转化（EMT）的抑制作用及其可能机制。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮NRK52E细胞,随机分为：对照组、高糖组、高糖+OM不同浓度组和高糖+0.50 g/L OM动态观察组。采用real-time PCR和Western blotting方法检测转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad7、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏素（E-cadherin）mRNA和蛋白的表达。结果：（1）与对照组相比,高糖组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达水平均进行性增高,Smad7蛋白表达进行性降低,E-cadherin mRNA和蛋白表达进行性降低,呈时间依赖性（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达进行性增高（P＜0.05）;（2）与高糖组相比,高糖+ OM不同浓度组随OM剂量增加,TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达均逐渐降低,Smad7蛋白表达水平逐渐增高,E-cadherin mRNA和蛋白表达水平逐渐增高,且呈剂量依赖性（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达无明显差异;（3）与高糖组相比,高糖+0.50 g/L OM动态观察组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达持续降低,Smad7蛋白表达持续增高,E-cadherin mRNA和蛋白表达持续增高（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达无明显差异。结论：OM可抑制高糖诱导的NRK52E细胞发生EMT,其机制可能与OM下调TGF-β1表达及上调Smad7蛋白表达,进而抑制TGF-β1/Smads信号通路的致纤维化效应有关。     

外源性野生型P16ink4a基因在兔损伤动脉壁的表达

目的:研究转染外源性野生型P16^ink4a基因逆转录病毒重组质粒对兔颈总动脉壁损伤后再狭窄形成的抑制作用。方法:构建野生型P16^ink4a基因的复制缺陷型逆转录病毒重组质粒,经包装细胞包装后取得高滴度病毒液,并以此病毒转染损伤后即刻的兔颈总动脉。应用膜杂交和原位杂交技术检测损伤动脉壁的外源性P16^ink4a基因表达,并通过病理学等方法观察动脉内膜增生情况及管腔狭窄程度。结果:逆转录病毒重组质粒可有效地将外源基因P16^ink4a转入兔体内动脉壁并在其中表达。P16^ink4a基因转染组动物的损伤动脉壁内膜平滑肌细胞增生(11.80±3.54vs25.20±5.12,P＜0.05)和管腔狭窄程度(50.2%±9.60%vs82.2%±12.83%,P＜0.05)均显著低于对照组。结论:体内转染外源性野生型抑癌基因P16^ink4a可有效抑制动脉损伤后再狭窄的形成。