白细胞介素-1α对培养的人眼小梁细胞增殖和形态结构的影响

目的:观察白细胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)对体外培养的人眼小梁细胞(human trabecular meshwork cell,HTC)增殖和形态结构的影响。方法:取人眼小梁组织进行小梁细胞体外培养,取传3～5代的人小梁细胞,加入不同浓度的IL-1α的DMEM/F12液,通过比色法检测IL-1α对培养的人小梁细胞增殖的影响;用倒置相差显微镜、光镜、和电镜观察细胞形态结构的变化。结果:⑴MTT测定法:阴性对照组与低浓度实验组(0.5,1μg/L)相比,吸光度值无显著差异(P>0.05),IL-1α≥10μg/L组与对照组相比,吸光度值有显著差异(P<0.05),与对照组比较,0.5μg/L浓度的IL-1α对人小梁细胞形态结构差异无显著性;IL-1α浓度进一步增加,作用时间延长,细胞的损伤也加重。结论:IL-1α≥10μg/L时,将破坏细胞形态结构并影响其功能,而且显著抑制体外培养的人小梁细胞的增殖。     

内皮素-1对人小梁细胞吞噬功能的影响

目的观察内皮素-1（ET-1）对人小梁细胞（TMCs）吞噬功能的影响及作用机制。方法取培养第3代人TMCs,与直径0．5μm荧光标记的乳胶微粒共孵育0、4、8、12、24、48、72h,荧光显微镜下动态定量观察人TMCs吞噬动力学。取6孔板培养3代人TMCs,随机分为4组,观察不同浓度ET-1对人TMCs吞噬功能的影响：对照组（0mol／LET-1）、低剂量组（10-mol／LET-1）、中剂量组（10-mol／LET-1）、高剂量组（10～mol／LET-1）,分别与乳胶颗粒共孵育后观察各组细胞吞噬乳胶颗粒数。取6孔板培养人TMCs随机分为4组,观察内皮素受体对吞噬功能的影响：对照组（0mol／LET-1）、ET-1组（10～mol／LET-1）、ETA受体拮抗剂组（10-mol／LET-1＋10μmol／LBQl23）、ETB受体拮抗剂组（10mol／LET-1＋10。mol／LBQ788）,并分别与乳胶颗粒共孵育,观察各组人TMCs吞噬乳胶颗粒数。结果人TMCs免疫组织化学鉴定纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）、神经元特异性烯醇酶（NSE）染色均呈阳性;Ⅷ因子相关抗原（FⅧRAg）染色阴性;人TMCs吞噬动力学观察示,人TMCs与乳胶颗粒共孵育4h后可见明显的吞噬颗粒,随时间延长吞噬微粒数明显增多,24h吞噬微粒密度最佳,48h吞噬微粒达到饱和,细胞形态改变;加入ET-1干预后,细胞内吞噬乳胶微球数明显减少,其吞噬抑制效果呈ET-1浓度依赖性（F=28．91,P〈0．05）;ET-1组吞噬颗粒数较对照组减少（q=13．7228,P〈0．05）,而ETA受体拮抗剂组吞噬颗粒较ET-1组明显增多（q=9．4312,P〈0．05）,ETB受体拮抗剂组与ET—1组相比差异无统计学意义（q=1．1600,P〉0．05）。结论ET-1能抑制体外培养人TMCs的吞噬能力;ET-1主要通过ETA受体发挥抑制人TMCs吞噬功能的作用。     

白细胞介素-1β对人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3表达的影响

目的观察自细胞介素-1β（IL-1β）对体外培养的人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinases 3，MMP-3）表达的影响。方法采用组织块培养法对人眼小梁细胞（human trabecular ceils，HTCs）进行体外原代及传代培养，取传3代小梁细胞分别加入含有IL-1β终浓度为0ng／ml（对照组）、5、10、25、50ng／ml的无血清培养液，24h后采用RT-PCR法及ELISA法检测MMP-3量的变化。结果RT-PCR法检测IL-1β终浓度为5、10、25、50ng／ml实验组MMP-3／GAPDH的相对灰度比值分别为0．3437±0．0764、0．8588±0．0443、1．0079±0．0347、1．3466±0．0309，均高于对照组的相对灰度比值0．1037±0．0494，且各实验组与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）；ELISA法检测IL-1β终浓度为5、10、25、50ng／ml实验组的MMP-33浓度值分别为（2．0325±0．2456）ng／ml、（2．4607±0．350）ng／ml、（2．8532±0．1392）ng／ml、（3．5858±0．1141）ng／ml，均高于对照组的浓度值（1．2437±0．3910）ng／ml，且各实验组与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论IL-1β在一定范围内促进MMP-3的表达，并且呈现一定的剂量依赖性，推测IL-1β可以通过促进MMP-3的表达来减少小梁网组织细胞外基质（ECM）的堆积，使房水引流通畅，降低眼内压。     

炎性细胞因子对色素上皮细胞衍生因子表达的影响

目的 观察肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素（IL）-6、IL-8等炎性细胞因子对视网膜色素上皮细胞衍生因子（PEDF）表达的影响。方法 原代培养人视网膜色素上皮 (RPE）细胞，取3～5代细胞分别以浓度为20.00、2.00 、0.20 、0.02 ng/ml的TNF-α、IL-6、IL-8干预6、12、24、48 h，蛋白免疫印迹方法检测培养液中PEDF蛋白质的表达水平。 结果 TNF-α、IL-6、IL-8对人RPE细胞PEDF的分泌均有抑制作用，并且其抑制作用随着3种炎性细胞因子浓度的增加和作用时间的延长而增强；在浓度0.02 ng/ml、作用时间6 h（F=7.14，P＜0.05)，浓度2.00ng/ml、作用时间48 h（F=14.05，P＜0.01)，浓度20.00ng/ml、作用时间24 h（F=11.53，P＜0.01) 3种作用条件下,对PEDF分泌抑制作用的差异具有统计学意义，其中TNF-α干预组PEDF的表达量最低，对人RPE细胞PEDF的分泌抑制作用最明显（F＝14,P＜0.01）。结论 TNF-α、IL-6、IL-8能够下调体外培养的人RPE细胞PEDF蛋白质的表达。     

白细胞介素-1α对猪小梁细胞基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶抑制剂表达的影响

背景房水外流通路的阻塞或小梁网细胞外基质（ECM）的异常堆积导致房水流畅系数降低是引起眼压升高的原因之一,基质金属蛋白酶（MMPs）和组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的平衡对ECM的代谢至关重要,白细胞介素-1α（IL-1α）可以通过调节MMPs的表达而调节房水的外流。目的研究猪重组IL-1α对体外培养的猪眼小梁细胞MMP-2、MMP-3及TIMP-1表达的影响。方法从猪眼取出带有小梁组织的巩膜,用组织块培养法培养小梁细胞并进行传代,第3代的猪小梁细胞应用纤维连接蛋白（FN）和层黏连蛋白（LM）进行鉴定。第3代小梁细胞血清饥饿培养24h后分为2组,对照组加入无血清培养基,IL组加入10m／L IL-1α,分别培养30min。采用细胞免疫化学法分析IL组MMP-2、MMP-3及TIMP-1蛋白在培养小梁细胞中的表达;采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测小梁细胞中MMP-2mRNA、MMP-3mRNA及TIMP-1 mRNA的表达,并与对照组的检测结果进行比较。结果传3代的细胞对FN和LM呈现阳性反应。与对照组比较,IL组小梁细胞中MMP-3和TIMP-1蛋白的表达量（A值）明显升高,差异均有统计学意义（t=-7．694、t=-5．199,P〈0．05）,但2组间小梁细胞中MMP-2表达的差异无统计学意义（t=-2．365,P〉0．05）。IL组小梁细胞中MMP-3mRNA和TIMP-1mRNA的表达量（A值）明显高于对照组,差异均有统计学意义（t=-3．025、t=-1．921,P〈0．05）,而2组间小梁细胞中MMP-2mRNA的表达差异无统计学意义（t=-1．173,P〉0．05）。结论外源性IL-1α能增加猪眼小梁细胞中MMP-3、TIMP-1的表达,引起MMP-3／TIMP-1平衡改变,促进小梁网ECM的分解,增加房水外流,而对MMP-2的表达无影响。     

IL-1α对体外培养的牛小梁网细胞MMPs及TIMPs表达的影响

目的 观察白细胞介素-1α（IL-1α）对体外培养的牛小梁网细胞分泌基质金属蛋白酶（MMPs）和基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）的影响，探讨IL-1α降低眼压的机制。方法 采用酶谱分析法和反向酶谱分析法检测牛小梁网细胞MMP和TIMPs的分泌，并观察IL-1α对MMP和TIMPs分泌的调节作用。结果 体外培养的牛小梁细胞分泌MMP-2、MMP-3、MMP-9和TIMP-1；IL-1α对MMP-2、MMP-3、MMP-9的分泌有促进作用，且呈时间和浓度依赖性，其中以IL-1α对MMP-3的分泌促进作用最强；IL-1α对TIMP-1的分泌也有微小的增加作用。结论 IL-1α能够显著促进牛小梁网细胞分泌MMPs，打破了MMP／TIMPs的平衡，可能进一步促进小粱网细胞外基质（ECM）的分解，增强房水流动性。     

肿瘤坏死因子-α对体外培养的人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3和基层金属蛋白酶-9表达的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子-α，（tumor necrosis factor-α．TNF—α）对体外培养的人眼小梁细胞基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP-3、MMP-9）表达的影响。方法 对人眼小梁细胞（humantrabecular cells，HTCs）进行体外原代培养及传代培养。取传3代的小梁细胞分别施加含TNF-α终浓度为0（对照组）、1mg／ml、10mg／ml、25ng／ml的无血清培养液．48h后采用免疫细胞化学法观察小梁细胞MMP-3、MMP-9的染色变化。对结果进行计算机图像分析并进行统计学检验．结果 利用免疫细胞化学法检测1ng／ml、10ng／ml、25ng／ml的TNF-α实验组小梁细胞MMP-3的平均灰度值分别为138．63±8．15、138．73±7．02、129.25±10．47．均低于对照组平均灰度值143．53±6．01．且各实验组与对照组比较差异均有显著性（P〈0．05）：实验组小梁细胞MMP-9的平均灰度值分别为137．60±11．53、125．20±17．29、119．88±12．47．均低于对照组平均灰度值145．30±7．05．且各实验组与对照组比较差异均有显著性（P〈0．05）。结论 TNF-α在-定范围内促进小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达．增加了小梁网异常堆积的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解，使房水流出增加，眼压降低。     

牛眼小梁网细胞体外培养及吞噬功能的研究

目的研究小梁细胞吞噬功能异常在青光眼发病中的作用。方法利用牛眼分离小梁网组织，进行小梁细胞体外培养；应用乳胶微球为标记物，定性及定量观察体外培养的牛小梁细胞吞噬功能及其影响因素。结果免疫组织化学染色证实牛小梁细胞能分泌纤维连接蛋白和层连蛋白。在体外，牛小梁细胞对乳胶微球有较强的吞噬能力。细胞吞噬乳胶微球的数目随培养时间的延长而增多，培养至２４小时，平均每个细胞含４０．５±６．７个微球，细胞在吞噬过程中出现明显的形态学改变，同时也伴有自身损伤，甚至死亡。肾上腺素及可的松抑制小梁细胞的吞噬功能（Ｐ＜０．０５），ＥＧＦ对细胞吞噬作用无影响。结论小梁细胞的吞噬功能对保持房水流出道通畅起重要作用，小梁细胞的吞噬功能异常可能参与原发性开角型青光眼的发病过程。     

肿瘤坏死因子-а对人眼小梁细胞增殖及NO合成的影响

目的研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对体外培养人眼小梁细胞增殖及一氧化氮(NO)合成的影响.方法体外培养人眼小梁细胞,采用细胞计数法及MTT法比较不同浓度TNF-α对细胞增殖能力的影响.采用硝酸还原酶法检测不同浓度TNF-α对细胞合成NO的影响. 结果 TNF-α浓度在10×103 IU·L-1以上可以抑制人眼小梁细胞增殖,呈浓度依赖性,并可以增加人眼小梁细胞NO合成,在浓度100×103 IU·L- 1达到最大促进程度. 结论 TNF-α可以抑制人眼小梁细胞增殖,增加NO生成,可能在青光眼发病过程中发挥重要作用.     

内皮素刺激下人RPE细胞的自分泌调节

目的检测内皮素（endothelin-1，ET-1）刺激人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞后ET-1的自分泌。方法用体外培养的RPE细胞，经10^-11 mol· L^-1 ,10^-9 mol· L^-1、10^-7 mol· L^-1作用后，用免疫组织化学和原位杂交检测RPE细胞ET-l的表达和一氧化氮舍酶l（nitric oxide synthase1，NOS1）的表达，并用LeicaQ750图像分析仪定量分析表达量；用放射免疫测定检测细胞调理液中ET-1和6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）含量。结果在未经ET-1．作用的RPE中ET—1、ET-1mRNA和NOS1仅见少量细胞微弱表达，3个浓度ET-1作用24h后，图像分析在不同浓度ET-1刺激后均检测出ET-1的表达增强，并有浓度依赖性（F=9．511，P〈0．01），NOS1的表达也增强（F=16．113，P〈0．01），两者有直线相关性（r=0．685，P〈0．05）。在调理液的检测中，ET—1和6-Keto-PGF1α的含量均随着ET-1作用浓度的增加而增加，各作用浓度两者含量均有统计学差异（前者F=23．67，P〈0．01；后者F=44．431，P〈0．01）；并且两者有直线相关性（r=0．85，P〈0．01）。结论ET—1刺激RPE细胞表达并分泌ET-1，同时伴随的NOS1表达增加和6-Keto-PGF1α分泌增加可能是针对ET-1的负向调节作用。[眼科新进展 2007；27（3）：161-164]     

曲伏前列素对地塞米松诱导的人眼小梁细胞骨架及β黏蛋白的影响

目的 研究曲伏前列素对地塞米松诱导的人眼小梁细胞肌动蛋白细胞骨架及β黏蛋白表达的影响.方法 对照实验研究.人眼小梁细胞体外培养、传代.实验分为4组,第1组为空白对照组,第2组为地塞米松(1 ×10-6mol/L)处理组,第3组为地塞米松(1×10-6mol/L)+曲伏前列素(1×10-6mol/L)处理组,第4组为曲伏前列素处理组.培养的人眼小梁细胞于相差显微镜下观察其形态并拍照,于荧光显微镜下观察细胞骨架结构及β黏蛋白变化,用免疫印迹法半定量检测β黏蛋白的表达水平.组间β黏蛋白表达水平比较采用方差分析,进一步两两比较采用q检验.结果 培养的人眼小梁细胞经地塞米松诱导后微丝重组杂乱,形成交叉连接肌动蛋白网结构,β黏蛋白染色明显加强.地塞米松联合曲伏前列素处理组可部分逆转地塞米松诱导的微丝重组和交叉连接肌动蛋白网结构的形成,使β黏蛋白染色明显减弱.空白组、地塞米松组、地塞米松联合曲伏前列素组及曲伏前列素组β黏蛋白表达相对灰度值分别为0.84±0.03、1.65±0.05、1.21±0.05及0.65±0.04,组间β黏蛋白表达差异有统计学意义(F=143.07,P＜0.05).进一步两两比较,除空白组与曲伏前列素组β黏蛋白表达差异无统计学意义(q=2.84,P＞0.05)外,空白组与地塞米松组(q=15.32)、空白组与地塞米松联合曲伏前列素组(q=11.40)、地塞米松组与地塞米松联合曲伏前列素组(q=9.38)、地塞米松组与曲伏前列素组(q=16.55)、地塞米松联合曲伏前列素组与曲伏前列素组(q=14.31)比较,β黏蛋白表达差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 曲伏前列素可以部分逆转由地塞米松诱导的人眼小梁细胞骨架及β黏蛋白的改变,这可能是曲伏前列素通过调节小梁网房水流出途径并降低眼压的机制之一.

Abstract：

Objective To investigate the effect of travoprost on changes of actin cytoskeletal and β-catenin protein in the cultured human trabecular meshwork (HTM) cells treated with dexamethasone (DEX). Methods It was a control experiment study. The HTM cells were cultured in vitro and divided into control group, DEX (1 × 10-6mol/L) group, travoprost (1 × 10-6mol/L) group, and DEX (1 ×10-6mol/L) plus travoprost (1 × 10-6mol/L) group. F-actin in the HTM cells was detected by FITC-phallodin and observed under a fluorescence microscope. The expression of β-catenin was determined by immunofluorescence and western-blot. Statistical analysis was performed using SPSS13.0 software. The difference of β-catenin expression among groups was analyzed through variance analysis and, further by q test. Results The cultured HTM cells were identified by immunohistochemistry. A reorganization of actin cytoskeletal and a formation of cross linked actin networks (CLANs) were seen in the HTM cells treated with DEX, which were partially reversed by the treatment with DEX plus travoprost. An increase of the expression of β-catenin was discovered in the HTM cells treated with DEX, which was also partially reversed by the treatment with DEX plus travoprost. The amount of β-catenin protein in untreated control group, DEX group, DEX plus travoprost group and travoprost group were 0. 84 ± 0. 03,1.65 ± 0. 05, 1.21 ± 0. 05, and 0. 65 ±0. 04, respectively. Expression of β-catenin was significantly ( F = 143.07, P ＜ 0. 05 ) different when compared untreated control group with DEX group ( q = 15. 32 ,P ＜0. 05 ), untreated control group with DEX plus travoprost group (q = 11.40,P＜0. 05), DEX group with DEX plus travoprost group (q =9. 38,P ＜ 0. 05 ), DEX group with travoprost group ( q = 16. 55, P ＜ 0. 05 ), and DEX plus travoprost group with travoprost group (q = 14. 31 ,P ＜ 0. 05 ). No difference was found in untreated control group and travoprost group(q = 2. 84, P ＞ 0. 05 ). Conclusions Our results suggest that reversion of the changes of actin organization and β-catenin by travoparost in the HTM cells treated with DEX may partially elucidate the mechanism of action of increasing outflow by which travoprost reduces intraocular pressure.     

白细胞介素1、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α对人晶状体上皮细胞移行的作用

背景晶状体上皮细胞（LECs）在保持晶状体的透明性方面发挥重要的作用。研究表明炎症反应参与了一些类型白内障的形成过程,且炎性因子对LECs的生物学行为产生影响,但其对LECs移行的影响尚不明确。目的探讨白细胞介素1d（IL-1d）、IL-1B、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF—α）及4种炎性因子混合物对人LECs细胞系HLEB-3迁移的影响。方法HLEB-3细胞用含质量分数0．5％胎牛血清的DMEM培养液进行饥饿培养,将10μg/L的IL—1α、IL—1β、IL-6、TNF—α及这4种炎性因子的混合物分别加入培养液中作用24h后进行细胞划痕实验和Transwell实验。于上述因子处理后即刻和24h在倒置显微镜下观察并用数码相机记录划痕区,在200倍显微镜下计数划痕线内移行的细胞数量。Transwell实验24h后取出小室用质量分数4％多聚甲醛溶液固定15min,草酸铵结晶紫溶液染色2min,于倒置显微镜下观察,选取12：00、3：00、6：00和9：00位以及中心部位5个观察区在200倍显微镜下进行细胞计数,以评价炎性因子对LECs移行的作用。用仅含0．5％胎牛血清的DMEM培养液进行培养的LECs作为空白对照组。结果划痕实验结果表明,各种炎性因子作用后24h,对照组划痕区LECs数量明显低于IL-1β作用组及TNF—α作用组,差异均有统计学意义（P=0．000、0．000）,混合因子组划痕区细胞数量均明显高于IL-1β作用组及TNF-α作用组,差异均有统计学意义（P=0．000、0．000）;IL-1α作用组、IL-6作用组与对照组比较,划痕区细胞数量差异均无统计学意义（P=0．600、0．098）。Transwell实验显示,混合因子组作用24h小室膜下层LECs密度最大,与IL-α作用组、TNF—α作用组相比差异均有统计学意义（P=0．000、0．000）,且IL-α作用组、TNF—α作用组小室膜下层LECs数量均多于对照组,差异均有统计学意义（P=0.000、0．000）。IL—1α作用组和IL-6作用组可见少量穿膜细胞的生长和迁移,与对照组相比差异均无统计学意义（P=0．056、0．327）。结论IL-1α和IL-6对LECs的移行无明显影响,ILα和TNF—α能够促进LECs移行,当多种炎性因子共同作用时促进LECs移行的作用强于单个细胞因子。     

Transformation of human trabecular meshwork cells with SV40 TAg alters promoter utilization

PURPOSE: To compare promoter usage in primary differentiated and SV40 TAg transformed human trabecular meshwork cells (HTM and TM1 cells). METHODS: Cultured HTM and TM1 cells were transfected with vectors expressing MYOC/TIGR from the CMV-IE, IE4/5 (HSV immediate early 4/5), ICP6 (early gene ICP6 of HSV), EF-1 alpha (human elongation factor 1 alpha-subunit), or the UB6 (human ubiquitin) promoters, respectively. Immunoblotting was used to measure MYOC/TIGR protein expression. MYOC/TIGR expression at the RNA level was detected by Northern blotting. RESULTS: In primary HTM cells, CMV was the only promoter displaying substantial activity. In TM1 cells, several promoters were functional with the order in decreasing activity being EF-1 alpha > or = CMV > or = UB6 > IE4/5. CONCLUSIONS: The difference between the normal and transformed HTM cells suggests that the latter cell type has alterations that influence cellular promoter function. The type of cell used is likely to be a crucial factor in evaluating the functions of promoter elements for genes expressed in the trabecular meshwork and in screening promoters for use in gene delivery studies, especially for evaluations of the MYOC/TIGR gene in relation to glaucoma mechanisms.     

人视网膜色素上皮细胞吞噬过程中环磷酸腺苷及蛋白激酶C的改变

目的研究人视网膜色素上皮(HRPE)细胞特异性及非特异性吞噬过程中环磷酸腺苷(cAMP)浓度及蛋白激酶C(PKC)活性的变化,探讨cAMP及PKC在HRPE的吞噬功能中所起的作用.方法用1×107 个/ml视杆细胞外节膜盘(ROS)及乳胶微球(LB)于37℃孵育培养的正常HRPE细胞,在孵育的不同时间(5 min至48 h)终止吞噬反应.用双重荧光标记法检测HRPE细胞吞噬动力学.用扫描及透射电镜证明HRPE细胞对LB及ROS的结合与吞噬作用.分别用125I-cAMP放射免疫试剂盒及液闪记数γ-32P放射活性法检测相应时间点的HRPE细胞特异性及非特异性吞噬时的cAMP浓度及PKC活性. 结果 HRPE细胞特异性吞噬过程中,孵育15 min时ROS结合于HRPE细胞表面,此时cAMP浓度开始降低;胞质及胞膜PKC活性的降低早于cAMP,发生在孵育5 min时,但二者均在孵育24 h达到最低值.在非特异性吞噬过程中,HRPE细胞结合LB发生在孵育90 min,在孵育的12 h内cAMP浓度无明显变化(P>0.05),12～48 h cAMP浓度降低;胞质及胞膜PKC活性在孵育的5 min至48 h时间内,与对照组比较,差异均无显著意义(P>0.05).结论 cAMP及PKC对HRPE细胞特异性吞噬吞入过程的维持十分重要,但不参与非特异性吞噬的直接调节.并且,HRPE细胞特异性吞噬过程伴随着cAMP浓度及PKC活性的降低. (中华眼科杂志,2004,40178-182)     

压力对体外培养大鼠视网膜Müller细胞的影响

目的　探讨压力作用下体外培养的大鼠Müller细胞形态、活性和谷氨酸代谢功能是否有改变,以明确Müller细胞在青光眼损伤过程中的作用。方法　将体外培养的大鼠Müller细胞随机分为对照组和加压处理组,加压组在50mmHg(1mmHg=0. 133kPa)压力下处理1h,然后两组细胞继续培养3d后,使用倒置显微镜和电镜观察细胞的形态,MTT比色法测定两组细胞的活性,RT PCR法检测两组细胞内谷氨酰胺合成酶mRNA表达,并用图像分析系统测定吸光度值。结果　体外培养的Müller细胞经压力处理后与对照组相比倒置显微镜下改变不明显,电镜下可见细胞内空泡增多,线粒体肿胀;MTT比色法显示细胞活性降低,差异有统计学意义(P<0 05); RT PCR法示细胞内谷氨酰胺合成酶mRNA表达减少,差异有统计学意义(P<0 .05)。结论　经压力处理后体外培养的Müller细胞有损伤的改变,细胞由于谷氨酸谷氨酰胺循环中的关键酶谷氨酰胺合成酶mRNA表达减少而代谢谷氨酸的能力下降,这可能是青光眼玻璃体中谷氨酸浓度升高的原因之一。     

The presence of macrophage migration inhibitory factor in human trabecular meshwork and its upregulatory effects on the T helper 1 cytokine

PURPOSE: To investigate the expression and secretion of macrophage migration inhibitory factor (MIF) in human trabecular meshwork (HTM) and evaluate its role in ocular inflammation. METHODS: Tissue samples of HTM cells were isolated from donor human eyes or corneoscleral buttons, and the HTM cells were cultured. The expression of MIF on HTM cells was evaluated by RT-PCR, Western blot analysis, and ELISA. T-cell clones (TCCs) were established from ocular infiltrating cells of patients with uveitis. ELISA was used to evaluate the pathologic role of MIF, in relation to regulatory effects on cytokine production by T cells. RESULTS: MIF was detected in the HTM by RT-PCR and Western blot analysis. MIF was also shown by ELISA to be secreted by the HTM cells in culture. The HTM supernatant enhanced IFN-gamma production by TCCs, but not IL-10; and these effects were neutralized by anti-MIF antibodies. Similarly, recombinant MIF enhanced the IFN-gamma production by the TCCs. CONCLUSIONS: MIF is expressed and secreted in the HTM, and MIF has the capacity to enhance T helper 1 cytokines and may play a role as an inflammatory cytokine in the eye.     

人视网膜色素上皮细胞吞噬过程中MERTK基因mRNA表达水平与蛋白激酶C关系的研究

目的 探讨人视网膜色素上皮(hRPE)细胞吞噬过程中MERTK基因mRNA表达水平与蛋白激酶C(PKC)的相互作用.方法 对照实验研究.采用1×1010个/L视细胞外节膜盘(ROS),于37℃下孵育体外培养的正常hRPE细胞,在孵育的不同时间终止吞噬反应.用双重荧光标记法,检测hRPE细胞的吞噬能力.用液闪记数γ-32P放射活性法,检测不同吞噬时间点的PKC活性.以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,检测MERTK基因的mRNA水平变化情况.以PKC激活剂和拮抗剂处理hRPE细胞后,再行MERTK基因mRNA表达水平检测.采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析,实验组与对照组hRPE细胞吞噬ROS能力、PKC活性比较采用Student't检验,MERTK基因mRNA表达水平比较采用单因素方差分析.结果 ROS孵育后的hRPE细胞结合及吞入ROS的数量逐渐增多,至24 h时,hRPE细胞吞噬ROS的数量达到高峰,为(2.85±0.11)×106个,与对照组(0.00±0.00)×106个比较,差异有统计学意义(t=47.64,P＜0.05).ROS孵育后的hRPE细胞胞质PKC活性降低,至24 h时,PKC活性降至最低,细胞质的PKC活性为(151.13±17.67)nmol·g-1·min-1,细胞膜的PKC活性为(152.45±64.83)nmol·g-1·min-1;对照组细胞质的PKC活性为(329.63±14.26)nmol·g-1·min-1,细胞膜的PKC活性为(467.67±68.87)nmol·g-1·min-1;两组间PKC活性比较,差异有统计学意义(细胞质:t=89.66,P＜0.05;细胞膜t=10.31,P＜0.05).在hRPE细胞与ROS不同时段的孵育过程中,MERTK基因mRNA均呈现出高表达状态,孵育至90 min时,MERTK基因mRNA表达灰度值为1.8853±0.0077,与对照组灰度值0.7246±0.0062相比,差异有统计学意义(F=16 060.2167,P＜0.05);孵育至24 h时,MERTK基因mRNA表达灰度值为0.5946±0.0082,与对照组灰度值0.3343±0.0064比较,差异有统计学意义(F=919.8421,P＜0.05).上调hRPE细胞的PKC活性后,再行不同时段的ROS孵育,短时与长时孵育的MERTK基因mRNA表达灰度值均低于对照组(短时孵育:F=17 142.2331,长时孵育:F=1886.4614;P＜0.05).拮抗hRPE细胞的PKC活性后,再行不同时段的ROS孵育,30 min内MERTK基因mRNA表达灰度值为4.4670±0.0092至5.7034±0.0095范围,均高于对照组灰度值0. 9117±0.0021(F=199 012.9138,P＜0.05).结论 PKC的低活性和MERTK基因mRNA的高表达可促进hRPE细胞吞噬ROS的过程.PKC活性和MERTK基因mRNA表达水平作为上游调控信号,通过两条不同的信号通路,以负相关的方式调节hRPE细胞吞噬ROS的功能.