人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4的原核表达及鉴定

【目的】构建表达人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4融合蛋白的重组体。【方法】用RT-PCR从HL-60细胞中扩增细胞周期蛋白D1及CDK4基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体上。测序鉴定后切下相应的片段,连接到表达载体pET-22b(+)上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DL3),使之高效表达融合蛋白细胞周期蛋白D1及CDK4。SDS-PAGE电泳及Westernblotting鉴定表达蛋白。【结果】用PCR扩增得到了正确的目的基因片段并构建成pET-cyclinD1和pET-CDK4两个原核表达载体。将其转化大肠杆菌,Westernblot检测证实了转化的大肠杆菌能表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。【结论】本研究成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4原核表达载体,后两者在细胞内能正确表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。     

鼻咽癌细胞中外源性p16表达对CDK4,Cyclin D1及pRb的影响

目的：分析外源性ｐ１６表达对ＣＤＫ４,Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１及ｐＲｂ的影响,探讨其抑制细胞生长的机制。方法：绘制生长曲线,比较细胞倍增时间,分析ＨＮＥ１,＃４－２及＃３－２克隆中细胞增殖状况;利用流式细胞仪分析上述细胞中细胞周期分布的改变;结合Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ方法,分析外源性ｐ１６表达对ＣＤＫ４,Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１及ｐＲｂ的影响。结果：生长曲线示,ＨＮＥ－１倍增时间为２３．４ｈ,＃３－２和＃４     

Cyclin D1／CDK4在ω-3脂肪酸和视黄酸抑制HL-60细胞增殖中的作用

目的研究Cyclin D1／CDK4在ω-3脂肪酸和视黄酸抑制HL-60细胞增殖过程中的作用。方法HL-60细胞经全反式视黄酸(ATRA)和二十二碳五烯酸(EPA)处理一定时间后，MTr比色法测定细胞增殖功能；RT—PCR分析ATRA和EPA对HL-60细胞Cyclin D1、CDK4、CDK2mRNA表达的影响；Western blot分析CDK4和P15蛋白质表达水平。结果ATRA或EPA单独处理均能抑制HL-60细胞生长，下调节HL-60细胞Cyclin D1、CDK4mRNA和CDK4蛋白的表达，上调P16蛋白的表达，二者联合处理时上述变化更明显，而ATRA和／或EPA对CDK2 mRNA表达无明显影响。结论ATRA和EPA可能通过下调节Cychn D1、CDK4的表达，上调节P16的表达，导致Cyclin D1／CDK4复合物的活性下降，细胞生长被阻断在G1／G0期，从而发挥它们对HL-60细胞增殖抑制作用。     

细胞周期蛋白D1与胃癌

细胞增殖周期失控是恶性肿瘤呈现无限制增殖的重要原因 ,研究显示细胞周期正调及负调因子表达紊乱与人类胃癌的发生、发展密切相关。调控细胞周期诸多因素的核心是细胞周期蛋白 (ｃｙｃｌｉｎ)与细胞周期蛋白激酶 (ｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ ,ＣＤＫ) ,与肿瘤关系最密切者为ｃｙｃｌｉｎＤ。目前 ,ｃｙｃｌｉｎＤ基因已被认为是一种原癌基因 ,它与胃癌发生、发展关系的研究正在不断深入。1　ｃｙｃｌｉｎＤ的结构与表达ｃｙｃｌｉｎＤ有 3种即ｃｙｃｌｉｎＤ1、ｃｙｃｌｉｎＤ2和ｃｙｃｌｉｎＤ3,蛋白依次为 11ｑ13的ＣＣ…     

小细胞淋巴瘤细胞周期蛋白D1的表达及意义

目的 探讨小细胞淋巴瘤中细胞周期蛋白D1的表达及意义。方法 用免疫组化方法对31例石蜡包埋的小细胞淋巴瘤组织进行CD20、CD45RO及细胞周期蛋白D1检测。结果 28例为B细胞性淋巴瘤,其中5例细胞周期蛋白D1呈阳性表达（17．86％）,且结内、结外型表达无显著差异（P＞0．05）,为套细胞淋巴瘤;3例为T小细胞性淋巴瘤,细胞周期蛋白D1表达呈阴性。结论 细胞周期蛋白D1是套细胞淋巴瘤最具特征性的表达蛋白,是与其他小细胞淋巴瘤鉴别和确诊的重要指标,对治疗和预后有重要的指导作用。     

紫草素抗雌激素对人乳腺癌MCF-7细胞周期蛋白D1表达的影响

目的 探讨紫草素(shikonin,SK)在雌激素作用下对人乳腺癌MCF-7细胞周期蛋白(cyclin D1)表达的影响。方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,不同浓度的紫草素及在雌激素干预下作用于细胞后,通过免疫组织化学技术、Western blot法检测cyclin D1蛋白的表达变化。结果 与空白对照组比较,雌二醇组cyclin D1表达量显著增多,SK各组表达含量显著降低,且cyclin D1蛋白表达量随SK浓度升高逐渐被抑制(P<0.05);雌二醇干预后,SK对cyclin D1蛋白量的表达同样具有抑制作用(P<0.05)。结论 SK能降低MCF-7细胞中cyclin D1蛋白水平表达,具有浓度依赖性,并且对雌激素上调cyclin D1表达具有明显的抑制作用。     

P16，CDK4及eyelin D1在粤东地区食管癌中的表达及意义

目的研究抑癌基因蛋白P16与细胞周期调控蛋白CDK4，cyelin D1在粤东地区食管癌高发地区患者的表达情况，寻找对临床诊治有价值的食管癌分子指标。方法利用免疫组化SP法对粤东地区10例正常食管黏膜和45例食管癌标本进行P16，CDK4及eyelin D1蛋白的检测。结果P16，CDK4及eyclin D1在10例食管正常黏膜中均有低水平散在表达，而在45例食管癌中，P16表达总阳性率为60．0％（27／45），CDK4表达总阳性率为64．4％（29／45），cyelin D1表达总阳性率为55．5％（25／45），P16和CDK4在中、低分化食管癌组间的表达率差异有显著性（P=0．031，P=0．030），P16和CDK4表达呈负相关（P=0，005）；P16，CDK4及cyelin D1表达与肿瘤浸润范围、淋巴结转移无显著相关性。结论P16在食管癌中呈现独特性的高水平表达，P16和CDK4表达与肿瘤分化程度相关，并且提示P16和CDK4间存在负反馈调控通路。P16和CDK4可以作为粤东地区食管癌的有效分子标志物，在食管癌早期筛选和临床诊治中有重要价值。     

小细胞淋巴瘤细胞周期蛋白D1的表达及意义

目的探讨小细胞淋巴瘤中细胞周期蛋白D1的表达及意义。方法用免疫组化方法对31例石蜡包埋的小细胞淋巴瘤组织进行CD20、CD45RO及细胞周期蛋白D1检测。结果28例为B细胞性淋巴瘤,其中5例细胞周期蛋白D1呈阳性表达(17.86%),且结内、结外型表达无显著差异(P>0.05),为套细胞淋巴瘤;3例为T小细胞性淋巴瘤,细胞周期蛋白D1表达呈阴性。结论细胞周期蛋白D1是套细胞淋巴瘤最具特征性的表达蛋白,是与其他小细胞淋巴瘤鉴别和确诊的重要指标,对治疗和预后有重要的指导作用。     

P16,CDK4及cyclin D1在粤东地区食管癌中的表达及意义

目的研究抑癌基因蛋白P16与细胞周期调控蛋白CDK4,cyclin D1在粤东地区食管癌高发地区患者的表达情况,寻找对临床诊治有价值的食管癌分子指标。方法利用免疫组化SP法对粤东地区10例正常食管黏膜和45例食管癌标本进行P16,CDK4及cyclin D1蛋白的检测。结果P16,CDK4及cyclin D1在10例食管正常黏膜中均有低水平散在表达,而在45例食管癌中,P16表达总阳性率为60.0%(27/45),CDK4表达总阳性率为64.4%(29/45),cyclin D1表达总阳性率为55.5%(25/45),P16和CDK4在中、低分化食管癌组间的表达率差异有显著性(P=0.031,P=0.030),P16和CDK4表达呈负相关(P=0.005);P16,CDK4及cyclin D1表达与肿瘤浸润范围、淋巴结转移无显著相关性。结论P16在食管癌中呈现独特性的高水平表达,P16和CDK4表达与肿瘤分化程度相关,并且提示P16和CDK4间存在负反馈调控通路。P16和CDK4可以作为粤东地区食管癌的有效分子标志物,在食管癌早期筛选和临床诊治中有重要价值。     

甲状腺肿瘤中细胞周期蛋白D1、pRb的表达

应用免疫组织化学染色法检测甲状腺肿瘤中细胞周期蛋白 (Cyclin D1)、视网膜母细胞瘤蛋白 (p Rb)的表达水平。结果发现在 115例组织切片中 ,甲状腺癌组与非毒性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、滤泡性腺瘤及正常甲状腺组织组的 Cyclin D1、p Rb表达率比较具有显著性差异 (P<0 .0 5 ) ;乳头状癌组 Cyclin D1的表达率与滤泡性癌组比较具有显著性差异 (P<0 .0 5 ) ,p Rb的表达无差异性 ;甲状腺癌不同的分期比较 , 期中 Cyclin D1的表达水平与 、 、 期比较具有显著性差异 (P<0 .0 5 ) ,p Rb的表达无差异性。提示 :Cyclin D1、p Rb表达水平的检测可作为判断甲状腺肿瘤良恶性有价值的参考指标 ;同时 Cyclin D1的检测可对甲状腺癌的恶性程度及其组织学类型提供进一步的参考     

应用流式细胞术对胃癌细胞细胞周期蛋白D1、E表达的研究

为了解胃癌细胞周期蛋白（Cyclin)D1、E的表达情况，采用多参数流式细胞技术对手术切除22例胃癌标本和9例正常胃粘膜标本的CyclinD1、CyclinE的表达含量进行检测分析。结果显示，肿瘤组织有不同程度的CyclinD1,CyclinE的异常表达（分别为40．90％和59．09％），且CyclinE的表达在胃癌淋巴结转移阳性组显著高于淋巴结转移阴性组。提示胃癌细胞的CyclinD1，CyclinE的异常表达是胃癌发生、发展过程中的一个重要的分子事件；CyclinE的检测可望成为临床上评估胃癌淋巴结转移的指标之一。     

PTD-Cyclin D1融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:通过PCR方法扩增出Cyclin D1基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD的下游构建重组质粒pET16b-PTD-CCND1,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:构建了重组融合表达质粒pET16b-PTD-CCND1,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr 38×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的22%,纯化后得到了目的蛋白.结论:成功地克隆了小鼠的Cyclin D1基因并纯化了融合基因PTD- CCND1的原核表达产物.     

胃黏膜癌变过程中细胞周期调控基因Rb、Cyclin D1 及CDK4的表达及其意义

目的研究胃黏膜癌变过程中细胞周期调控基因Rb、Cyclin D1及CDK4的表达及其意义.方法采用免疫组化方法对50例胃癌,18例癌旁肠化生,7例癌旁轻中度不典型增生及9例重度不典型增生组织中细胞周期调控基因Rb、Cyclin D1 及CDK4的表达情况进行检测和比较.结果 Rb基因的过度表达在不典型增生及胃癌中检测到,在胃癌组织中的表达强度明显大于重度不典型增生病变(P<0.05),Cyclin D1 及CDK4的表达仅发现在胃癌组织中,胃癌组织中Cyclin D1表达阳性的13例病例中有5例同时表达Rb,2例同时表达CDK4;Rb阳性的17例胃癌组织中有3例同时表达CDK4.结论 Rb,cyclin D1和CDK4的过度表达可能参与胃癌的发生,Rb的过度表达出现在胃黏膜癌变过程的较早期阶段,Cyclin D1和CDK4的过度表达属于胃癌变过程中的较晚期的基因事件.     

人肿瘤蛋白D52重组融合蛋白的原核表达及特性鉴定

目的:表达人肿瘤蛋白D52(human tumor protein D52,hTPD52)的重组融合蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定?方法:RT-PCR扩增乳腺癌MCF-7细胞中的hTPD52基因并克隆于pMD18-T载体中,测序鉴定序列正确后,分别插入pET-32a?pGEX-4T-2和pET-28a 3种表达载体中?重组质粒经酶切鉴定?序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),选择最佳表达载体和表达条件进行大量表达,表达产物经His柱亲和纯化和超滤浓缩后,应用Dot blot?Western blot鉴定纯化蛋白的特性?结果:正确扩增出了hTPD52基因,鉴定其为isoform 3型?用pET-32a-hTPD52重组表达载体能够大量表达可溶性的hTPD52-Trx融合蛋白,Dot blot显示表达的融合蛋白能和抗hTPD52的抗体结合,SDS-PAGE和Western blot显示表达的融合蛋白分子质量约为44 ku,去除Trx后仍能够与特异性抗体结合?结论:成功制备hTPD52重组融合蛋白,并证明原核表达的hTPD52保留了原有的抗原结合活性?     

细胞周期素D1、CDK4和VEGF在舌鳞状细胞癌中的表达及相互关系研究

目的 探讨细胞周期素D1（cyclin D1）、细胞周期素依赖激酶4（CDK4）和血管内皮生长因子（VEGF）在舌鳞状细胞癌中的表达及其作用。方法采用免疫组织化学方法检测cyclin D1、CDK4和VEGF在39例舌鳞癌和15例正常舌黏膜中的表达情况，分析其与舌鳞癌组织学分级和颈部淋巴结状态之间的关系。结果cyclin D1、CDK4和VEGF在舌鳞癌中的阳性表达率分别为69．2％、61．5％和66．7％．均高于正常舌黏膜，差异均有显著性意义（均P〈0．01），cyclin D1、CDK4和VEGF在舌鳞癌中的表达均有相关性（均P〈0．01），伴有颈部淋巴结转移组的阳性表达率高于无转移组。结论cyclin D1、CDK4和VEGF在舌鳞癌组织中呈过表达，三者之间的相互作用与舌鳞癌增殖、侵袭和转移密切相关。     

肾透明细胞癌与Cyclin D1基因多态性及相关细胞周期蛋白表达的关联研究

目的:探讨肾透明细胞癌中Cyclin D1基因DNA序列的多态性及其相关细胞周期调控蛋白的表达水平。方法:抽提55例肾透明细胞癌标本和24例正常肾组织标本中的基因组DNA,PCR扩增Cy-clin D1的4号外显子的基因组DNA片段,并行限制性片段长度多态性分析,统计Cyclin D1第242号密码子多态性的分布比例。Western Blot法检测Cyclin D1基因多态性对Cyclin D1、Cdk6和pRb的表达水平以及对pRb磷酸化水平的影响。结果:55例癌组织中,12例(21.8%)的基因型显示为GG;24例(43.6%)的基因型显示为AG;19例(34.5%)的基因型显示为AA。基因型为AA和AG的肾癌组织,其Cyclin D1表达水平和pRb磷酸化水平显著高于基因型为GG的肾癌组织(P<0.01)。GG型肾癌组织中Cyclin D1的表达水平和pRb磷酸化水平与正常组织相比差异无统计学意义;而AA和AG型肾癌组织中Cyclin D1的表达水平分别达到正常组织的(4.87±2.38)倍和(3.43±1.74)倍。多数AA和AG型肾癌的分级显著高于GG型肾癌的分级(P<0.05),但肾癌分期的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在肾透明细胞癌中,Cyclin D1基因第242号密码子具有多态性,且Cyclin D1的等位基因多态性在很大程度上影响了pRb的磷酸化水平,与肾癌病理分级和预后关系密切。     

食管鳞癌组织中p16、cyclinD1、CDK4的表达

目的：探讨p16、cyclinD1、CDK4蛋白在食管鳞癌发生中的意义及其相互间的作用。方法：采用LSAB免疫组化染色法,对43例食管癌手术标本的p16、cyclinD1、CDK4蛋白进行标记。结果：在鳞癌组织中,3种抗体的阳性物质存在于细胞核中和／或胞浆中,且从正常鳞状上皮→癌旁不典型增生→鳞癌组织,p16的阳性率逐渐下降,而p16、cyclinD1、CDK4的阳性率却逐渐上升。正常皮皮与癌组织之间的阳性率差异均有显著性（P＜0．05）;随着癌分化程度下降,p16阳性率呈下降趋势,Ⅲ级与Ⅰ级鳞癌之间阳性率差异有显著性（P＜0．05）,但未检出cyclinD1、CDK4与癌分化程度的关系。结论：p16、cyclinD1、CDK4蛋白表达的变化是食管癌发生中的早期事件,三者构成的调节通路障碍可能参与了癌的发生。     

BAG-1、CDK4蛋白在结直肠癌中的表达及意义

目的：探讨BAG-1、CDK4蛋白在结直肠癌中的表达及其与结直肠癌临床病理特征的关系。方法：应用免疫组化SP法对80例结直肠癌组织、40例结直肠腺瘤组织及25例癌旁正常结直肠组织中的BAG-1、CDK4进行检测。结果：BAG-1、CDK4在结直肠癌中过度表达,阳性率分别为80．0％（64／80）和65．0％（52／80）,并且BAG-1、CDK4与肿瘤的分化程度成反比。有淋巴结转移的结直肠癌BAG-1、CDK4的阳性率分别为96．7％（29／30）和83．3％（25／30）．无淋巴结转移的结直肠癌阳性率分别为70．0％（35／50）和54．0％（27／50）,两者比较,差异有高度统计学意义（P〈0．01）。侵及浆膜层者CDK4蛋白表达阳性率明显高于未侵及浆膜层者,阳性率分别为71．4％（40／56）和35-3％（12／34）,差异有高度统计学意义（P〈0．01）。结论：BAG—1、CDK4的过度表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移密切相关;CDK4的过度表达还与浸润深度密切相关;结直肠癌的发生机制涉及BAG-1、CDK4调节环路中多个基因的异常。