PTEN在人脑胶质瘤细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

背景与目的:PTEN基因的缺失及突变与多种肿瘤有关,而脑胶质瘤是与PTEN基因变异关系最为密切的恶性肿瘤之一.本研究旨在观察PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响,为PTEN用于胶质瘤基因治疗提供科学的实验依据.方法:(1)应用RT-PCR方法扩增人脑胶质瘤细胞U251、SHG-44中PTEN基因,序列测定分析.(2)采用阳离子聚合物转染试剂,将携带野生型PTEN基因的重组真核表达载体质粒转染至胶质瘤细胞,G418筛选出稳定转染的细胞并扩增培养.通过细胞形态学、细胞生长曲线观察PTEN基因表达对细胞形态和增殖的影响,应用Western blot、免疫细胞化学法检测相关蛋白的表达.结果:(1)胶质瘤细胞U251和SHG-44的PTEN mRNA分别存在着突变型、缺失型两种表达方式.(2)稳定转染的U251和SHG-44细胞株的生长曲线显示细胞增殖明显受抑制,第7天细胞计数分别为未转染对照组细胞数的39.1%、27.8%;Westem blot显示稳定转染细胞株有外源性PTEN蛋白的表达;细胞免疫化学法显示胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达量增加,从而表现出对细胞形态影响的差异,稳定转染的U251细胞出现向星形细胞分化的特征,SHG-44细胞形态转染前后无明显改变.结论:恢复野生型PTEN基因表达对胶质瘤细胞存在差异性的诱导分化作用.     

人PTEN基因表达载体的构建及其在U251细胞中的表达

背景与目的:克隆人野生型和突变型PTEN的cDNA并构建其表达载体,探讨该表达质粒在人星形胶质瘤细胞U251中的表达情况.材料与方法:分别从新鲜胎盘组织和结肠癌组织中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增人野生型和突变型PTEN基因全长cDNA,分别克隆入pMD 18-T载体上,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸序列分析.再分别将两段基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体,转染入U251细胞.结果:成功克隆了人野生型及突变型PTEN cDNA并成功构建其表达载体,发现突变型PTEN蛋白对细胞生长无明显抑制作用,而野生型PTEN蛋白对细胞生长有明显抑制作用.结论:PTEN可能能抑制肿瘤细胞生长,为后进一步开展PTEN对肿瘤相关功能的研究奠定基础.     

p53基因对胶质瘤细胞系U251生长抑制作用的研究

背景与目的：肿瘤抑制基因p53是调节多种与细胞周期、凋亡、DNA修复等有关基因表达的转录因子。p53基因在大约30％的胶质瘤中发生突变，在胶质瘤的发生和发展中起重要作用。本文主要探讨野生型p53基因过表达对脑胶质瘤细胞系U251细胞生长抑制的机制。方法：通过p53腺病毒表达载体pAdCMV-p53及空载体pAdCMV-lacZ分别感染U251细胞系，RT-PCR及Westem blot方法检测转染效率；并通过MTT检测生长抑制率、流式细胞仪检测细胞周期及TUNEL检测分析细胞凋亡等指标观察p53基因对U251细胞生长的影响。结果：MOI为100时，野生型p53基因的过表达可引起U251细胞G0、G1期阻滞、诱导U251细胞凋亡以及引起U251细胞生长抑制。结论：p53基因可以通过细胞周期G0、G1期阻滞及诱导细胞凋亡抑制胶质瘤细胞系U251的生长。     

PTEN下调FAK磷酸化来抑制EGFR受体突变体引起的胶质瘤细胞侵袭

背景与目的:抑癌基因PTEN在胶质瘤中突变率达20%～40%,且PTEN缺失和表皮生长因子受体突变体EGFRvⅢ同时存在EGFR表达的胶质瘤组织中.PTEN通过直接与FAK作用从而降低其酪氨酸磷酸化来抑制肿瘤细胞侵袭.EGFRvⅢ表达,PTEN缺失都是肿瘤细胞侵袭性增加的原因之一.PTEN功能的丧失可能是EGFRvⅢ表达的肿瘤进一步发展成恶性侵袭性肿瘤的原因之一.本文将探讨在EGFRvⅢ表达和PTEN缺失的肿瘤细胞中转入PTEN以观察其是否能抑制EGFRvⅢ所引起的肿瘤细胞的侵袭.方法:将野生型PTEN及其突变体分别导入人胶质瘤细胞U87ΔEGFR中,利用Transwell-细胞侵袭实验观察细胞侵袭运动变化;免疫印迹实验检查FAK磷酸化变化;FAK表达载体来转染FAK磷酸化程度低的U87ΔEGFR-wtPTEN细胞,观察细胞侵袭运动变化.结果:PTEN和PTEN(G129E)能够抑制U87ΔEGFR细胞侵袭,并且下调FAK 397位点磷酸化水平.U87ΔEGFR-wtPTEN细胞中FAK 397位点磷酸化水平增加伴随着细胞侵袭能力的提高.结论:PTEN 可能通过下调FAK 397位点磷酸化水平来抑制EGFRvⅢ引起的胶质瘤细胞侵袭.     

EZH2基因沉默对人脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡影响的研究

目的:研究RNA干扰技术抑制zeste基因增强子人类同源物2(EZH2)的表达对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响.方法:构建靶向EZH2基因的shRNA质粒并转染至U251细胞中,采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测EZH2 mRNA和蛋白的表达情况,利用四甲基偶氮哇盐(MTT)实验和Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验观察转染后U251细胞增殖和凋亡情况.结果:靶向EZH2基因的shRNA质粒成功抑制了U251细胞EZH2基因的表达,mRNA和蛋白表达抑制率分别为56.00％和88.73％;转染shRNA EZH2后,U251细胞的生长受到明显抑制(P＜0.01),在转染96 h后,生长抑制率达35.79％;转染48 h后,U251细胞早、晚期凋亡率分别为(26.59±0.83)％和(38.63±0.80)％,较阴性质粒组和空白对照组均增加,以晚期明显,差异有统计学意义,P＜0.01.结论:EZH2基因的沉默能有效抑制胶质瘤U251细胞的增殖、促进其凋亡,提示EZH2可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点.     

腺病毒介导PTEN基因抗脑胶质瘤作用的实验研究

目的 :探讨 10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物 (phosphataseandtensinhomologydeletedonchromo someten ,PTEN )对人脑胶质瘤细胞的抗增殖作用 ,包括细胞周期改变、抗血管生成的作用。方法 :用含PTEN基因的重组腺病毒载体 ,体外转染人脑胶质瘤细胞U87,用RT PCR、Westernblot检测基因及蛋白的表达。通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术检测转染细胞的增殖、细胞周期的改变 ,用MTT法检测PTEN对人脐静脉内皮细胞生长的影响 ,体内实验检测其致瘤能力。结果 :RT PCR、Westernblot检测转染AdPTEN病毒后的U87细胞PTEN表达由阴性转阳性 ,转染后对U87细胞的体外生长有明显抑制作用 ,使细胞出现G0 ～G1期阻滞 ,并抑制其体内肿瘤生长。含PTEN的上清对内皮细胞生长有明显抑制作用。体内实验表明 ,AdPTEN治疗组可明显抑制肿瘤的生长。结论 :重组腺病毒载体介导的PTEN基因在体内外对人脑胶质瘤细胞U87的生长有抑制作用 ,并抑制肿瘤血管生成 ,具有显著的抗胶质瘤作用     

Ad-PTEN增强LY294002对人胶质瘤细胞系U251的生长抑制作用

目的在体外实验中,利用携带野生型PTEN基因的重组腺病毒（Ad—PTEN）和P13K的小分子抑制剂LY294002联合抑制P13K／AKT信号通路,观察两者联合对人胶质瘤细胞系U251生长有无正向协同作用及探讨产生这种作用的机制。方法15251细胞按处理方式不同分为4组：DMSO对照组、空载病毒对照组、LY294002组和联合组（LY294002＋Ad—PTEN组）。在U251细胞系中导入LY294002并转染Ad—PTEN病毒后,提取总蛋白,用Westernblotting检测PTEN表达状态及P13K、AKT表达情况;用MTT法检测Ad—PTEN和LY294002对U251生长抑制率、流式细胞仪检测细胞周期、AnnexinV法检测细胞凋亡,观察导人LY294002和转染Ad—PTEN后U251增殖能力的改变;用划痕实验、Transwell实验观察LY294002及Ad—PTEN对U251迁移和侵袭能力的影响;Westernblotting检测P13K／AKT信号通路下游相关蛋白表达水平变化。结果Westernblotting显示：与DMSO组和空载病毒组相比,LY294002组P13K、AKT蛋白表达水平明显降低,联合组（LY294002＋Ad—PTEN）的WEN蛋白明显上调,而P13K、AKT蛋白下降水平比LY294002组更为显著。联合组与LY294002组、空载病毒组、DMSO组相比细胞周期阻滞在G0／G1期;联合组凋亡率比其他三组明显增加;自培养第2天起,联合组细胞增殖速率呈下降趋势。联合组侵袭和迁移细胞的相对数少于LY294002组、空载病毒组和DMSO组。Westernblotting结果证明位于P13K／AKT下游的MMP-2、MMP-9、PCNA、Bcl-2、CyclinD1、NF—KB、FAK蛋白表达水平显著下调。结论小分子抑制剂LY294002能够有效抑制U251中P13K、AKT蛋白的表达,联合转染Ad—PTEN后不仅能提高PTEN蛋白的表达水平,对P13K、AKT的抑制更为显著。在体外实验中,联合Ad—PTEN和LY294002能够有效地通过阻滞细胞周期、减少细胞凋亡来抑制U251的增殖能力,并能够抑制细胞的侵袭和迁移能力,两者联合使用具有正向协同作用。联合Ad—PTEN和LY294002对U251的生长与侵袭的抑制作用与P13K／AKT下游的MMP-2、MMP-9、PCNA、Bcl-2、CyclinD1、NF—KB、FAK蛋白表达水平下调有关。联合腺病毒转染技术和小分子抑制剂调控P13K／AKT信号通路是治疗胶质瘤的新途径。     

miR-126下调MMP-2抑制人脑胶质瘤细胞侵袭

目的初步探讨miR-126抑制人胶质瘤细胞侵袭的可能机制。方法化学合成miR-126,脂质体转染人脑胶质瘤U87细胞,应用RT-PCR、Western blot检测MMP-2基因和蛋白的表达情况,并应用Transwell小室检测转染前后细胞侵袭力的变化。结果miR-126上调后U87细胞的MMP-2基因和蛋白表达降低,并且细胞侵袭力明显降低。结论化学合成的miR-126在抑制人胶质瘤细胞侵袭过程中发挥重要作用,可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

腺病毒介导PTEN基因抗脑胶质瘤作用的实验研究

目的：探讨10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)对人脑胶质瘤细胞的抗增殖作用，包括细胞周期改变、抗血管生成的作用。方法：用含PTEN基因的重组腺病毒载体，体外转染人脑胶质瘤细胞U87，用RTPCR、Western blot检测基因及蛋白的表达。通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术检测转染细胞的增殖、细胞周期的改变，用MTT法检测PTEN对人脐静脉内皮细胞生长的影响，体内实验检测其致瘤能力。结果：RT-PCR、Western blot检测转染AdPTEN病毒后的U87细胞PTEN表达由阴性转阳性，转染后对U87细胞的体外生长有明显抑制作用，使细胞出现G0～G1期阻滞，并抑制其体内肿瘤生长。含PTEN的上清对内皮细胞生长有明显抑制作用。体内实验表明，AdPTEN治疗组可明显抑制肿瘤的生长。结论：重组腺病毒载体介导的PTEN基因在体内外对人脑胶质瘤细胞L187的生长有抑制作用，并抑制肿瘤血管生成，具有显著的抗胶质瘤作用。     

PDCD4基因在胶质瘤细胞系的稳定表达及其对肿瘤细胞生长的影响

目的:建立稳定表达程序性死亡4基因(programmed cell death 4, PDCD4)的人神经胶质瘤U251细胞系,观察PDCD4基因对人神经胶质瘤细胞增殖及细胞周期的影响.方法:将构建好的携带PDCD4重组真核表达载体pEGFP-PDCD4转染U251细胞,经过G418筛选获得稳定细胞系;用RT-PCR及Western blotting检测PDCD4 mRNA和蛋白的表达情况,通过锥虫蓝染色活细胞计数法及克隆形成实验检测外源PDCD4转染对细胞增殖和克隆形成能力的影响,以流式细胞术检测细胞周期.结果:成功建立稳定表达PDCD4的胶质瘤细胞U251-PDCD4.未转染的U251及空载体转染的U251细胞均不表达PDCD4,而pEGFP-PDCD4转染的U251-PDCD4细胞表达高水平的PDCD4 mRNA和蛋白质;转染PDCD4基因的细胞生长速度明显减慢(P<0.01)、克隆形成率明显降低(P<0.01);细胞周期检测显示,转染PDCD4的细胞较其他两对照组细胞S期升高、G2/M期明显降低(P<0.05).结论:PDCD4通过干扰细胞周期明显抑制胶质瘤U251细胞的细胞增殖及克隆形成能力.     

PTEN gene transfer suppresses the invasive potential of human malignant gliomas by regulating cell invasion-related molecules

Loss of function of the tumor suppressor gene PTEN is more frequently encountered in high-grade malignant gliomas than in low-grade gliomas. High-grade gliomas are characterized by their extremely invasive behavior, suggesting that PTEN is one of the important regulators of cell motility and that alterations of its coding gene contribute to a much more invasive tumor cell phenotype. In order to clarify a role of PTEN in glioma invasion, we introduced the wild-type PTEN gene into human malignant glioma cell lines and investigated their motile and invasive activity in a brain slice model that presents circumstances analogous to normal brain conditions in vivo. In addition, we analyzed biochemical and molecular changes resulting from the transfer of PTEN in the glioma cells. Infection of recombinant replication-defective adenovirus vector containing the wild-type PTEN cDNA (Ad5CMV-PTEN) significantly inhibited the cell migration and invasion activities of PTEN-mutated glioma cell lines in in vitro migration and chemoinvasion assays. In an organotypic brain slice model, co-culture of glioma spheroids and rat brain slices demonstrated that Ad5CMV-PTEN transfected cells failed to invade surrounding normal brain tissues. Ad5CMV-PTEN transfer into the glioma cell lines lacking the wild-type gene product decreased the levels of matrix metalloproteinase (MMP)-2 mRNA and inhibited the enzymatic activities of MMP-2 and MMP-9. In contrast, mRNA expression of tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-2 was upregulated by the PTEN gene transfer. Introduction of PTEN gene in glioma cell lines markedly reduced the levels of Rac-GTP and Cdc42-GTP, activated forms of these small GTP-binding proteins, and decreased the phosphorylation levels of focal adhesion kinase. These results suggest that PTEN inhibits glioma cell invasion in two ways: suppressing proteolysis of the extracellular matrix by MMPs and modulating the migratory activity of glioma cells to a less motile nature by inactivating two Rho-family GTP-binding proteins, Rac and Cdc42.     

Combination gene therapy with PTEN and EGFR siRNA suppresses U251 malignant glioma cell growth in vitro and in vivo

The over-expression/amplification of the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene and mutation/deletion of tumor suppressor PTEN gene are main genetic changes identified in glioblastomas. These two genetic changes play a critical role in the formation of many malignant tumors and have been shown to be the important therapeutic targets. In this study, we used an expression plasmid that expresses small hairpin RNA-targeting sequences of human EGFR and wild-type PTEN cDNA to examine the growth inhibitive effects in U251 glioma cells. It was found that down-regulation of EGFR expression and up-regulation of PTEN expression resulted in the suppression of cell proliferation, arrest of cell cycle, reduction in cell invasion and promotion of cell apoptosis in vitro. In addition, the growth of the subcutaneous U251 glioma in the nude mice treated with expression plasmid was significantly inhibited. Our results demonstrated that the expression plasmid could exert proliferation and invasion inhibition effects on U251 cells in vitro and in vivo. It suggested that combinatory gene therapy targeting EGFR and PTEN would be a new strategy in gene therapy of glioblastoma.     

PTEN磷酸酶活性对乳腺癌细胞ZR-75-1迁移能力的影响

目的:探求PTEN蛋白的磷酸酶活性对乳腺癌细胞ZR-75-1转移能力的影响。方法:采用脂质体介导法分别将野生型PTEN质粒(wt-PTEN)、磷酸酶失活的PTEN质粒(G129R-PTEN)和只具有蛋白磷酸酶活性的PTEN质粒(G129E-PTEN)转染PTEN基因缺失的人乳腺癌细胞株ZR-75-1,Western印迹法检测PTEN蛋白及P397-FAK的表达水平,体外细胞划痕实验观察PTEN磷酸酶活性对ZR-75-1细胞迁移能力的影响,细胞基质黏附试验和人工重组基底膜侵袭试验测定PTEN质粒转染和未转染的ZR-75-1细胞的黏附抑制率和侵袭抑制率,免疫组化法检测MMP-2的水平。结果:wt-PTEN、G129R-PTEN及G129E-PTEN3种质粒均成功转染ZR-75-1细胞并有PTEN蛋白的表达,其中wt-PTEN、G129E-PTEN均能抑制ZR-75-1细胞迁移;wt-PTEN和G129E-PTEN转染细胞之间的黏附抑制率和侵袭抑制率或侵袭细胞相对数均无显著性差异,但与G129R-PTEN转染的和未经转染的ZR-75-1细胞相比有显著性差异(P<0.01)。wt-PTEN和G129E-PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞其P397-FAK水平均显著低于G129R-PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞;wt-PTEN与G129E-PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞MMP-2水平对比于G129R-PTEN质粒转染的和未经质粒转染的ZR-75-1细胞有显著性差异(P<0.01)。结论:具有双特异磷酸酶活性的野生型PTEN基因和只具蛋白磷酸酶活性的PTEN基因均能抑制乳腺癌细胞ZR-75-1的迁移,而磷酸酶失活的PTEN基因则无此作用。     

PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响

目的 通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与PTEN融合蛋白真核表达载体的构建和表达,观察PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响。方法 （1）以RT—PCR方法扩增人的PTEN基因,经T—A亚克隆筛选后连入真核表达载体pEGFP—N1,构建融合蛋白表达载体。采用阳离子聚合物转染试剂,将重组质粒DNA瞬时转染至SHG-44细胞,检测融合蛋白的表达。（2）G418筛选出稳定转染的细胞（SHG-44-Z）,并扩增培养,通过细胞形态学、生长曲线观察PTEN基因对细胞形态和增殖的影响,免疫组织化学法检测对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响。结果 （1）重组质粒阳性克隆的测序结果与GenBank报告序列一致。瞬时转染的SHG-44细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光,流式细胞仪可检测到荧光表达量为17．8％,免疫细胞化学法检测到外源PTEN蛋白表达。证实pEGFP—PTEN融合蛋白表达载体构建成功,并在胶质瘤细胞得以正确表达。（2）转染组SHG-44-Z细胞株的生长增殖受到明显抑制,第7天细胞计数为未转染组细胞数的27．8％,且GFAP表达上调。结论携带绿色荧光蛋白的PTEN基因真核表达载体的构建,为进一步研究PTEN的作用机理及抑癌效应奠定了基础。     

PTEN对子宫内膜癌细胞株迁移和侵袭能力的影响

背景与目的：10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)是较为常见的抑癌基因之一。多项研究表明,其在子宫内膜组织中表达量降低,但是对子宫内膜细胞具体的功能及机制却不十分清楚。本研究旨在探讨PTEN对子宫内膜癌HEC-1B细胞迁移及侵袭能力的影响及相关机制,为子宫内膜癌治疗提供新靶点。方法：运用基因重组技术构建pIRES2-ZsGreen1-PTEN重组质粒;将重组质粒转染至子宫内膜癌HEC-1B细胞中,以转染pIRES2-ZsGreen1空载质粒为对照;运用体外划痕、Transwell迁移及侵袭实验分别检测过表达PTEN后细胞迁移和侵袭能力的变化;运用Western blot法检测过表达PTEN后细胞中PTEN、AKT、p-AKT及MMP-2蛋白表达量的变化。结果：PCR产物凝胶电泳显示一条1.2 kb大小的条带,与PTEN cDNA大小符合;基因测序结果与Genbank中PTEN cDNA的序列一致,表明质粒构建成功;转染后48 h荧光显微镜下见荧光且Western blot显示PTEN蛋白表达量增加,表明重组质粒在HEC-1B细胞中表达成功;体外划痕及transwell迁移实验表明,过表达PTEN后HEC-1B细胞的迁移能力减弱;体外侵袭实验显示,过表达PTEN后HEC-1B细胞的侵袭能力明显低于对照组及未处理组;Western blot结果表明,过表达PTEN会降低HEC-1B细胞中p-AKT蛋白表达下降,但是AKT蛋白量却不受影响,同时p-AKT下游的MMP-2蛋白表达量下降。结论：PTEN能明显抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞的迁移和侵袭,这一作用可能是通过抑制AKT磷酸化,从而降低MMP-2蛋白的表达而实现的。     

抑癌基因PTEN对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖和转移的抑制作用

背景与目的:研究表明,抑癌基因PTEN不仅能抑制肿瘤细胞的增殖,还能抑制其转移,但其机理还不甚明了.本文研究抑癌基因PTEN对人乳腺癌ZR-75-1细胞增殖和转移的作用.方法:以脂质体介导法分别将野生型PTEN质粒和磷酸酶缺陷的PTEN质粒转染人乳腺癌ZR-75-1细胞,用MTT法测定细胞增殖抑制率:转染后用嘌呤霉素筛选阳性克隆.用Western blot法检测细胞中PTEN蛋白的表达.通过细胞-基质粘附实验和人工重组基底膜侵袭实验,检测细胞粘附抑制率与侵袭抑制率.结果:野生型PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞增殖明显被抑制,并伴有部分细胞凋亡;该细胞与未经转染的和磷酸酶缺陷的PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞比较.细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(42.7% vs.0%及2.7%,P＜0.01),细胞增殖抑制效应随细胞培养时间与质粒浓度的增加而增强.而磷酸酶缺陷的PTEN质粒转染的与未经质粒转染的ZR-75-1细胞比较,细胞增殖抑制率差异无统计学意义(2.7%vs.0%,P＞0.05).在两种PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞中PTEN蛋白均明显表达,其中转染野生型PTEN质粒的细胞的粘附抑制率与侵袭抑制率分别达65.7%和70.4%,而转染磷酸酶缺陷的PTEN质粒的ZR-75-1细胞的粘附抑制率与侵袭抑制率分别只有8.8%和6.9%(P＜0.05).结论:具有双特异磷酸酶活性的野生型PTEN基因对ZR-75-1细胞的增殖和转移有一定的抑制作用.     

Reversal of the malignant phenotype of ovarian cancer A2780 cells through transfection with wild-type PTEN gene

Objective

PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10) is a tumor suppressor gene identified on human chromosome 10q23. Substantial studies have demonstrated that PTEN can inhibit cell proliferation, migration and invasion of many cancer cells. The purpose of this study was to determine whether upregulation of PTEN gene by transfection wild-type PTEN gene to ovarian cancer cells can inhibit growth and migration and to explore the potential for PTEN gene therapy of ovarian cancers.

Method

Wild-type and phosphatase-inactive (C124A) PTEN plasmids were transfected into ovarian epithelial cancer A2780 cells, and their effects on cell apoptosis, cell proliferation, cell migration and cell invasion were analyzed by flow cytometry analysis, TUNEL assay, MTT assay, wound-healing assay and transwell assay.

Results

Both wild-type and mutant PTEN can upregulate the expression of PTEN gene dramatically; however, it is wild-type PTEN not phosphatase-inactive PTEN that can induce apoptosis and decrease cell migration, invasion and proliferation in ovarian cancer cells.

Conclusion

These results demonstrated that PTEN had played an important role in the cell proliferation, cell migration and invasion dependent on its phosphatase activity. Enhanced expression of PTEN by gene transfer is sufficient to reverse the malignant phenotype of ovarian cancer cells and transfection of ovarian cancer cells with wild-type PTEN gene might be another novel approach for therapeutic intervention in ovarian cancer.     

PTTG1影响胶质瘤细胞侵袭力机制的研究

背景与目的：研究证实垂体肿瘤转化基因1(pituitary tumor transforming gene 1,PTTG1)的表达情况与各类肿瘤细胞的恶性程度有关,但是其在胶质瘤中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨PTTG1在恶性胶质瘤侵袭中的作用及其临床意义。方法：应用蛋白质印迹法(Western blot)检测PTTG1蛋白在不同胶质瘤细胞系中的表达;采用小RNA质粒干扰技术抑制U87细胞中PTTG1蛋白的表达,应用Western blot技术检测转染的效率;通过体外侵袭实验检测转染后细胞侵袭力的变化;采用Western blot技术检测经过表皮细胞生长因子(epithelial growth factor,EGF)刺激后敲除PTTG1的细胞组(siPTTG1/U87)与转染空载的细胞组(Scr/U87)中Akt、ARK5磷酸化的情况。结果：PTTG1蛋白在各恶性胶质瘤细胞系中均高表达;敲除PTTG1后U87细胞的侵袭力明显下降;对Scr/U87细胞进行EGF刺激5 min后,Akt、ARK5的磷酸化情况显著增强,而无论有无EGF的刺激,siPTTG1/U87中Akt、ARK5的磷酸化情况都没有明显改变。结论：在恶性胶质瘤细胞中,PTTG1蛋白呈高表达状态并且与侵袭性显著相关,其对侵袭性的调控可能是通过Akt-ARK5通路实现的。     

Regulatory effects of PTEN gene transfection on vascular endothelial growth factor (VEGF) in leukemia cells北大核心

Objective: To investigate the effects of wild type tumor-suppressing gene PTEN (phosphatase and tensin hemology deleted on chromosome ten gene) on vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF receptor 1 (VEGFR1) in leukemia cells and elucidate the mechanism. Methods: The recombinant adenovirus containing wild type PTEN and green fluorescent protein (GFP) (Ad-PTEN-GFP) or empty vector (Ad-GFP) was transfected into K562 leukemia cells. PTEN, VEGF, and VEGFR1 mRNA expression levels were detected using quantitative PCR and the protein expression levels were detected using Western blotting. Transwell invasion test was used to examine the invasion ability of the leukemia cells. Human umbilical vein endothelial cells ECV304 were also transfected with or without PTEN gene. Then the proliferation and apoptosis were measured using MTT assay and flow cytometry (FCM), respectively. Chick chorioallantoic membrane (CAM) test was used to determine the effect of PTEN gene transfection on angiogenesis. Results: The expressions of VEGF and VEGFR1 were significantly inhibited after transfection of Ad-PTEN-GFP compared with the control group transfected with empty Ad-GFP. The inhibitory effects were in a dose-dependent manner. The invasion capability of K562 cells was markedly weakened after transfection of Ad-PTEN-GFP. PTEN gene transfection inhibited the proliferation and induced apoptosis of vascular endothelial ECV304 cells. The cells were arrested at S phase. CAM test showed that PTEN gene inhibited the angiogenesis in vivo. Conclusion: Tumor suppressor gene PTEN inhibited the growth of endothelial cells and the invasion of leukemia cells. The action mechanism may be related with down-regulation VEGF expression and angiogenesis of leukemia cells.