胆汁中外泌体及外泌体RNA提取方法比较

目的比较超速离心法和聚合沉淀法分离胆汁外泌体及外泌体RNA的差异。方法收集2017年6月至2018年12月在南京医科大学第二附属医院消化内科行内窥镜逆行胆囊-胰腺造影术(ERCP)患者术中胆汁,分别采用超速离心法和聚合沉淀法对胆汁进行分离。采用透射电镜法观察提取外泌体的形态;采用粒径分析所得粒子的直径;采用流式细胞术检测表面标记物CD63和CD81的表达差异;Trizol法提取RNA,分析RNA水平及A260/A280;采用实时荧光定量(RT-PCR)检测4种miRNA表达,分析两种方法所得平均CT值的差异。结果超速离心法和聚合沉淀法所得外泌体形态和粒径分布无明显差异;流式细胞术分析显示,超速离心法所得外泌体CD63和CD81阳性率较高。RNA分析显示,聚合沉淀法提取RNA水平较高,检测的miR-671-5p、miR-126-3p、miR-210-3p、miR-483-5p平均CT值较小。结论超速离心法和聚合沉淀法均可提取出一定数量的外泌体,其中超速离心法得到的RNA较纯,而聚合沉淀法得到的RNA水平较高,可用于稀缺标本的检测。因此,进一步寻找高敏感、高特异、经济便捷的方法仍然十分必要。     

三种方法提取血清外泌体的比较研究

目的　比较超速离心法、沉淀法和尺寸排阻色谱法提取血清外泌体的得率和纯度。方法　选取8例健康体检受试者血清,用三种方法提取外泌体,采用纳米流式检测仪、透射电子显微镜和Pierce BCA 蛋白检测试剂盒分别检测外泌体颗粒数、粒径分布、形态特征和蛋白浓度;分析外泌体颗粒数。外泌体颗粒数和蛋白总量比值、Triton X-100处理前后颗粒数变化来评估外泌体提取的得率和纯度。结果　超速离心法、沉淀法和尺寸排阻色谱法提取外泌体粒径均分布在40~150 nm;透射电子显微镜下均能观察到呈明显茶托状的双层膜结构,但沉淀法提取的外泌体混有聚乙二醇聚合物及蛋白大颗粒;蛋白质印迹结果显示三种方法提取的外泌体均表达外泌体标记蛋白;沉淀法提取的血清外泌体颗粒数高于超速离心法和尺寸排阻色谱法[(1.11±0.07)×1011 particley/ml vs (2.54±0.04)×1010particley/ml, (7.51±0.89)×1010particley/ml],差异均有统计学意义（P<0.05）,尺寸排阻色谱法提取外泌体颗粒数高于超速离心法（P<0.001） ;尺寸排阻色谱法提取外泌体纯度高于超速离心法和沉淀法[(5.66±0.45)×107particles/μg vs (7.65±0.42)×106 particles/μg, (3.18±0.45)×106 particles/μg],超速离心法提取外泌体纯度高于沉淀法,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论　超速离心法、沉淀法和尺寸排阻色谱法均能提取出血清外泌体,超速离心法步骤繁琐,耗时较长,提取外泌体得率与纯度较低;沉淀法操作简单,耗时短,提取外泌体得率最高,但外泌体纯度最低;尺寸排阻色谱法操作简单,耗时短,提取外泌体的纯度最高;相比而言,尺寸排阻色谱法显然优于超速离心法和沉淀法。     

肝星状细胞来源外泌体不同提取方法的比较

目的采用超速离心法(UC)和优化后的排阻超滤组合法提取肝星状细胞(HSC)来源外泌体,比较两种提取方法所得外泌体的纯度、浓度和总蛋白量。方法分别用UC法和优化后的排阻超滤组合法提取HSC来源外泌体。使用透射电镜观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)检测外泌体浓度及大小,二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测外泌体总蛋白浓度,Western blotting法检测外泌体表面标志物肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、分化抗原9(CD9)的表达。结果两种方法均可得到圆盘形的30~150 nm膜性囊泡。优化后的排阻超滤组合法所得外泌体,在电镜下可见明显的“茶托”形结构,背景较干净,纯度较高。UC法和优化后的排阻超滤组合法所得外泌体浓度分别为2×10^9、3.6×10^11 particles/ml,平均粒径分别为112.6、121.7 nm。优化后的排阻超滤组合法所得外泌体总蛋白浓度及TSG101的表达高于UC法。结论优化后的排阻超滤组合法虽然操作繁琐,成本较高,但提取的HSC来源外泌体浓度、总蛋白浓度和纯度较超速离心法高,可以作为外泌体分离的有效方法。     

ExoQuick法提取人血清外泌体的临床价值

目的探讨ExoQuick法提取人血清外泌体的方法及临床价值。方法选取2016年1月至2018年1月在该院体检的健康受试者50例,清晨抽取受试者空腹外周静脉血4mL,标本分成2等份,分别采用超迷离心法、ExoQuick法检测人血清外泌体。比较两种方法的检测时间以及投射电镜、BCA蛋白定量、western blot的检测结果。结果透射电镜检查发现,超迷离心法提取的人血清外泌体外形较圆,为类圆形或椭圆形囊泡状,绝大多数囊泡外周能观察到膜性结构,聚集形态既可单个分布,又可聚集成落,内部可见低电子密度物质,人血清外泌体直径分布在30～100nm,背景清晰。ExoQuick法提取的人血清外泌体外形多为椭圆形,密度均匀,直径30～50nm,背景干净、清晰。ExoQuick法提取的人血清外泌体BCA蛋白水平[(115.59±0.84)g/L]显著高于超迷离心法[(20.69±0.57)g/L,t=52.361,P0.05]。超迷离心法最长提取时间是66min,最短提取时间是60min,平均提取时间为(63.58±1.25)min。ExoQuick法最长提取时间是60min,最短提取时间是52min,平均提取时间为(55.62±1.20)min。ExoQuick法提取的人血清外泌体的时间少于超迷离心法(P0.05)。结论 ExoQuick法提取人血清外泌体方便、有效,能快速提取微小人血清外泌体、提高蛋白检出量,且对CD63敏感,可推荐使用。     

不同保存期单采血小板外泌体基因测序和蛋白组学的分析

目的:明确不同保存期单采血小板(AP)外泌体基因测序和蛋白组学的差异变化,预测不同保存期AP外泌体的功能.方法:留取不同保存期D0、D3和D5的单采血小板,用高速离心法提取外泌体,进行基因测序和蛋白组学分析,生物信息学分析并预测血小板外泌体的生物学功能.液相质谱分析技术检测外泌体蛋白的变化和功能预测;制备小RNA测序文...     

外泌体在肿瘤中的研究进展

外泌体(exosomes)是一种所有细胞都释放的胞外囊泡,其直径为30~150 nm。外泌体包含了DNA、RNA和蛋白质等内容物。外泌体可以调节细胞间通讯,活化它们所参与或相互作用的细胞内信号通路。外泌体可在肿瘤微环境中检测到,越来越多的证据表明外泌体在促进肿瘤生长中起到重要作用,其参与血管生成、免疫应答和肿瘤转移等活动。循环中的外泌体可能会成为液体活检且无创的生物学标志物应用到肿瘤患者的早期检测、诊断和治疗中。     

尿液外泌体蛋白质组学在糖尿病肾病无创性诊断中价值

目的筛选糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)患者与单纯2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者尿液外泌体中最优差异表达蛋白,探讨蛋白质组学在T2DM患者DN诊断中的价值。方法经肾脏穿刺活检组织病理检查确诊的DN患者12例,随机选取4例为DN筛选蛋白组,余8例DN患者为DN蛋白验证组;单纯T2DM不合并肾功能损害患者8例,随机选取4例为T2DM筛选蛋白组,余4例为T2DM蛋白验证组。分别收集DN筛选蛋白组与DN蛋白验证组患者肾脏穿刺活检前及T2DM筛选蛋白组与T2DM蛋白验证组患者晨起尿液标本,采用超高速离心联合0.22μm超滤法分离纯化尿液外泌体,应用透射电镜观测尿液外泌体形态特征,采用纳米颗粒跟踪分析尿液外泌体粒径;采用Western blot法检测4组尿液外泌体中经典外泌体识别蛋白ALIX、TSG101、Syntenin、CD9阳性表达情况;采用数据非依赖性采集质谱法鉴定4组患者尿液外泌体蛋白质及其表达量,分析DN筛选蛋白组与T2DM筛选蛋白组肾脏疾病生物途径相关的最优差异表达蛋白;比较DN蛋白验证组与T2DM蛋白验证...     

特发性肾病综合征患儿尿液外泌体miR-194-5p水平及其临床价值

目的探讨特发性肾病综合征(idiopathic nephrotic syndrome,INS)患儿尿液外泌体miR-194-5p水平及其作为辅助诊断标志物的临床价值。方法收集101例INS患儿和98例性别、年龄相匹配的健康儿童尿液标本,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-194-5p在尿液外泌体中的含量;ROC曲线、相关性分析等评估其对INS患儿的诊断价值。结果 INS组尿液外泌体miR-194-5p水平明显高于健康人对照组[2.420(0.650,9.515)fmol/L vs 0.360(0.220,0.653)fmol/L,U=1 552,P0.01],且其中44例患者在治疗缓解后明显下降[0.975(0.375,4.358)fmol/L vs 0.320(0.145,0.523)fmol/L,W=708,P0.01];伴有高尿蛋白的INS患儿miR-194-5p水平明显高于伴有低尿蛋白患儿[8.430(7.225,13.070)fmol/L vs 2.130(1.180,3.090)fmol/L,U=0,P0.01];miR-194-5p诊断INS的ROC曲线下面积(AUC~(ROC))为0.843(95%CI:0.789～0.897)。相关性分析显示,INS患儿尿液外泌体miR-194-5p与血清清蛋白(r=-0.300)水平呈负相关,与血清总胆固醇(r=0.278)、24 h尿蛋白(r=0.296)呈正相关(P均0.01)。结论 INS患儿尿液外泌体miR-194-5p含量明显升高,与24 h尿蛋白、血清清蛋白和胆固醇水平密切相关,有望作为辅助诊断儿童INS的非侵入性分子标志物。     

血清外泌体源性长链非编码RNA RP N2-4在胃癌中的表达及其筛查价值

目的探讨外泌体源性长链非编码RNA RPN2-4(lncRPN2-4)在胃癌患者血清中的表达及其筛查胃癌的价值。方法收集47例胃癌患者与32例行胃镜检查者血清标本;用试剂盒法分离外泌体,并提取RNA;粒径分析和透射电镜法鉴定外泌体;qRT-PCR法检测外泌体lncRPN2-4的表达水平;电化学发光法检测血清CEA、CA19-9与CA72-4的表达水平;利用ROC曲线评价其筛查胃癌的效能。结果与胃部良性疾病组[0.91(-2.98,6.92)]相比,胃癌组血清外泌体中lncRPN2-4的表达水平[3.78(-0.06,9.12)]明显降低(U=343,P0.01);LncRPN2-4的相对表达量与肿瘤分化程度(P=0.005)和淋巴结转移(P=0.033)有关; lncRPN2-4筛查胃癌时的ROC曲线下面积(AUC~(ROC))为0.772(95%CI:0.662～0.882,P0.01),当cut-off值为1.31时,其敏感性为87.2%,特异性为59.4%。结论血清外泌体来源的lncRPN2-4在胃癌患者中低表达,可能作为胃癌筛查的肿瘤标志物。     

外泌体转运linc-UFC1促进胃癌细胞增殖和迁移

目的探讨外泌体(exosome)来源linc-UFC1对胃癌细胞增殖和迁移的作用及机制。方法采用linc-UFC1高表达的胃癌细胞系BGC-823来源的外泌体处理胃癌细胞系MKN-45 48 h后,q RT-PCR检测linc-UFC1含量变化,细胞生长曲线和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;采用sh RNA敲减BGC-823细胞来源的外泌体中的linc-UFC1,作用于MKN-45细胞系,检测MKN-45细胞的linc-UFC1含量、增殖和迁移能力。结果与胃黏膜上皮细胞GES-1来源的外泌体相比,BGC-823细胞来源的外泌体中linc-UFC1的水平明显升高(q=56.12,P0.01),而MKN-45来源的外泌体中linc-UFC1表达水平明显降低(q=5.98,P0.01);经BGC-823外泌体处理后,与PBS组相比,MKN-45细胞内linc-UFC1水平明显升高(q=20.03,P0.01),细胞增殖速率加快(q=25.84,P0.01),平板克隆形成能力(q=48.73,P0.01)和细胞迁移能力也明显增强(q=57.95,P0.01);Linc-UFC1经敲减后,BGC-823外泌体中linc-UFC1水平明显降低(t=11.67,P0.01);与对照外泌体处理组相比,外泌体上调胃癌细胞内linc-UFC1水平的作用被减弱(q=14.08,P0.01),促进细胞增殖(q=14.45,P0.01),平板克隆形成(q=18.58,P0.01)及迁移(q=16.61,P0.01)的作用被抑制。结论外泌体可通过转运linc-UFC1促进胃癌细胞增殖及迁移。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

31例误诊哮喘原因分析

目的通过对中央气道不全性梗阻和支气管结核、术后痰栓形成误诊为支气管哮喘的分析,探讨误诊原因及正确诊断的方法。方法对误诊为支气管哮喘的3l例患者的临床资料进行分析。结果临床特征以刺激性咳嗽为主,其次为活动后胸闷、气促,肺部闻及哮鸣音,胸部影像学多无特征性改变或极易漏诊,支气管舒张试验阳性率低,诊断前缺乏气管镜及病理检查,均误诊为支气管哮喘。结论中央气道不全梗阻性病变或炎性病变包括支气管结核、术后痰栓形成时原发疾病症状不典型,肺部影像学检查无异常表现或极易漏诊,故该类以表现为咳嗽、喘息、活动后胸闷,进而出现严重呼吸困难的患者常被误诊为支气管哮喘,延误诊治。支气管镜及病理检查再结合肺CT是鉴别诊断的重要方法。     

血液透析患者家庭护理提供者的生活质量调查

目的:了解江汉油田血液透析(血液透析)患者家庭护理提供者(护理者)的生活质量。方法:对60例血液透析患者的家庭护理提供者进行一般情况和生活质量综合评定问卷(QOLI-74)调查,并进行相关性和多因素回归分析。结果:家庭护理提供者各维度的主观生活满意度与其客观指标相关,但也与其需求、年龄、文化程度、与患者的关系有关。结论:客观状态是影响主观生活满意度的重要因素,同时应考虑护理者的需求、年龄、文化程度、与患者的关系对护理者主观生活满意度的影响。     

超声评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响

目的 探讨超声在评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响的价值。方法 回顾性收集经病理学证实为头颈部肿瘤、放疗前后的颈动脉超声资料以及其他基线资料完整的患者93例,比较放疗前后放疗侧颈动脉和非放疗侧颈动脉粥样硬化斑块和溃疡斑块的总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积。结果 放疗前后颈动脉超声检查的平均间隔时间为（6.1±1.9）年;放疗前放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积与非放疗侧比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;放疗后放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积均较非放疗侧加重,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论 放疗可导致头颈部肿瘤患者颈动脉粥样硬化斑块的形成和进展,且斑块具有易损性特点。     

胰腺癌治疗的Cochrane系统评价证据

目的评价胰腺癌治疗的Cochrane系统评价证据,以及纳入系统评价的临床随机对照试验（RCT）的方法学质量。方法检索Cochrane Library数据库（2009年第4期）中有关胰腺癌治疗的系统评价,并运用RewMan5.0.21对所纳入研究的偏倚进行评估。结果共检索到胆道支架置入术姑息治疗梗阻型胰腺癌的系统评价、放化疗治疗不能手术的进展期胰腺癌的系统评价共2篇系统评价,共纳入79个RCT。依照Cochrane协作网推荐的质量评价方法,对所纳入RCT的偏倚进行评估,表明均存在不同程度的偏倚,方法学质量普遍较低。结论 Cochrane系统评价是公认的最高质量的研究证据,但目前缺少足够强度的证据来支持胆道支架置入术姑息治疗梗阻型胰腺癌的疗效。其他治疗手段的疗效如胰腺癌围手术期的营养支持治疗等还需要通过进一步的完成系统评价来评估。建议推行临床试验透明化,实施临床试验注册制度以及按照CONSORT声明严格规范RCT的报告,以便于总结胰腺癌治疗的临床证据。     

护理干预对提高中风患者生活质量的效果观察

目的探讨提高中风患者生活质量的护理方法。方法将50例中风患者随机分为对照组23例和实验组27例,对照组给予针灸内科常规护理,实验组在此基础上给予心理护理和康复训练。结果两组患者治疗护理后日常生活活动(ADL)能力和贝克抑郁量表(BDI)评分均有好转,但实验组疗效明显优于对照组(P<0.05)。结论实施针对性心理护理和康复训练可明显提高中风患者的治疗效果。     

中国人四肢瘫日常生活能力评定量表的信度研究

目的研究四肢瘫日常生活能力评定量表评测四肢瘫患者的重测信度及观察者间信度。方法由1位评定者应用四肢瘫日常生活能力评定量表对20例四肢瘫患者进行评定,评定后1周内再次对该患者进行评定;另1位评定者在第1位评定者初次评定后2 d内对该患者进行评定。结果第1位评定者两次评定总分的组内相关系数为0.994(P<0.01);第1位评定者与第2位评定者评定总分的组内相关系数为0.971(P<0.01)。结论四肢瘫日常生活能力评定量表具有良好的重测信度及观察者间信度。     

乳腺叶状肿瘤的影像分析

目的 分析乳腺叶状肿瘤的X线钼靶摄片和超声表现.方法 收集经手术病理证实的19例乳腺叶状肿瘤,术前均行超声检查,其中15例行X线钼靶摄片,回顾分析其临床特点和影像学表现.结果 19例乳腺叶状肿瘤中,良性8例,交界性6例,恶性5例.15例患者X线钼靶摄片中病灶均为高密度孤立肿块影,呈圆形(8例)或浅分叶状(7例),边界清晰(10例)或部分不清(5例),部分肿块周边见"晕"征(4例).超声检查6例发现囊性变,6例表现为后方回声增强.病灶为圆形(8例)、浅分叶状(8例)或有角状突起(3例).所有病例均未发现腋下转移淋巴结及周围组织浸润等恶性征象.结论 认识乳腺叶状肿瘤的病理类型和临床特点,结合影像表现综合分析,可提高术前诊断率.     

肇庆市居民颈椎病流行病学调查

目的 :调查肇庆市居民颈椎病发病情况及相关问题。方法 :通过分层随机抽样选择该市区18～70岁居民5000人为研究对象 ,入户或至单位询问调查。结果 :该市居民颈椎病发病率为8.11% ,男女差异无显著性 ,随着年龄的增长 ,发病率逐渐增加。经多因素分析 :体位姿势不正确、情绪紧张、潮湿、疲劳是发病的主要诱因。结论 :该病严重影响肇庆市居民的健康 ,做好防治应从早做起 ,综合防治。