小肠黏膜下层-骨髓间充质干细胞移植治疗陈旧性心肌梗死

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(MSCs)-小肠黏膜下层(SIS)支架复合物移植于陈旧性心肌梗死区域后细胞的存活、支架的降解情况及其对心功能的影响。方法将16只黑山羊按随机数字表法分为两组,每组8只。实验组:建立心肌梗死模型,抽取自体骨髓,经体外分离MSCs,进行培养、传代、BrdU标记、与SIS支架复合,并于心肌梗死6周时将MSCs-SIS复合物补片移植至陈旧性心肌梗死区;对照组:建立心肌梗死模型。于移植后6周行超声心动图、HE染色及免疫组织化学检测。结果 MSCs-SIS植入心肌梗死区2周时在补片区可见大量炎性细胞浸润;6周时淋巴细胞浸润消失,SIS部分降解,移植区见大量移植细胞存活。MSCs-SIS植入体内后6周时,实验组每搏输出量(42.81±4.91mlvs.37.06±4.75ml)、射血分数(59.20%±5.41%vs.44.56%±4.23%)、室壁增厚率(54.51%±8.60%vs.43.36%±8.91%)、舒张期E峰(54.85±6.35cm/svs.43.14±4.81cm/s)显著高于对照组(P0.05),左心室收缩期末容积(29.75±5.98mlvs.46.25±6.68ml)、舒张期末容积(72.55±8.13mlvs.83.31±8.61ml)显著低于对照组(P0.05)。结论 SIS作为支架移植MSCs有利于移植细胞存活,对陈旧性心肌梗死后心功能有明显的改善作用。     

建立黑山羊陈旧性心肌梗死模型的新方法

目的建立能长期存活的山羊心肌梗死实验模型。方法16只黑山羊,体重15~24kg,3~6月龄,雌雄不拘。均行剑突下切口,倒V字形切开胸骨下段,于左冠状动脉前降支中下1/3用5-0prolene线8字缝合包绕伴行静脉,阻断5min,再间歇3min,重复两次进行缺血预适应,然后结扎左冠状动脉及伴行静脉,建立羊心肌梗死模型。描记心电图,于建模前及建模后1、3、6、12、24、48h抽血检测血清肌酸激酶同工酶(creatinekinase-MB,CK-MB)及脂肪酸结合蛋白;并于模型建立后6周行心电图、超声心动图、选择性左冠状动脉造影、透射电镜及心肌梗死面积测定。结果造模过程中无实验动物死亡,造模成功率为100%。CK-MB于建模后3h开始升高,12h达高峰;脂肪酸结合蛋白于建模后1h开始升高,12h达高峰。建模后结扎点下方心肌逐渐出现片状紫红色区域,心电监测仪提示、、V3导联明显ST段上抬及T波改变,建模后6周,相应导联均出现明显病理性Q波;心脏超声检查显示左心室腔明显扩大并见室壁瘤形成;选择性左冠状动脉造影检查见心尖区血管纤细,外形呈瘤样扩张。透射电镜见梗死区肌丝溶解、断裂,排列混乱,细胞器崩解聚集。心肌梗死面积为4.74±0.78cm2。结论黑山羊是建立心肌梗死模型较好的实验动物;经剑突下切口,倒V字形切开胸骨下端入路,结扎左冠状动脉前降支中下1/3,是建立能长期存活的陈旧性心肌梗死模型简便、安全可靠的方法。     

冻存对组织工程骨膜生物活性的影响

目的 观察冻存复苏过程对组织工程骨膜生物学特性的影响.方法 体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),与猪小肠黏膜下层(SIS)构建组织工程骨膜.冻存后复苏培养,扫描电镜(SEM)观查复苏后种子细胞生长状况、噻唑蓝(MTT)比色法绘生长曲线、钙-钴法检测碱性磷酸酶(ALP)、生物化学法定量分析ALP的表达.结果 冻存复苏后BMSCs仍能在SIS上保持良好的生长状况;组织工程骨膜复苏后成骨诱导培养5d时ALP含量达峰值,10～15d时稳定在较低的量,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05). 结论组织工程骨膜冻存复苏后仍保持较稳定的生物活性.     

糖尿病对心肌冠状动脉侧支循环形成的影响

心肌梗死(MI)是糖尿病常见的心脏合并症,MI在糖尿病患者中的病死率较无糖尿病的患者高3倍～4倍[1]。此外,心力衰竭和再梗死的发生率在合并糖尿病的MI患者中也明显增加。冠状动脉侧支循环的形成可为缺血心肌提供侧支血流,MI患者有无良好的心肌侧支循环与其预后密切相关[2]。本实     

大网膜联合组织工程心肌移植改善心肌梗死后大鼠心功能

目的 将骨髓间充质干细胞(MSCs)种植于共聚乙交酯-丙交酯(PLGA)补片上构建组织工程心肌(EHT),在大鼠心肌梗死模型上观察大网膜增加EHT血供,改善微环境后对心脏间质胶原重塑及心功能的影响,为心肌梗死的外科治疗提供新的途径. 方法 结扎SD大鼠左冠状动脉,制作心肌梗死模型.以大鼠MSCs为种子细胞构建EHT,将符合心肌梗死标准的18只鼠随机分成3组,每组6只,A组:网膜包裹EHT;B组:单纯EHT移植;对照组:单纯心肌梗死;另设假手术组(n=6):仅开胸,不结扎冠状动脉及EHT移植.EHT植入后4周,用二维超声心动图检测心功能,彩色室壁运动(CK)方法检测梗死部位心室壁运动,取标本做天狼猩红染色在光学显微镜下观察心肌改变. 结果 A组EHT植入后4周部分PLGA纤维降解,梗死部位心肌间质胶原含量较B组和对照组明显减少(P<0.05).CK检查显示A组梗死部位心室壁运动较B组和对照组明显改善(P<0.05);A组左心室收缩期末内径(LVESD)和左心室舒张期末内径(LVEDD)较对照组和B组明显减小(P<0.05),左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短分数(LVFS)较对照组和B组明显增大(P<0.05). 结论 大网膜包裹MSCs-PLGA构建的EHT覆盖于梗死心肌表面能改善心肌梗死后间质胶原重塑和梗死部位心室壁运动,有利于心功能的恢复.     

组织工程骨膜及脱蛋白骨修复兔桡骨大段骨缺损的早期观察

[目的]比较组织工程骨膜及脱蛋白骨对兔桡骨大段骨缺损的早期修复效果,研究组织工程骨膜移植修复大段骨缺损的可行性。[方法]分离兔骨髓间充质干细胞体外诱导增殖,制成细胞悬液接种于猪小肠黏膜下层表面,构建组织工程骨膜。3个月龄新西兰大白兔24只,随机分为3组各8只,手术制备单侧桡骨干30 mm骨膜-骨缺损模型,A组缺损区植入组织工程骨膜骨修复,B、C组则分别以猪小肠黏膜下层和脱蛋白骨作为对比。术后4周,行X线检查并杀取标本予以组织学染色及评分。[结果]经放射学和组织学观察,在A组中缺损区可见大量新骨形成并桥连两缺损端;而在B组和C组中无明显新骨产生。[结论]使用组织工程骨膜修复同种异体兔桡骨大段骨缺损是可行的,且明显优于脱蛋白骨。     

骨髓间质干细胞移植对香猪急性心肌梗死后心肌结构和心功能的影响

目的 移植自体骨髓间质干细胞(BMSCs)到香猪急性心肌梗死区内,研究移植BMSCs对心肌结构和心功能的影响. 方法将24只贵州香猪采用计算器随机法分为实验组(n＝12)和对照组(n＝12),抽取香猪自体骨髓,经体外分离出BMSCs并培养和经5-氮胞苷(5-azacytidine)转化,利用结扎左前降支(LAD)的方法建立急性心肌梗死动物模型,经LAD和梗死区多点注射的方法将实验组香猪注射BMSCs(细胞总数2×106个),对照组注射等量的细胞培养液.3周和6周后,用超声心动图(UCG)观察两组移植后心肌结构和心功能改变的情况. 结果实验组左心室射血分数、左心室短轴缩短率和室壁增厚率明显高于对照组;左心室室壁、室间隔厚度和心室腔的大小在两组之间也存在明显差别,实验组室壁和室间隔厚度明显大于对照组,而心室腔小于对照组. 结论 BMSCs梗死区心肌移植后可减轻心室重构的进程,减轻心肌的变薄程度,使心室腔未明显扩大.BMSCs移植还可增加心肌的收缩力,改善心功能.     

组织工程补片膀胱扩大术治疗神经源性膀胱的疗效分析

目的 探讨使用小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)组织工程材料补片行膀胱扩大术治疗神经源性膀胱的可行性和有效性. 方法 2011年1月至2014年3月收治14例神经源性膀胱患者,男10例,女性4例.年龄14～65岁,平均29岁.脊髓发育不良8例,脊髓损伤6例.尿动力学检查:最大膀胱测压容量平均为(150.1±64.2) ml,膀胱顺应性平均为(5.2±3.9)ml/cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa),最大逼尿肌压力平均为(44.1±29.2) cmH2O.14例均接受SIS组织工程补片膀胱扩大术,术中将补片锁边缝合至纵向剖开的膀胱浆肌层,达到扩大膀胱的目的,其中7例同期行输尿管抗反流再植术.对术后并发症、影像尿动力学检查参数、尿路核磁水成像及肾功能进行观察评价. 结果 本组14例手术均顺利完成,手术时间平均为120 min.患者术后无代谢紊乱.复查肌酐水平均正常.术后随访6～48个月,平均24个月.尿动力学检查术后6、12、24个月最大膀胱测压容量分别为(274.9±88.7)、(322.5± 144.4)、(279.9± 157.9) ml,与术前比较差异有统计学意义(P＜0.05);术后12、24个月最大逼尿肌压力为(20.1±9.8)、(20.2± 19.1) cmH2O,与术前比较差异有统计学意义(P＜0.05);术后24个月膀胱顺应性为(26.1±29.4) ml/cmH2O,与术前比较差异有统计学意义(P＜0.05).术后1个月,2例出现膀胱吻合口尿外渗,更换导尿管引流通畅后愈合.术后3个月,1例出现膀胱结石,行经尿道取石术后未再复发.术后12个月,4例出现膀胱输尿管反流,其中2例予膀胱逼尿肌A型肉毒素注射术,术后留置尿管3个月复查反流消失;2例保留导尿,口服琥珀酸索利那新(5 mg,2次/d)和酒石酸托特罗定(4 mg,1次/d)6个月后,1例反流消失,1例仍存在反流.结论 SIS组织工程补片用于膀胱扩大术可达到有效增加膀胱容量的目的.生物工程补片的使用为治疗神经源性膀胱提供了新的选择.     

淫羊藿苷对衰老骨髓间充质干细胞成骨的影响

目的 探究淫羊藿苷（icarrin,Ica）对D-半乳糖(D-gal)诱导的衰老骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨的影响及机制。方法 通过全骨髓贴壁法提取BMSCs,采用流式细胞术及成骨、成脂诱导分化鉴定细胞。通过CCK8法检测D-gal及Ica处理BMSCs的最适浓度,用D-gal诱导BMSCs衰老,药物干预48 h;6SA-β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况;碱性磷酸酶试剂检上清液ALP水平;RT-PCR和Western Blot分别检测BMSCs中衰老相关P16、P53、P21及成骨相关Foxo3a、β-catenin的蛋白表达。结果 BMSCs表面标志物CD44和CD90表达大于95%;CD34、CD45表达小于5%,且能被定向诱导分化出钙结节及脂滴,鉴定细胞为BMSCs。CCK8检测出30 mg/mL为D-gal的最适浓度,10-8、10-10 mol/L为Ica最适浓度。Ica能减少衰老BMSCs中P16、P53、P21 mRNA的表达;降低Foxo3a mRNA和蛋白表达,增加β-catenin mRNA和蛋白的表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 D-gal能够诱导构建出衰老BMSCs模型;Ica增加了衰老BMSCs上清液中的ALP含量、降低了衰老BMSCs中 P53的表达水平,可能通过调节成骨相关信号通路Foxo3a/β-catenin表达,起到对衰老BMSCs成骨分化能力的改善作用。     

富血小板血浆对青山羊骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对体外培养的中国青山羊骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）增殖和成骨分化的影响,探讨PRP促进骨修复的细胞学机制。方法将体外培养第3代中国青山羊MSCs,分为对照组（单纯血清培养组）和PRP组（加入10%PRP复合培养）,通过相差显微镜观察细胞生长情况,于2、4、6、8d采用MTT法检测细胞增殖活性。将体外培养的第3代细胞分为对照组、地塞米松组（dexamethasone,DEX）组、PRP组,于培养第7天行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、第18天行矿化结节染色检测细胞成骨分化活性。结果相差显微镜下见PRP组细胞最先达到汇合,MTT法显示PRP组2、4、6、8d的平均吸光度（A）值分别为0.252±0.026、0.747±0.042、1.173±0.067、1.242±0.056明显高于对照组（A值分别为0.137±0.019、0.436±0.052、0.939±0.036、1.105±0.070）（P〈0.01）。与对照组比较,PRP组ALP阳性细胞数增多,矿盐沉积减少;DEX组ALP阳性细胞数减少,矿化结节形成明显增多。结论PRP能明显促进中国青山羊MSCs增殖,抑制MSCs向成骨细胞分化。     

骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白封闭剂体内构建可注射性组织工程软骨

目的 探讨利用人骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）与可注射性纤维蛋白封闭剂（fibrinsealant，FS）复合，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。方法 体外分离扩增健康人MSCs，以含有转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）、地塞米松、维生素C的培养基进行成软骨诱导，诱导第7、14天分别检测软骨细胞特异的生物学特性。将诱导7d的MSCs与FS复合，接种于裸鼠背部皮下作为实验组，同时设单纯只注射FS或MSCs的支架对照组和细胞对照组。分别于接种后6、12周取材进行大体观察，行HE、阿尔新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色评价其成软骨能力。结果 MSCs以特定的培养基诱导后由纺锤形变为多角形，并表达软骨细胞分泌的基质。复合物接种6和12周后，实验组均可形成软骨样组织块，6周时形成的组织块较小而质地柔韧，陷窝清楚，可检测到阳性阿尔新蓝及Ⅱ型胶原表达；12周形成的组织块较大，质地较硬，表面光滑，软骨细胞位于成熟的陷窝中，阿尔新蓝及Ⅱ型胶原免疫组化阳性染色较6周增强。两个对照组均无软骨样组织块形成。结论 MSCs复合FS可以作为一种较优良的可注射性组织工程软骨的构建方法。     

增强型绿色荧光蛋白标记技术对骨折后骨髓间充质干细胞的迁移示踪

目的采用增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)标记技术,对外源性骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)迁移至骨折区域进行示踪,为骨修复中干细胞作用机制的研究创造条件。方法EGFP标记日本大耳白兔MSCs,部分标记细胞经成骨诱导培养后检测其细胞表型。另取日本大耳白兔18只制成双侧尺骨骨折模型,随机分为实验组与对照组,每组9只,分别于术前24h、术后1和24h,将扩增的标记MSCs和未标记MSCs以1×107个/kg剂量分别注入实验组和对照组的耳缘静脉;术后48h处死动物,取左侧尺骨断端组织行冰冻切片、荧光显微镜观察,右侧样本组织固定后行石蜡切片、HE染色、光镜观察。结果MSCs培养后分化及表型良好,标记MSCs仍具有较快的增殖能力,经成骨诱导培养后,可表达碱性磷酸酶,并具有钙结节形成能力;兔体内实验术后48h动物均存活,HE染色见骨折断端为血肿组织。术前24h、术后1和24h静脉注入标记细胞后均可在骨断端组织中观察到EGFP阳性细胞,而对照组则未见EGFP阳性细胞。结论兔MSCs经EGFP标记后仍然具有成骨细胞诱导能力;EGFP示踪技术提示,静脉途径给予标记的MSCs可以迁移聚集到骨折区域的血肿组织内。     

骨形成蛋白2基因修饰的老年大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的观察年龄因素对骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)成骨分化能力的影响;了解基因治疗对老年大鼠MSCs成骨分化能力的影响. 方法 1月龄(幼年组)、9月龄(成年组)及24月龄(老年组)雄性Wistar大鼠各6只,取MSCs经体外分离、培养及携带骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒载体(Ad-BMP-2)转染后,定量检测BMP-2、碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)表达,以及成骨细胞标志性蛋白:Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨桥素(osteopontin, OPN)的表达.将转染的各组MSCs分别与磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)复合后植入裸鼠体内,3周后取材,比较各组诱导异位成骨能力. 结果 ELISA检测表明BMP-2基因修饰的MSCs可以有效表达BMP-2,且表达量在各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05);各组ALP于诱导后第9天达高峰,但组间差异均无统计学意义(P＞0.05);诱导后第7天,RT-PCR半定量检测示各组均有成骨细胞特征性蛋白,即:Ⅰ型胶原、OPN及BSP的明显表达,表达量在各组间差异无统计学意义(P>0.05);BMP-2基因转染的MSCs与TCP复合后可诱导裸鼠体内异位成骨,各组成骨量差异无统计学意义(P>0.05). 结论 BMP-2基因修饰的老年大鼠MSCs可以恢复成骨分化能力,基因治疗可能为老年性骨骼疾病提供一种新的治疗途径.     

骨形成蛋白2活性多肽体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的剂量依赖性研究

目的探讨自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)活性多肽对大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)体外定向诱导成骨的能力,评价BMP-2活性多肽的成骨诱导性及诱导成骨的剂量依赖性。方法取4周龄Wistar大鼠分离培养MSCs,传至第3代时改用条件培养基,培养基中分别加入浓度为300、200、100、50及0μg/ml的BMP-2活性多肽,并依次记为A、B、C、D和E组。细胞培养至5、10、15及20d,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,测定钙含量,采用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitativePCR,FQ-PCR)检测型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA的表达,检测不同浓度BMP-2活性多肽体外诱导成骨的能力。结果倒置相差显微镜下观察,用条件培养基培养3～4d后,培养细胞由长梭形转变为短梭形或多角形。随条件培养基中BMP-2活性多肽浓度的增加,细胞发生成骨样改变的时间提前。ALP活性和钙含量检测显示,A组和B组较其他组增加明显,且差异有统计学意义(P<0.05),但A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。FQ-PCR检测发现不同浓度条件培养基培养14d后,型胶原、OPN和OCN mRNA在各组均有表达。Ct值表明其表达量的大小顺序为A、B、C、D组,E组无表达,A组和B组的Ct值明显大于C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05),但A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论BMP-2活性多肽能有效地促进MSCs向成骨方向分化,其诱导作用存在剂量依赖关系,最佳诱导剂量为200μg/ml。     

C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞的体外优化培养和酒精及其代谢物毒性效应的探讨

目的建立C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)的体外分离和培养体系,探讨酒精及其代谢物对MSCs的毒性。方法从C57/BL6小鼠的股骨骨髓中分离MSCs,通过优化细胞的培养方法进行有效培养、传代,最终获得纯度较高的MSCs,并对第4代细胞进行CD90和CD34免疫组织化学染色鉴定。对第2代细胞以4×105个/ml密度接种于96孔板,每孔200μl,第2天以用乙醇及乙醛进行染毒,剂量设计为乙醇5.7、17.0、50.0、100.0、150.0mmol/L,乙醛4.5、0.9、0.18、0.036、0.0072、0.00144、0.000288mmol/L,对照组为MSCs以不加乙醇及乙醛的10%胎牛血清的α-MEM培养液培养。3d后MTT检测细胞增殖活性。结果MSCs在前6代表现出较好的稳定性和旺盛的自我增殖能力,免疫组织化学染色显示第4代MSCsCD90呈阳性、CD34呈阴性。MTT检测乙醇在17.0、100.0及150.0mmol/L时出现细胞增殖抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);乙醛>0.18mmol/L时随着浓度增加细胞增殖力减弱,在4.5mmol/L时出现了细胞增殖抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论优化培养体系能有效分离和培养MSCs,乙醇和乙醛均能抑制其增殖,表现出毒性作用,乙醛的毒性作用较乙醇强,其造成的损伤更不容忽视。     

成人骨髓间充质干细胞体外低氧培养及生物学特征

目的建立人骨髓间充质干细胞（human marrow mesenchymal stem cells,hMSCs）体外低氧培养及向成骨细胞分化的生物模型,研究其生物学特征,为骨组织工程提供实验依据。方法采用人淋巴细胞分离液分离健康成人hMSCs,DMEM-LG（含20%胎牛血清）中培养,10～14d后传代培养。取第2代细胞,根据培养氧浓度及培养基类型分为4组：正常氧组（20%O2加DMEM-LG,A组）、低氧组（1%O2加DMEM-LG,B组）、正常氧成骨诱导组（20%O2加条件培养基,C组）及低氧成骨诱导组（1%O2加条件培养基,D组）,通过细胞计数、细胞增殖测定（MTT法）、集落形成检测、RT-PCR检测、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测及茜素红染色,研究低氧环境对hMSCs生物学行为的影响。结果与A组相比,B组及D组中的hMSCs有较高的增殖速度,并且不受条件培养基的影响,比较差异有统计学意义（P〈0.01）。B组中的hMSCs生成的集落逐渐增多,A组9d后生成的集落数基本不发生变化。D组培养的hMSCs的ALP活性逐渐增高,但明显低于C组,两者差异有统计学意义（P〈0.01）。定量RT-PCR检测,C组ALP、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白及骨粘连蛋白mRNA表达量明显增加（P〈0.01）。培养4周后,与其他3组相比,C组可见到明显的钙盐沉积和染成红色的钙结节。结论低氧使hMSCs增殖率增加,集落形成能力增强,抑制向成骨细胞分化。     

成人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的研究

目的研究成人骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）体外分化为血管内皮细胞的能力并探讨其诱导条件。方法分离成人骨髓单个核细胞，经贴壁法获取MSCs。所获细胞分4组进行诱导：组1、2以5×10^3／cm^2细胞密度接分别接种于含2％和15％胎牛血清的L—DMEM培养基；组3、4以5×10^4／cm^2细胞密度分别接种于上述两种血清浓度的培养基，各组细胞经血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）辅以牛脑提取物的诱导，对照组为正常传代培养的MSCs。在诱导的第14、21天分别测定表面分子CD34、VEGFR-2、CD31和Ⅶ因子相关抗原（factor Ⅷ—related antigen，又称von Willebrand factor，vWF）以及体外成血管实验对分化细胞进行鉴定，同时测定不同诱导条件下的细胞增殖指数（proliferation index，PI）。结果组3细胞经诱导后，内皮系表面分子CD34、VEGFR-2、CD31、vWF于第14天均有不同程度表达，分别为8．5％、12．0％、40．0％、30．0％．其中CD34、VEGFR-2在第21天表达上调，为15．5％、20．0％，余各诱导组细胞未表达上述表面分子；诱导后的组3细胞呈低增殖状态（PI值约为10．4％），在半固体培养基中还可形成血管腔样结构。结论从成人骨髓中分离培养的MSCs，在较高细胞接种密度和低增殖状态下，经VEGF、牛脑垂体提取物诱导后，可分化为血管内皮细胞，可作为治疗性血管生成及组织工程理想的种子细胞。     

自体骨髓间充质干细胞与外源性透明质酸钠修复兔膝关节软骨缺损的研究

目的探讨全层软骨缺损修复效果与关节腔内骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)来源数量的相关性,了解体内条件下外源性透明质酸钠(sodium hyaluronate,SH)能否促进体外培养扩增的MSCs聚集到软骨缺损处. 方法 4月龄日本大耳白兔66只,用手摇钻制成直径5 mm、深4 mm的圆柱形膝关节软骨缺损.从兔股骨提取MSCs, 经体外培养Brdu标记后,单独或与SH一起注射到自体软骨损伤关节腔中.实验动物共分4组:A组(n=15),同时注射SH和兔自体MSCs;B组(n=15),单独注射自体MSCs;C组(n=18),单独注射SH;D组(n=18),不给治疗措施.术后5、8和12周,行大体、组织学、免疫组织化学观察及修复组织厚度测定. 结果术后5、8和12周,修复组织厚度A组与B组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);A组与C组比较及B组与D组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).组织学观察显示,修复组织A组以纤维软骨为主,B组以纤维组织为主.两组免疫组织化学染色缺损部位均未见到Brdu标记物. 结论关节腔内注入体外培养扩增的MSCs,不能促进软骨缺损修复.外源性SH对软骨缺损的修复有一定作用,但不能将MSCs聚集到缺损处和提高其趋化能力.     

辛伐他汀对幼鼠骨小梁中骨形成相关因子表达以及BMSCs成骨分化的影响

目的既往研究表明辛伐他汀具有促成骨作用,现探讨辛伐他汀对幼鼠骨小梁中骨形成相关因子表达以及BMSCs成骨分化的影响。方法 40只1周龄雄性SD大鼠,体重17.5～19.5 g,随机分为2组,每组20只。实验组于大鼠颈部皮下注射辛伐他汀注射液[5 mg/(kg.d)],对照组同法注射等剂量生理盐水。于注射后1、3周,两组分别脱颈处死10只大鼠,采用免疫组织化学染色检测胫骨上端骨小梁BMP-2、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、VEGF的表达情况。注射后1、3周,两组分别取大鼠双侧股骨,采用全骨髓培养法体外分离培养BMSCs,取第1代BMSCs成骨诱导培养,培养后14 d行ALP染色,培养后21 d采用实时荧光定量PCR检测BMP-2、Runx2、Osterix、Msx2、Dlx3、Dlx5 mRNA的表达,培养后28 d行von Kossa染色。结果免疫组织化学染色示注射后1、3周两组胫骨上端骨小梁BMP-2、MMP-13、VEGF表达,差异均无统计学意义(P>0.05)。成骨诱导培养14 d,注射后1、3周两组ALP染色阳性细胞百分比差异均无统计学意义(P>0.05);成骨诱导培养21 d,实时荧光定量PCR检测示注射后1、3周两组BMP-2、Runx2、Osterix、Dlx3、Dlx5、Msx2 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05);成骨诱导培养28 d,注射后1、3周两组钙结节单位面积比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论皮下注射辛伐他汀5 mg/(kg.d)后1、3周对幼鼠骨小梁中骨形成相关因子表达以及BMSCs成骨分化无明显影响。