bFGF对神经干细胞分化为星形胶质细胞的影响

 目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠脊髓来源神经干细胞分化形成星形胶质细胞亚型的影响。方法：悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定神经干细胞。把神经干细胞分为A、B两组,A组加入血清,B组加入血清和bFGF,分化培养7 d后,GFAP抗体标记星形胶质细胞,观察其各亚型的比率和形态特点。结果：神经干细胞分化第7d,A组和B组均形成4种亚型星形胶质细胞,分别为胞体延长型,扁平多角形,星形和双极型。B组中双极型星形胶质细胞的突起长度明显超过A组。结论：bFGF可以显著促进脊髓来源神经干细胞分化成的双极型星形胶质细胞的突起生长。     

体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞的增殖和分化

目的探讨大鼠胚胎脊髓神经干细胞的体外培养生长及分化情况,为神经干细胞的临床应用提供实验依据。方法取孕13d SD大鼠胚胎脊髓,在条件培养基中培养获得神经干细胞,应用免疫荧光法鉴定。神经干细胞在含血清的培养基中传代培养,应用免疫细胞化学法检测神经干细胞的分化情况。结果从大鼠胚胎脊髓可获得具有自我增殖分化能力的神经干细胞,培养7d即可获得神经球。用免疫细胞化学和免疫荧光法鉴定干细胞分化,可检测到神经元和星形胶质细胞。结论从大鼠胚胎脊髓能分离获得神经干细胞,并可向神经元和星形胶质细胞方向分化。     

Nogo-p4对神经干细胞分化成星形胶质细胞的影响

目的:观察Nogo-p4对神经干细胞分化成星形胶质细胞的影响。方法:体外培养大鼠脊髓来源神经干细胞,分为A组和B组,在神经干细胞分化过程中A组加入血清,B组加入血清和4μmol/L的Nogo-p4,分化7d后,GFAP抗体标记星形胶质细胞,观察其各亚型的比率和形态特点。结果:神经干细胞分化第7d,A组形成4种亚型星形胶质细胞,分别为胞体延长型,双极型,星型和扁平多角型。B组只能形成3种亚型星形胶质细胞,分别为胞体延长型,双极型和星型。结论:Nogo-p4对神经干细胞分化过程中形成的扁平多角型星形胶质细胞具有选择性抑制作用。     

大鼠脊髓神经干细胞的体外培养及鉴定

目的:体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞,观察其生长、增殖和分化特点.方法:利用倒置显微镜、MTT法、免疫细胞化学等方法检测神经干细胞的增殖、分化情况.结果:分离的脊髓神经干细胞呵形成大量悬浮的神经球,并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈nestin阳性.在添加10%胎生血清7 d后,神经球细胞可分化为有神经元、星形胶质细胞特异性抗原表达的细胞.结论:体外培养大鼠胚胎脊髓可得到大量神经干细胞,并能分化为神经元和星形胶质细胞.     

miRNAs对神经干细胞分化调控作用分子机制的研究进展

神经干细胞是一类具有强大自我更新能力的多能干细胞,并且具备向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜力。神经干细胞的分化过程受到多种因素的精确调控。miRNAs是一种内源性非编码单链小分子RNA,通过和mRNA结合引导沉默复合体降解mRNA或抑制其翻译调控mRNA在神经干细胞中的表达,从而影响神经干细胞的分化状态。本文就miRNAs调控神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的分子机制研究进展作一综述。     

天麻素对海人酸干预的大鼠神经干细胞分化的影响

目的:研究天麻索对海人酸干预的神经干细胞分化的影响及其机制.方法:体外分离并培养新生Wistar大鼠神经千细胞,通过免疫组织化学法和免疫荧光法进行鉴定.将神经干细胞分为3组:第1组不加药为空白对照组,第2组加入不同浓度梯度的海人酸,第3组加入天麻素和不同浓度梯度海人酸.计算分化后神经元和胶质细胞比例.结果:培养的细胞具有自我更新和向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的潜能,是神经干细胞.海人酸可以有效诱导神经十细胞向胶质细胞分化,天麻素可在一定程度上阻断海人酸的作用,诱导神经干细胞向神经元分化.结论:天麻素可减少海人酸兴奋性的影响,诱导神经干细胞向神经元分化.     

胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞的分离培养与观察

目的建立神经干细胞分离、培养、分化鉴定技术,观察神经干细胞增殖、分化特点.方法利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代、贴壁分化观察.采用免疫细胞化学、透射电镜检测技术,观察鉴定神经干细胞和分化的神经细胞.结果从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞,透射电镜观察见典型的干细胞特征和不对称分裂现象.贴壁分化后可以出现MAP2、NSE、GFAP和GC表达阳性的细胞.结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能.     

星形胶质细胞诱导神经干细胞定向分化试验研究

目的 研究新生SD大鼠星形胶质细胞培养上清液对神经干细胞(neural stem cells，NSCS)体外定向分化的影响，探讨神经干细胞分化条件。方法 收集新生和成年SD大鼠星形胶质细胞培养的上清液，以1：3比例同DMEM／F12培基混合，分别对胎鼠来源的神经干细胞进行诱导分化，倒置相差显微境下观察细胞的生长情况。并采用免疫荧光检测方法对分化细胞鉴定和计数。结果 新生鼠星形胶质细胞培养上清液与DMEM／F12的混合培基诱导神经干细胞分化为神经元的比例明显提高。结论 新生鼠星形神经胶质细胞能促使神经干细胞向神经元方向分化。     

大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞,分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞,其细胞核中可见荧光标记物。结论大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞,并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。     

脊髓损伤后m6A甲基化修饰在神经干细胞自发分化中的调控作用

目的探讨脊髓损伤后mRNA m6A甲基化修饰对神经干细胞自发分化的调控作用。方法8周龄C57小鼠构建脊髓钳夹损伤模型,采用后肢运动功能评分（basso mouse scale, BMS）评价小鼠脊髓钳夹损伤模型构建情况;脊髓组织冰冻切片免疫荧光染色检测脊髓损伤1、3d后,损伤位点周围神经干细胞的数量及m6A甲基化水平;microRNA干扰技术敲低神经干细胞内的METTL14蛋白表达,并利用细胞免疫荧光检测神经干细胞自发分化后,神经元细胞、少突胶质细胞及星形胶质细胞数量;Western印迹法及Northern印迹法检测髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）与神经干细胞共培养后神经干细胞内METTL3、METTL14、FTO及ALKBH5蛋白表达情况及细胞内m6A甲基化水平。结果BMS评分结果表明小鼠脊髓钳夹损伤模型构建成功。免疫蛋白印迹结果显示,脊髓损伤后组织内脊髓损伤后星形胶质细胞的细胞标志蛋白GFAP显著增加,神经元标志蛋白NeuN和少突胶质细胞标志蛋白MBP表达显著降低。组织免疫荧光结果表明,损伤早期受损位点周围神经干细胞标志蛋白NESTIN达量增加,但m6A水平减少。细胞免疫荧光结果表明,m6A甲基化水平降低可促进神经干细胞神经向星形胶质细胞的自发分化。免疫蛋白印迹结果显示,MBP处理神经干细胞可使细胞内METTL3/METTL14表达量及细胞整体m6A甲基化水平降低。结论脊髓损伤后mRNA m6A甲基化降低可促进神经干细胞向星形胶质细胞分化。     

大鼠脊髓来源神经干细胞NgR的表达

目的：检测大鼠脊髓来源神经干细胞Nogo-66受体（NgR）是否表达。方法：悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞，形成神经球后，以免疫荧光法鉴定神经干细胞并检测NgR的表达情况。结果：神经球及单个神经干细胞均显著表达NgR。结论：NgR在脊髓神经发育的干细胞阶段即开始表达。     

Induction of functional recovery by co-transplantation of neural stem cells and Schwann cells in a rat spinal cord contusion injury model

Objective To study the transplantation efficacy of neural stem cells （NSCs） and Schwann cells （SC） in a rat model of spinal cord contusion injury. Methods Multipotent neural stem cells （NSCs） and Schwann cells were harvested from the spinal cords of embryonic rats at 16 days post coitus and sciatic nerves of newborn rats, respectively. The differential characteristics of NSCs in vitro induced by either serum-based culture or co-culture with SC were analyzed by immunofluorescence. NSCs and SCs were co-transplanted into adult rats having undergone spinal cord contusion at T9 level. The animals were weekly monitored using the Basso-Beattie-Bresnahan locomotor rating system to evaluate functional recovery from contusion-induced spinal cord injury. Migration and differentiation of transplanted NSCs were studied in tissue sections using immunohistochemical staining. Results Embryonic spinal cord-derived NSCs differentiated into a large number of oligodendrocytes in serum-based culture upon the withdrawal of mitogens. In cocultures with SCs, NSCs differentiated into neuron more readily. Rats with spinal cord contusion injury which had undergone transplantation of NSCs and SCs into the intraspinal cavity demonstrated a moderate improvement in motor functions. Conclusions SC may contribute to neuronal differentiation of NSCs in vitro and in vivo. Transplantation of NSCs and SCs into the affected area may be a feasible approach to promoting motor recovery in patients after spinal cord injury.     

OMgp及其受体NgR在大鼠中枢神经系统发育中的表达

目的探讨再生抑制相关蛋白OMgp及其受体NgR在中枢神经系统发育中的表达规律及其意义。方法 SD大鼠按不同发育阶段（E20,2、6、10 w,1 y）取材,用RT-PCR、免疫组织化学方法检测OMgp和NgR在海马、脑干、脊髓部位的表达情况。结果 RT-PCR结果显示,OMgp的表达从E20开始逐渐升高,6 w达到最高峰,之后逐渐下降直到1 y;NgR在E20开始有微弱的表达,之后逐渐升高。免疫组织化学结果显示,NgR在E20无表达,但从2～10 w表达逐渐增强,并且10 w时可见其在脊髓白质少突胶质细胞表达。结论 OMgp在中枢神经系统发育中可能是作为一种正常环境因子参与轴突生长、突触联系的调节以及少突胶质细胞和神经元轴突间的识别,NgR也可能具有与轴突再生抑制无关的其他功能。     

激活态雪旺细胞对神经干细胞分化作用的研究

目的探讨激活态雪旺细胞(SCs)对神经干细胞(NSCs)的分化作用。方法取出生24 h内的SD乳鼠脊髓NSCs,分离培养并传至4代。取体重(100±5)g的SD大鼠,结扎右侧坐骨神经,1周后取双侧坐骨神经,左侧提取正常坐骨神经分离培养SCs(普通SCs),右侧提取结扎变性的坐骨神经分离培养SCs(激活态SCs),均采用双酶消化加差速贴壁法。将SCs与NSCs应用Transwell培养皿联合培养,分为三组:A组为激活态SCs与NSCs;B组为普通SCs与NSCs;C组仅为NSCs。于培养的第2、4、6天检测各组NSCs活性。1周后,Western blot检测各组SCs表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达水平,免疫荧光检测各组NSCs分化比例。结果传至4代的NSCs生长稳定,分离的SCs 7 d后大量增殖呈旋涡状。联合培养后MTT法检测细胞活性,第2、4天三组细胞的活性差异无统计学意义(P>0.05),第6天C组活细胞比例开始降低,A、B组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05),A组与B组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测A组细胞表皮生长因子(EGF)表达水平(0.486±0.028)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达水平(0.385±0.023)均高于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。MAP-2荧光染色,每高倍视野阳性细胞比例A组[(35.26±2.53)%]高于B组[(27.63±3.45)%],差异有统计学意义(P<0.05);GFAP荧光染色,每高倍视野阳性细胞比例A组[(62.42±3.78)%]低于B组[(70.18±1.26)%],差异有统计学意义(P<0.05)。结论激活态SCs能够促进NSCs向神经元的分化进程,提高神经元的分化比例。     

TGF-β1和CNTF在大鼠移植神经干细胞后的损伤脊髓中的表达

目的 研究在受损伤脊髓移植神经干细胞后对其TGF-β1和CNTF表达的影响.方法 将正常成年SD雌性大鼠35只,分为:单纯脊髓全横断组、假手术组、NSCs移植组.NSCs移植组在脊髓全横断后第7天时进行NSCs移植,其它2组不移植NSCs;通过RT-PCR测定脊髓损伤局部头侧在移植术后3,7,14 d TGF-β1和CNTF的表达.结果 移植术后3 d,7 d,单纯全横断组TGF-β的表达大于神经干细胞组.CNTF仅在术后7 d,前者表达大于后者,其余时间段2组间2因子的表达无统计学意义.结论 神经干细胞移植使脊髓损伤局部TGF-β1的表达降低,但对CNTF表达的影响不大.     

bcl-2基因修饰神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

目的探讨bcl-2基因修饰神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠损伤神经功能恢复的影响。方法体外培养大鼠神经干细胞,经Ad-EGFP为载体介导端B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)基因转染神经干细胞,分为3组:对照组、阴性转染组、bcl-2转染组。Western-blot检测神经干细胞在转染前后bcl-2蛋白的表达。成年雌性SD大鼠85只,造模成功72只,随机分为对照组,NSCs组,bcl-2-NSCs组,24只/组,按照改良的Allen打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型。通过BBB评分、斜板试验进行运动功能评定。造模后7 d通过RT-PCR及Western-blot检测检测脊髓损伤区周围HSP27、c-fos基因的表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。造模后4周取材行病理切片HE染色及荧光显微镜观测EGFP标记的NSC存活及分布情况,通过SEP和MEP观察大鼠神经电生理恢复情况。结果 bcl-2基因转染大鼠神经干细胞后,bcl-2转染组与对照组、阴性转染组相比bcl-2基因和蛋白水平均有表达(P0.05);大鼠下肢运动功能评价bcl-2-NSCs组优于NSCs组,NSCs组优于对照组。造模后72 h,bcl-2-NSCs组细胞凋亡数均明显低于对照组和NSCs组(P0.05)。造模后7 d,与对照组和NSCs组相比,bcl-2-NSCs组HSP27基因和蛋白的表达均较显著升高(P0.05),bcl-2-NSCs组c-fos基因和蛋白的表达较显著降低(P0.05)。造模后4周,HE染色对照组可见脊髓组织缺失及脊髓空洞形成,无神经轴索通过。NSCs组损伤区可见少量神经轴索样结构,脊髓空洞较小,bcl-2-NSCs组可见较多神经轴索样结构,未见脊髓空洞。EGFP标记的阳性细胞数:bcl-2-NSCs组最多,NSCs组次之,对照组未见,且各组之间差异有显著性(P0.05)。造模后4周,SEP和MEP的潜伏期:bcl-2-NSCs组NSCs组对照组,且各组之间差异有显著性(P0.05);波幅:bcl-2-NSCs组NSCs组对照组,且各组之间差异有显著性意义(P0.05)。结论通过Ad-EGFP为载体介导端B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)基因转染使神经干细胞能够促进体外培养的大鼠神经干细胞增殖。bcl-2基因修饰神经干细胞移植可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,升高脊髓损伤区HSP27表达,降低脊髓损伤区bcl-2基因的表达和神经细胞凋亡,改善大鼠的肢体运动功能和电生理功能。     

已分化神经干细胞修复成年鼠急性脊髓损伤的实验研究

目的 观察已分化神经干细胞植入成年鼠损伤脊髓后的变化及检查修复脊髓损伤的效果.方法 以胚胎脊髓提取液(FE)诱导细胞/PGA支架复合物分化后,植入成年鼠损伤脊髓,观察分化细胞的存活和发育情况并评估动物的运动功能.结果 FE体外可诱导神经干细胞分化成神经元、星形和少突胶质细胞.植入脊髓后,分化细胞/PGA支架复合物(dNPC)内的细胞成分可以存活并继续成熟,动物BBB评分明显优于对照组.结论 dNPC含有已经分化的细胞,移植后各种细胞成分可以存活并继续成熟,对成年鼠损伤脊髓的结构重建和功能恢复都有一定的作用.