真菌病

20 0 30 0 73　念珠菌生物膜的结构、影响因素及其对抗真菌药的敏感性 /孙秋宁 (中国医科院协和医大北京协和医院皮肤科 )…∥中国医学科学院学报 .- 2 0 0 2 ,2 4 (4 ) .- 385～ 388建立一种念珠菌生物膜体外模型 ,并观察其生长动力学、超微结构特点、唾液及血清对白念珠菌生物膜生长的影响及白念珠菌生物膜对抗真菌药的敏感性。采用 96孔微量培养皿制成体外念珠菌生物膜模型 ,用甲基四氮盐 (XTT)减低法测定其念珠菌活性及唾液和血清对念珠菌生物膜活性的影响 ,并评价生物膜对抗真菌药物敏感性 ;用共焦激光扫描显微镜观察念珠菌生物膜超…     

隐球菌性脑膜炎患者脑脊液隐球菌活性的研究

目的 对隐球菌性脑膜炎（隐脑）患者脑脊液进行隐球菌活性研究。方法 对脑脊液标本进行电镜观察。动物接种和中性红染色检查。结果 透射电镜观察见在治疗早期，多数标本菌体较为完整，常能见到出芽现象；在治疗后期，胞浆水肿，荚膜结构排列紊乱常见，通过对连续多次常规真菌培养不生长而镜检阳性的脑脊液标本进行动物接种，结果全部感染，中性红染色检查见多数标本中均存在一定数量的深血红色菌体，结论 上述方法可以对隐脑患者脑脊液隐球菌菌体活性进行动态观察，作为临床疗效监测的重要指标。     

PMT4对新生隐球菌生物膜药物敏感性的影响

目的 观察新生隐球菌H99野生株和PMT4缺陷株所形成的生物膜在抗真菌药物敏感性方面的差异.方法 采用PCR介导的长侧翼同源重组的方法敲除新生隐球菌H99的PMT4基因;采用基础培养基96孔板培养的方法建立生物膜体外模型;兔中心静脉插管、管内放置聚苯乙烯薄膜的方法建立生物膜动物模型;用M27A2药敏方案和MTT方法检测生物膜的药物敏感性.结果 M27A2方案:氟康唑、两性霉素B、5氟胞嘧啶、伊曲康唑对缺陷株游离细胞和野生株游离细胞的MIC之间以及生物膜细胞与游离细胞MIC之间的差异不大.体内外模型的MTT检测均发现,缺陷株生物膜细胞对不同的抗真菌药物的敏感性比野生株明显增高,可达16～64倍.结论 M27A2方案不适用于生物膜细胞的药敏试验,而MTT方法可作为有效的替代方案;PMT4基因对新生隐球菌生物膜的药物抵抗至关重要,PMT4及其产物可能成为新的药物靶点.     

桃红四物汤对酪氨酸酶活性与黑素生成的影响

目的：观察桃红四物汤对酪氨酸酶活性与黑素生成的影响。方法：采用直接添加法和血清药理学方法，观察待测物对酪氨酸酶活性及黑素生成的影响；蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法体外测定酪氨酸酶活性，氢氧化钠溶解法检测黑素生成量。结果：桃红四物汤加减水煎剂和药物血清均有明显激活酪氨酸酶活性的作用，并呈剂量依赖性。水煎剂呈现明显的促黑素生成活性。结论：桃红四物汤加减在体内外均具有激活酪氨酸酶作用，且体外有促黑素生成活性。     

隐球菌性脑膜炎患者脑脊液的冷冻保存

隐球菌性脑膜炎体外培养具有很高的假阴性率，因此有必要将患者的脑脊液保存下来并保持其中隐球菌的活性，为今后进一步研究留下材料。     

脑脊液对新生隐球菌和念珠菌的抗真菌活性研究

隐球菌性脑膜炎是隐球菌病中最严重的一型 ,尽管从隐球菌性脑膜炎患者脑脊液 (ＣＳＦ)中可分离出新生隐球菌 ,但对ＣＳＦ影响病原真菌生长的因素知之甚少。作者参照血清抑制新生隐球菌生长因素的研究方法 ,探讨了ＣＳＦ对新生隐球菌和念珠菌的体外抗真菌活性。材料与方法 :新生隐球菌 8株、白念珠菌 2株、光滑念珠菌 1株、克柔念珠菌 1株、乳酒念珠菌 1株。ＣＳＦ过滤除菌后用乳酒念珠菌作生物测试以排除其中的抗真菌药物活性。用ＲＰＭＩ-1 64 0培养液将ＣＳＦ倍比稀释后加入微测量平板中 ,同时用ＲＰＭＩ-1 64 0作对照 ,然后在上述培养基…     

隐球菌与体外培养角质形成细胞的相互作用

目的：研究隐球菌与体外培养的角质形成细胞的相互作用。方法：检测新生隐球菌对体外培养的角质形成细胞HaCaT株（简称HaCaT细胞）的时间-浓度黏附率、通透率;检测新生隐球菌对细胞的损伤;透射电镜观察二者相互作用的超微结构。结果：新生隐球菌标准野生株B3501（简称B3501）可以对HaCaT细胞产生黏附与侵袭,黏附率与侵袭率呈现时间依赖性;同时,B3501还可以使HacaT细胞凋亡率升高,对其造成损伤,这与菌体的活力相关。超微结构可见新生隐球菌与角质形成细胞的黏附与侵袭过程。结论：活的隐球菌黏附与侵袭角质形成细胞是其感染皮肤的重要条件。进一步明确二者的相互作用对隐球菌发病机制的研究具有重要意义。     

姜黄油对角质形成细胞体外增殖分化影响的研究

目的：探讨姜黄油对角质形成细胞体外增殖分化的影响。方法：以人角质形成细胞株COLO-16细胞为模型，噻唑盐比色法(MTT)检测细胞活性和生长情况；免疫组化SABC法检测姜黄油对增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响；电镜观察姜黄油对细胞超微结构的影响。结果：姜黄油抑制角质形成细胞增殖，随药物浓度增加，其抑制增殖能力增加，PCNA表达逐渐减弱，且对角质形成细胞超微结构有直接损伤作用。结论：姜黄油具有抑制体外角质形成细胞增殖分化的作用，有望成为一种治疗增殖性皮肤病的外用药物。     

在CGB培养基上生长的A型和D型新生隐球菌

新生隐球菌是临床上重要的致病真菌,在免疫缺陷的患者如艾滋病患者中引起播散性脑膜炎。新生隐球菌有两个变种,并分为5个血清型。文献报道新生隐球菌新生变种的血清型为A、D和AD型,在CGB培养基上不生长;格特变种的血清型为B和C型,能够在CGB培养基上生长。作者报告了3株来自鸽排泄物,能在CGB培养基上生长,血清型为A或D型的新生隐球菌。     

新生隐球菌随机扩增DNA指纹分型研究

目的　用随机引物扩增新生隐球菌临床和环境分离株的DNA ,观察DNA指纹与血清型的关系 ,探索新生隐球菌基因分型标准。方法　采用 3种不同寡核苷酸重复序列 [CN1(GTG) 5、CN2(GACA) 4和CN3(GATA) 4]为引物 ,对从临床和鸽粪中分离到的 2 4株血清A型和 8株四种血清型的新生隐球菌标准株的DNA进行扩增 ,根据扩增产物的电泳带型来对比DNA指纹和血清型之间的关系。结果　 2 4株临床和鸽粪分离的血清A型株中 ,2 0株产生和标准株完全相似的DNA带型 ,1株与标准D型DNA带型相似。 3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型均不相同。 2株B型和 2株C型产生几乎完全一致的DNA指纹带型。结论　①大多数血清A型新生隐球菌菌株具有相似DNA指纹带型。②血清B型和C型 (gattii变种 )的DNA带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的DNA指纹带型。④PCR法用于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。     

新生隐球菌生物膜体外抗真菌药物敏感性研究

目的了解新生隐球菌生物膜对氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑和卡泊芬净的体外敏感性。方法采用标准微量稀释法测定上述4种抗真菌药物对20株新生隐球菌悬浮状态与生物膜状态的最低抑菌浓度(MIC),MIC结果判定采用四甲基偶氮唑盐[XTT,2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt]-降解法。结果悬浮新生隐球菌20株均对两性霉素B敏感(<1μg/mL),3株对氟康唑耐药(>64μg/mL);1株对伊曲康唑耐药;20株均对卡泊芬净耐药。而生物膜新生隐球菌显示:在20株中,除4株对两性霉素B敏感外,其余各株均对两性霉素B耐药。20株菌均对氟康唑和伊曲康唑耐药,远远高于耐药浓度。对卡泊芬净,均高于其耐药浓度。结论标准微量稀释法结合四甲基偶氮唑盐(XTT)-降解法测定新生隐球菌生物膜对抗真菌药物的敏感性其结果具有可重复性和一致性的特点;新生隐球菌生物膜的明显降低抗真菌药物的敏感性。     

痤疮丙酸杆菌生物膜体外模型的成膜规律研究

目的：通过构建痤疮丙酸杆菌（P.acne）生物膜,探索其成膜规律。方法：体外构建痤疮丙酸杆菌生物膜模型,使用激光共聚焦显微镜、XTT细胞活力测定法动态检测生物膜在不同时间点（0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和20 d）的结构、厚度及活力情况。结果：在20天时间内菌株经历了生物膜的形成、播散、再形成的过程。第8天生物膜的厚度和活力动态均达到最大值(29.8±2.167)μm和0.620±0.063。结论：痤疮丙酸杆菌生物膜体外培养8天达最佳成熟状态。     

氨基酮戊酸孵育不同时间对光动力疗法抑制痤疮丙酸杆菌生物膜效应的影响

目的:探讨氨基酮戊酸（ALA）孵育不同时间对ALA光动力疗法（ALA-PDT）抑制痤疮丙酸杆菌生物膜效应的影响。方法:在预先放置细胞爬片的24孔和96孔细胞培养板中构建痤疮丙酸杆菌生物膜,使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察生物膜的形成情况,用甲基四氮盐（XTT）法观察生物膜生长活力情况。确定生物膜体外模型构建成功...     

Transforming growth factor-alpha: a major human serum factor that promotes human keratinocyte migration

In unwounded skin, human keratinocytes (HKs) are in contact with a plasma filtrate. In an acute wound, HKs come in contact with serum for the first time. Because human serum (HS), but not plasma, promotes HK migration, we speculated that a major HK pro-motility factor in vivo comes from serum. In this study, we compared all of the published growth factors (GFs), reported to promote HK migration, with HS. No single GF could duplicate the HK pro-motility activity in HS. Among these GFs, transforming growth factor-alpha [corrected] showed the highest HK pro-motility activity, reaching approximately 80% of the activity in HS. The order of potency was: TGFalpha > insulin > EGF > heparin binding (HB)-EGF > IGF-1 > basic fibroblast growth factor >IL-8 > HGF > IL-1 > KGF>TGFbeta. Interestingly, the combination of TGFalpha and insulin could duplicate the HK pro-motility activity in HS, although only the TGFalpha, but not insulin, levels increase in serum over plasma. Addition of neutralizing antibodies against TGFalpha to serum or depletion of TGFalpha from serum by immunoprecipitation significantly abolished its HK pro-motility activity. Plasma with added TGFalpha stimulated HK migration that reached more than 80% of the serum stimulation. Since insulin levels are identical between plasma and serum, we propose that TGFalpha is the physiologic HK pro-motility factor in HS.     

微进化对阿萨希毛孢子菌生物膜相关表型及耐药性的影响研究

【摘要】 目的 研究体内微进化对阿萨希毛孢子菌生物膜相关表型及耐药性的影响。方法 阿萨希毛孢子菌标准株源自荷兰真菌多态性保藏中心,阿萨希毛孢子菌原代株TO（氟康唑敏感）为解放军总医院第七医学中心皮肤科1例毛孢子菌病的临床分离株,进化株TEVO（氟康唑耐药）在该患者2014年复诊时分离。体外构建上述菌株的生物膜,使用四甲基氮盐（XTT）还原法及激光共聚焦扫描显微镜评估生物膜生长动力学并测定生物膜厚度;体外测定氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑对不同生长阶段生物膜的最低抑菌浓度（SMIC）,评估生物膜的耐药性。多组间比较采用单因素方差分析,Hartley检验对数据进行方差同质性检验,若方差齐,选用LSD检验进行组间多重比较,若方差不齐,选用Tamhane′T2检验进行组间多重比较。结果 在阿萨希毛孢子菌生物膜黏附（0 h）及形成阶段（4 ~ 24 h）,进化株TEVO代谢活性最弱（F黏附 = 35.705,P < 0.001;F形成 = 15.042,P < 0.001）。而黏附后第48小时生物膜成熟,此时生物膜代谢活性最弱的菌株为TO株（F = 10.985,P < 0.001）。生物膜厚度测量结果显示,成熟阶段TEVO株生物膜厚度［（26.1 ± 1.18） μm］大于TO株［（22.8 ± 1.73） μm,P = 0.001］,但小于标准株［（29.5 ± 1.28） μm,P = 0.001］。药物敏感性实验结果显示,在阿萨希毛孢子菌生物膜黏附及形成阶段,唑类抗真菌药物对TEVO株的SMIC值大于TO株;生物膜成熟阶段,3株菌生物膜的SMIC值均大于1 024 mg/L。结论 在宿主内环境和抗真菌药物的双重压力下,阿萨希毛孢子菌生物膜相关表型发生了适应性改变,并增强了对唑类抗真菌药物的耐药性。     

A novel method to control the balance of skin microflora. Part 1. Attack on biofilm of Staphylococcus aureus without antibiotics

BACKGROUND: Staphylococcus aureus (SA) is usually present in atopic dry skin, and not only in regions seriously affected by atopic dermatitis. SA discharges various toxins and enzymes that injure the skin, and forms a biofilm from fibrin fiber and glycocalyx; the biofilm is important for adhesion of SA to the skin and for resistance to anti-microbial agents. Even highly effective moisturizers do not work perfectly on atopic dry skin. Staphylococcus epidermidis (SE) is a major constituent of skin microflora on healthy human skin, and provides protection against the growth of pathogenic bacteria. OBJECTIVES: Since treatment with anti-microbials may lead to re-growth of SA, which grows faster than other Staphylococci and often shows antibiotic resistance, we searched for novel approaches to control the skin-microfloral balance without using conventional anti-microbials. METHOD: Biofilm formation by SA in vitro was observed in detail using scanning electron microscopy. Approximately 500 substances were screened for a selective effect on SA growth and SA biofilm. RESULTS: We found that xylitol inhibited the formation of glycocalyx, and farnesol dissolved fibrin fibers. Farnesol suppressed the growth of only SA, and did not affect that of SE. Xylitol and farnesol synergistically inhibited biofilm formation by SA. CONCLUSION: Xylitol and farnesol have potential for controlling the skin-microfloral balance because of their selective effects and inhibition of biofilm formation. They might provide a useful and safe method to care for skin colonized by SA, without using antibiotics.     

新生隐球菌荚膜多糖葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖的意义

新生隐球菌是一种机会致病真菌,隐球菌病严重威胁着免疫缺陷人群.葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖是新生隐球菌荚膜多糖的主要成分,是一种分子结构多样的线性多糖,与新生隐球菌的免疫原性和毒力密切相关.葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖结合FcγRⅡB介导免疫抑制作用,并参与形成生物膜,从而抑制抗隐球菌感染免疫.葡萄糖醛酸木糖甘露聚精单克隆抗体和疫苗疗法等免疫疗法或许可以改善免疫抑制状态,为隐球菌病提供治疗思路,也使艾滋病等高危人群预防隐球菌病成为可能.     

Improving chemotherapeutic drug penetration in melanoma by imatinib mesylate

BACKGROUND: Imatinib mesylate has specific activity in inhibiting select tyrosine kinase receptors, including platelet-derived growth factor receptors (PDGFRs) and c-kit. In general, melanomas widely express PDGFR and c-kit, and their in vivo resistance to chemotherapy is attributable to high tumor interstitial fluid pressure (IFP). Recent studies have suggested that PDGFR-beta inhibition reduces tumor IFP, and thus increases the uptake of concomitantly administered drugs. OBJECTIVE: The present study was designed to investigate the potential of imatinib mesylate as a therapy for melanoma or as an adjuvant to chemotherapeutics. METHODS: Using in vivo mouse models, the effect of imatinib mesylate on the growth of melanoma with or without dacarbazine was studied. RESULTS: Imatinib mesylate enhanced the antitumor effect of dacarbazine on in vivo growth and lung metastases of melanoma cells, although treatment with only imatinib mesylate had no effect. We could detect perivascular expression of PDGF beta-receptor in melanoma tumors. Interestingly, dacarbazine uptake in melanoma was more than three-times increased by treatment with imatinib mesylate, while its uptake in serum or bone marrow was not affected by imatinib mesylate. CONCLUSIONS: These data suggest interference with PDGF receptors, or their ligands, as a novel strategy to increase drug uptake and therapeutic effectiveness of chemotherapy for melanoma.     

阿萨希毛孢子菌生物膜形成研究

目的 观察阿萨希毛孢子菌（T. asahii）生物膜形态特征、活性分布。方法 用倒置显微镜和扫描电镜观察T. asahii生物膜的形态特征,2,3-二（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-5［（苯胺基）羧基］-2氢-氢氧化四氮唑（XTT）法和活菌计数法测定生物膜活性作定量分析,双荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察生物膜不同层面活菌分布、活性及生物膜厚度。结果 T. asahii在聚苯乙烯表面形成生物膜,该膜扫描电镜下呈复杂的三维立体结构,包括孢子、假菌丝和真菌丝。随时间延长,其活性不断升高,XTT法和活菌计数结果一致（r = 0.94,P ＜ 0.01）,激光共聚焦显微镜下显示T. asahii生物膜不同层面的活性曲线坡度缓和,无明显规律。生物膜的厚度为14.3 ~ 31 μm。结论 体外形成的T. asahii生物膜比其浮游状态下具有更加复杂的结构,生物膜不同层面菌活性无明显差异。