人B7-1(CD80)逆转录病毒表达载体的构建及其在人肿瘤细胞系的表达

应用分子克隆技术，构建了含全长人Ｂ７－１ｃＤＮＡ（８６７ｂｐ）的逆转录病毒表达载体ｐＬＮＣ－ｈＢ７－１。以ｐＣＤＭ８－ｈＢ７－１为模板，５＇引物为：ＡＣＣＣＴＡＡＧＣＴ，ＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣ，内含ＨｉｎｄⅢ切点及起始密码ＡＴＧ，３’引物为：ＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＡＡＣＴＧ－ＴＴＡＴＡＣＡＧＧＧＣＧＴＡＣ，内含ＨｐａＩ切点和终止密码ＴＡＡ，经ＰＣＲ扩增及电泳回收后得到纯化ＰＣＲ产物，用内切每ＨｉｎｄⅢ和Ｈｐａｌ消化后，定向插入经同样内切酶消化的ｐＬＮＣＸ载体，获得含人Ｂ７－１ｃＤ…     

HBsAg中蛋白与IL-18联合核酸免疫HBsAg转基因小鼠的实验研究

对乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)转基因小鼠鼠系所进行的ＨＢＶ核酸疫苗免疫转基因小鼠的实验研究〔1,2〕 提示核酸疫苗有治疗潜力。本研究的目的是研究在白细胞介素 18(ＩＬ 18)的辅助作用下 ,ＨＢＶ表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫ＨＢｓＡｇ转基因小鼠的效果。材料与方法质粒构建 :引物设计 :上游引物 :5′ ＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣ 3′ ;下游引物 :5′ ＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＧＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧ 3′。ＰＣＲ法扩增ＨＢｓＡｇ中蛋白基因序列 ,将ＰＣＲ产物亚克隆至ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体 (Ｐｒ…     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子与HBsAg融合蛋白基因的 …

目的 研究粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）的免疫活性。方法 用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）３８４ｂｐ的基因片段及ＨＢｓＡｇ８４６ｂｐ基因片段，扩增产物经柱纯化后，由Ｔ４ＤＮＡ酶连结因子１２３０ｂｐ的片段，将此片段命名为ＬＧＨ，克隆到ｐＵＣ１９质粒中，利用菌落ＰＣＲ法快速筛选阳性克隆及限制酶切鉴定片段的大小。结果 该基因全长１２３０ｂｐ，经     

登革2型病毒43株膜蛋白前体基因片段的克隆与表达

依照国际标准株ＮＧＣ的序列，设计合成了一对引物，用于扩增登革２型病毒中国分离株Ｄ２－４３的ＰｒＭＣ端抗原区的基因片段，结构分析及特异性分析的结果表明引物合乎要求，反转录（ＲＴ）－ＰＣＲ扩增出一３８５ｂｐ的目的片段，经ＨａｅⅢ酶切得到２１９、１６６ｂｐ的两条预期片段，表明ＲＴ－ＰＣＲ扩增出ＰｒＭ基因片断。扩增产物经ＢａｍＨＩ酶切后插入经ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＥｘ１中，转化ＭＣ１０６１菌，表达与β－半乳糖苷酶的融合蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明有一约１３０ｋＤ的目的蛋白带，表达量占菌体总蛋白的３０％，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及ＥＬＩＳＡ结果表明表达产物能与Ｄｅｎｇｕｅ－２多抗血清结合，为ＰｒＭ的免疫学及生物学性质研究打下了基础。     

致肾盂肾炎大肠杆菌papA基因的克隆及序列分析

目的 对致肾盂肾炎大肠杆菌（ＵＰＥＣ）１３２株的ｐａｐＡ基因进行克隆和序列分析。方法 根据Ｆ１３型ｐａｐＡ基因序列设计引物,并在二引物５′端加上限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＢａｎＨⅠ的酶切位点。采用此引物扩增１３２菌株ｐ菌毛粘附基因群的ｐａｐＡ基因,扩增产物克隆人质粒,选取阳性重组质粒进行核苷酸序列分析。结果 ＵＰＥＣ１３２株经ＰＣＲ法扩增获得约７００ｂｐ的ｐａｐＡ片段,经克隆获得阳性重组质粒ｐＣＴ２     

中国广州人群中HBV感染与HLA-DRB1基因的相关性研究

ＨＬＡ系统在机体的免疫应答和免疫调节中发挥着重要的作用 ,Ⅱ类抗原递呈外源性抗原肽给ＣＤ4+ 辅助性Ｔ细胞 ,其多态性影响着个体的免疫应答和抗原多肽的递呈 ,与自身免疫性疾病和许多感染性疾病的易感性密切相关 ,是研究疾病易感性中不可忽视的遗传因素。本文采用经我们改进的套式ＰＣＲ ＳＳＰ方法对广州地区的 88名无血缘关系的乙肝患者 (ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂ检测阳性 )和 83名无血缘关系健康个体样品进行了ＨＬＡ ＤＲＢ1基因分型 ,寻找与ＨＢＶ感染的相关性。外引物位于内含子内 ,5′引物 :5′ ＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧ…     

人单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）基因的PCR扩增、克隆及序列分析

本文报道用植物血凝素（ＰＨＡ）诱导健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ，包括单核细胞和淋巴细胞），提取细胞总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ第一链，再以其为模板进行ＰＣＲ，得到了编码成熟单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切后，回收含ＭＣＰ－１基因的长约２８０ｂｐ的ＤＮＡ片段，插入到经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＣ１９载体中，进行序列分析。结果表明，ＭＣＰ－１中第１２个氨基酸的编码序列与国外报道的不同。由ＴＧＴ变成了ＴＧＣ，但编码相同的氨基酸即半胱氨酸，其余的编码序列则完全相同，说明ＭＣＰ－１的基因型可能存在着多态性。     

HGV RNA逆转录套式聚合酶链反应法的优选实验

1995年 ,美国Ｓｉｍｏｎｓ等和Ｌｉｎｎｅｎ等分别从肝炎患者的血清中克隆出庚型肝炎病毒 (ＧＢＶ Ｃ/ＨＧＶ)的基因组 ,并建立了检测血清ＧＢＶ Ｃ/ＨＧＶＲＮＡ的逆转录套式聚合酶链反应 (ＲＴ ｎＰＣＲ)方法。但是 ,该检测方法的灵敏度存在着较大差异。本实验使用Ａ～Ｅ共 5套ＰＣＲ引物 ,基中Ａ、Ｂ、Ｄ为自行设计的ＨＧＶ 5′端非编码区引物 ,目的产物长度分别为36 8ｂｐ ,15 8ｂｐ及 2 2 0ｂｐ ;Ｃ引物为参照文献设计的核心区引物 ,目的产物为30 2ｂｐ ;Ｅ引物为李倬副研究员设计的ＮＳ3区引物 ,目的产物长度为 5 91ｂｐ。采用改良的…     

大鼠β-防御素rBD-1基因在皮肤和肾脏固有表达

设计大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ序列一对特异引物：Ｒ１５′→３′ＡＣＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＣＧ;Ｒ２５′→３′ＣＣＣＴＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＡＴＧＴＣＣ。根据大鼠β－ａｃｔｉｎｃＤＮＡ序列设计一对阳性对照特异引物：Ｂ１５′→３′ＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧ;Ｂ２５′→３′ＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧ。引物由Ｇｉｂｃｏ公司合成。从Ｗｉｓｔａｒ大鼠皮肤、肾脏、气管、子宫颈、膀胱、小肠、脾脏、骨骼肌、骨髓及腮腺组织中提取总ＲＮＡ,行ＲＴ－ＰＣＲ扩增…     

rBPI23基因克隆与鉴定

ｒＢＰＩ２３基因（ＢＰＩ６０ｂｐ）克隆与鉴定。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＢＰＩＮ端１９９个氨基酸的基因片段,经酶切后通过连接反应构建重组克隆载体,测序鉴定。结果：ＲＴ－ＰＣＲ获得预期的扩增产物－ＢＰＬ６０ｂｐ基因片段。成功构建ＰＵＣ１８－ＢＰＩ１８０、ＰＵＣ１８－＝ＢＰＩ４２０重组克隆载体,酶切、酶谱分析与预期结果相符。ＤＮＡ测序结果与文献报道一致,结论：ＰＵＣ     

用于研究DLA－DRB1基因分型的寡核苷酸引物对的选择

我们用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法研究ＤＬＡⅡ类基因。为寻找合适的引物，用四对不同的引物：ＤＬＡ－ＤＲ－ＳＰ／Ｓｔｏｐ，ＤＬＡ－ＤＲ－ＳＰ／Ｐ３，ＨＬＡ－ＤＲＢ－ＧＨ４６／５０及ＨＤＡ－ＤＲＢ－ＡＭＰ－Ａ／Ｂ进行了一系列扩增。只有引物对ＨＬＡ－ＤＲＢ－ＡＭＰ－Ａ／Ｂ获得了满意的结果。其类似核苷酸序列在ＤＬＡ－ＤＲＢｃＤＮＡ的核苷酸序列内被发现，特异性也为Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交分析所证实。内切酶ＨａｅⅢ和ＨｉｎｆⅠ酶解后显示出ＤＬＡ－ＤⅡ类基因高度的多态性和等位基因特异的多态性带型。揭示该引物对是目前用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法研究ＤＬＡ－ＤＲＢ１基因较理想的、实用的引物。     

β-防御素-2基因在子宫颈的固有表达

根据ＧｅｎｅＢａｎｋ大鼠β－防御素－２ｃＤＮＡ序列,设计特异引物：Ｒ１５′３′ＧＣＡＣＣＡＧＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧ;Ｒ２５′３′ＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧ。引物由Ｇｉｂｃｏ公司合成。取Ｗｉｓｔａｒ大鼠宫颈组织,用Ｑｉａｇｅｎ公司生产的ＲＮＡ提取试剂盒提取总ＲＮＡ,以此为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,按照试剂盒说明操作,扩增ｃＤＮＡ,反应条件下：５０℃保温３０ｍｉｎ,使ｍＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ;９４℃预变性２ｍｉｎ,然后进行３０个ＰＣＲ循环：９４℃３０ｓ,５８℃退火３０ｓ,６８℃延…     

聚合酶链式反应鉴定肺炎链球菌

肺炎链球菌是一种致病率较高的病原菌。所采集临床标本中的细菌早期鉴定对疾病诊断至关重要。为建立早期特异性的鉴定方法,本实验依据肺炎链球菌自溶素和溶血素的基因序列,设计并选出两对寡核苷酸引物ＹＨ1(5′ＡＣＧＣＡＣＡＣＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＡＴ3′)ＹＨ2(5′ＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＡＴＴＣＧＴＧＣＡＡ3′)扩增自溶素基因中354ｂｐ的ＤＮＡ片段,ＹＨ7基金项目:甘肃省自然科学基金资助项目(ＺＳ991Ａ23073Ｙ)作者单位:兰州医学院第二附属医院(杨永红,朱保权,宁淑敏,安真光);兰州生物制品研究所(王棣,王兴民)通信作者:杨永红,730030兰…     

人MBL相关丝氨酸蛋白酶-1 cDNA的克隆与鉴定

目的 获得人甘露聚糖结合凝集素（ＭＢＬ）相关丝氨酸蛋白酶－１（ＭＡＳＰ－１）基因。方法 以人胎肝组织总ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ获取目的ｃＤＮＡ片段,克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体,进行酶切图谱分析和测序鉴定。结果 以ＲＴ－ＰＣＲ方法获得了含信号顺序的全长ＭＡＳＰ－１ｃＤＮＡ,将其与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转化大肠杆菌ＴＧ１,建立了ＭＡＳＰ－１的ｃＤＮＡ克隆,酶切图谱与微机分析结果一致。序列分析表明。与     

THANK基因的克隆和序列分析

目的 克隆ＴＨＡＮＫ基因全长及胞外区片段并测序。方法 采用ＰＴ－ＰＣＲ技术,唑人白血病细胞系ＨＬ－６０细胞总ＰＡＮ中扩增人ＴＨＡＮＫ ｃＤＮＡ,并定向克隆于ｐＭＤ－１８Ｔ载体,转染大肠杆菌、抽提质粒后,用ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ＾ＴＭ３７７ＸＬＤＮＡ 自动测义测序。结果ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个８５８ｂｐ的ＤＮＡ片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示：该８５８ｂｐ片段为编码入ＴＨＡＮＫ的ｃＤＮＡ,与公布     

深圳地区小儿肠道病毒感染的核酸检测分析

为了解深圳地区肠道病毒 (ＥＶ)的感染流行情况和病毒分型特征 ,我们采用检测ＥＶ的套式逆转录聚合酶链反应(ＲＴ ｎＰＣＲ)方法进行ＥＶ感染检测 ,并对临床分离株 5′端非编码区 ( 5′ＵＴＲ)基因序列进行分子进化树分析。采用ＴＲＩＺＯＬ ＬＳＲｅａｇｅｎｔ试剂从疑诊ＥＶ感染儿童大便、咽拭子和脑脊液中提取ＥＶ ＲＮＡ ,根椐ＥＶ 5′ＵＴＲ保守的基因序列设计两对特异性引物 ,引物序列分别为ＥＶＰ1 60 :5′ＣＡＡＧＣＡＣＴ(ＴＡ)ＴＴ(ＣＡ)ＣＣＣＣＧＧ3′,ＥＶＰ2 50 :5′ＴＡＣＴＴＧＡ(ＧＡ)ＣＣ ＴＡＧＴＡ3′,ＥＶＰ50 0 :5′…     

人白细胞抗原DQB15′—调控区序列与Ⅰ型糖尿病的关联

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）、ＰＣＲ／ＳＳＣＰ和克隆测序等方法比较分析汉族１－型糖尿病患者与正常对照者ＨＬＡ－ＤＱＢ１５′－调控区多态性。结果显示携带不同等位基因的患者与对照者ＤＱＢ１５′－调控区ｙ、ｓｂｏｘ核苷酸序列相同,且与白种人基因结构一致;ｙｂｏｘ核苷酸序列存在二各结构,ＣＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴ序列常常与ＤＱ１＊０３２等位基因在同一单倍型;转录起始位点至ｙｂｏｘ间－４４至－６１位存在多态     

人骨形态发生蛋白-2完整成熟肽基因的克隆

目的：克隆人骨形态发生蛋白－２（ｈＢＭＰ－２）完整肽基因。方法：依据Ｇｅｎｂａｎｋ中ｈＢＭＰ－２的序 化学合成两条引物,从人胎儿骨组织中提取得到的总ＲＮＡ中,通过反转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）得到ｈＢＭＰ－２完整成熟肽基因。将所得的基因片段插入克隆载体ｐＵＣ－１９并转化大肠杆菌ＪＭ１０９,提取重组质粒,酶切并测序。结果：ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳显示：ＰＣＲ产物为一长约４００ｂｐ的带,阳性克隆质粒     

丙型肝炎病毒C蛋白片段的表达及免疫反应性

我们用聚合酶链反应技术,将长度为201ｂｐ、402ｂｐ及591ｂｐ的丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)核心抗原编码区ｃＤＮＡ片段在ｐＵＣ19ＵＫＨＣＶＣＯＲＥ中扩增,在内套引物两端分别引入ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切位点,ＰＣＲ产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后,用ＱＩＡｐｒｅＳｐｉｎ?..     

先天性巨结肠RET基因的突变

酪氨酸激酶受体基因（ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ，ＲＥＴ基因）被定位于染色体１０ｑ１１．２上，其突变可导致３种多发性内分泌瘤综合征和先天性巨结肠的发生。为了探讨ＲＥＴ基因突变在先天性巨结肠发病中的作用，采用多聚酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）及单链ＤＮＡ构象多态性分析（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ）的方法，对３４例散发先天性巨结肠基因组ＤＮＡ进行ＲＥＴ基因第６外显子突变筛查，并对电泳条带变异的ＰＣＲ产物进行了直接核苷酸序列分析。发现１例为ＧＡＣＴＣＡＧＡＣ→ＧＡＡＴＣＡＡＡＣ碱基突变，导致两个氨基酸发生改变。表明ＲＥＴ基因突变与先天性巨结肠发病有关。