神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后GDNF基因表达的影响及意义

目的:探讨神经干细胞(NSC)移植对大鼠脊髓损伤后胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达的影响及其意义。方法:NSC提取自新生Wistar大鼠的海马区,经培养、鉴定。制作大鼠脊髓损伤(SCI)模型,于伤后第7d移植NSC。实验分为3组:NSC移植组(A组)、DMEM填充组(B组)、正常对照组(C组)。应用RT-PCR法和免疫组化法观察细胞移植后不同时间点GDNF基因的表达变化。结果:RT-PCR结果分析,移植术后第1,3,5d,A组GDNF mRNA的表达量明显高于B组,差别有显著性意义(P<0.05)。组化结果分析,移植术后第7,14,28d GDNF的表达量明显高于B组,差别有显著性意义(P<0.05)。结论:NSC在移植后可上调神经营养因子GDNF基因的表达,是修复脊髓损伤的机制之一。     

大黄苷元对骨髓间充质干细胞移植脑缺血大鼠神经细胞和神经营养因子的影响

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植脑缺血大鼠神经细胞及神经营养因子表达的变化以及从大黄苷元对其变化的影响方面探讨二者联合的作用机制。方法体外全骨髓贴壁筛选培养法扩增BMSCs;线栓法制备局灶性脑缺血动物模型(MCAO)模型;术后24h将BMSCs由同侧颈内动脉移植脑内,大黄苷元灌胃用药;免疫组织化学法测定BMSCs移植后7d(早期)、14d(中期)和28d(后期)神经细胞特异性标志兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶抗体(NSE)和兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)及神经营养因子兔抗大鼠神经生长因子抗体(NGF)和兔抗大鼠胶质源性神经营养因子抗体(GDNF)表达变化。结果假手术组大鼠NSE和GFAP表达显著,NGF和GDNF呈弱阳性。模型组7d的GFAP、NGF和GDNF表达增强,14d和28d的GFAP、NGF表达递减,14d的GDNF表达减弱、28d增强。大黄苷元组7d的NSE较模型组表达增强,GFAP减弱,28d的NGF表达增强,7d和14d的GDNF减弱。移植组28d的GFAP、NGF和GDNF表达均较模型组增强。联合组各时间点的NSE表达增强;7d的GFAP表达减弱,14d增强;联合组14d和28d的NGF表达均较大黄苷元组和移植组增强。结论脑缺血再灌注损伤后随时间延长神经元细胞呈递减反应,神经胶质细胞反应先增强再减弱;神经营养因子早期呈反应性增强,此后NGF递减,GDNF出现先减弱再增强的特点。BMSCs移植脑内中后期增强神经营养因子及神经细胞反应的作用明显;大黄苷元可使BMSCs移植后保护神经细胞的时间提前,并使其作用增强,其作用机制可能与上调早期NGF和GDNF及增强中后期NGF的表达有关。     

幼兔丁卡因脊髓神经毒性损伤后凋亡相关基因的表达

目的:观察丁卡因注入幼兔蛛网膜下腔造成幼兔脊髓神经损伤后神经细胞凋亡相关基因bax和bcl-2的表达及其意义.方法:日本大耳白兔48只,雌雄不拘,45日龄左右,体重1.0～1.5 kg.随机分为0.9%生理盐水对照组(S组)和2%丁卡因组(T组)两个大组,每组24只.两组又分别随机分为3 h组、6 h组,7 d组三小组,共六个小组,每组8只.于L6,7穿刺后,20 s内注入生理盐水或2%丁卡因0.2 ml.于注药后3 h、6 h、7 d三个时相点各处死3 h组,6 h组,7 d组的8只幼兔,取L5,6段脊髓,应用透射电镜、HE染色观察神经细胞的形态学变化.采用免疫组化法检测两组各个时相点脊髓神经细胞凋亡相关基因的表达情况.结果:T组所有幼兔的双后肢运动功能均出现不同程度的受损.HE染色显示T组脊髓损伤主要表现为多发性小出血灶,7 d后为胶质细胞增生.电镜观察可见到典型的凋亡细胞.S组和T组在3 h、6 h、7 d不同时相点均有神经细胞凋亡相关基因bax和bcl-2的表达,与S组比较,T组的阳性细胞光密度值较高(P＜0.05).结论:丁卡因致幼兔脊髓神经系统毒性损伤后存在细胞凋亡现象.凋亡相关基因bax和bcl-2共同参与了脊髓神经毒性损伤的发生和发展.     

经静脉移植骨髓基质干细胞治疗脊髓损伤后碱性成纤维生长因子表达变化

目的:通过观察骨髓基质干细胞(BMSCs)移植治疗脊髓损伤后对bFGF表达的影响,探讨经静脉移植骨髓基质干细胞治疗脊髓损伤的可行性。方法:用改良的Allen’s WD法建立脊髓(T12节段)损伤模型,免疫组织化学方法检测bFGF的表达。结果:bFGF在各组大鼠脊髓中均呈阳性表达,损伤后对照组与BMSCs移植组各个时点的表达量仍高于正常组(P<0.05),7d最高,后渐下降,但21d表达仍高于正常。其中BMSCs移植组与对照组各个时点的bFGF表达量均有显著差异(P<0.05)。结论:BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤模型有助于脊髓功能的恢复。     

恒河猴脊髓半横断损伤后脊髓腹角及对侧皮质前运动区胶质细胞源性神经营养因子的表达

目的:探讨恒河猴脊髓损伤后脊髓腹角及对侧大脑皮质前运动区胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达的变化.方法:18只成年恒河猴随机分为假手术组和脊髓半横断损伤(hSCI)后7 d、14 d、1个月、2个月和3个月组,每组3只.假手术组术后24 h取材;各损伤组于第11胸髓节段切断左侧半脊髓,在相应时间点取材.取脊髓损伤处近、远段5 mm组织及损伤对侧大脑皮质前运动区组织,制作冰冻切片,采用免疫组织化学SP法检测GDNF,计数阳性神经元数目.结果:恒河猴hSCI后3个月内,损伤处脊髓近、远段损伤侧与未损伤侧腹角GDNF阳性神经元数均较假手术组减少(P＜0.05),并且表现为先降低后增加,晚期逐渐减少;hSCI 1个月以后损伤侧GDNF阳性神经元数目多于未损伤侧;对侧皮质前运动区GDNF阳性神经元在损伤早期急剧减少,此后增加,至hSCI后3个月时恢复至正常数量.结论:损伤局部GDNF的缺乏是影响脊髓损伤后再生修复的原因之一;适时补充外源性GDNF可能会促进神经修复;应用GDNF治疗SCI的最佳时机在损伤早期.     

骨髓间充质干细胞移植联用褪黑素对大鼠脊髓损伤修复的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植联用褪黑素(MT)对大鼠脊髓损伤修复的影响,并对其作用机制进行探讨。方法:首先采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,以Brdu标记细胞核。然后将48只SD大鼠用改良Allen法制备T10脊髓损伤模型,并随机平均分为MT+BMSCs组、BMSCs组、MT组、模型对照组,另取12只作为空白对照组。分别于造模后1d、3d、7d、14d、21d行神经功能BBB评分及斜板试验,免疫组化检测带标记的BMSCs迁移情况,显微镜下观察移植后脊髓形态结构变化。结果:术后神经功能BBB评分及斜板试验结果MT+BMSCs组优于BMSCs组(P<0.05),BMSCs组优于MT及模型对照组(P<0.05);MT+BMSCs组及BMSCs组损伤阶段脊髓内可见Brdu标记阳性BMSCs存活,且阳性数目前者多于后者,灰质分布较白质多,以注射部位向周围损伤组织迁移;同时显微镜下可观察到MT+BMSCs组脊髓损伤区无明显空腔,空泡小而少,并可见较多神经纤维及细胞。结论:BMSCs联合MT移植促进大鼠损伤脊髓结构和功能恢复的效果明显优于单纯细胞移植组,两者联用具有协同效应。     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的 研究骨髓基质细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经细胞凋亡的影响,探讨骨髓基质细胞移植治疗脊髓损伤的机制.方法 取大鼠股骨和胫骨骨髓培养BMSCs并传代.参照Taoka's方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型.脊髓损伤后30 min,进行BMSCs或DMEM培养液损伤周围局部四点注射.在术后3、7和14 d,应用TUNEL方法检测脊髓损伤周围神经细胞凋亡情况.结果 脊髓损伤后,损伤区周围组织内TUNEL阳性细胞数量明显增加,阳性细胞分布于脊髓灰质和白质内,但以白质内神经细胞为主.与DMEM组大鼠相比,移植术后3、7和14 d,BMSCs移植显著减少脊髓损伤周围区凋亡的神经细胞数目(P＜0.05).结论 脊髓损伤后,BMSCs移植能够抑制神经细胞凋亡.     

微囊化兔坐骨神经组织细胞移植对大鼠损伤脊髓后IκBa表达的影响及意义

目的 探讨微囊化兔坐骨神经组织细胞移植于大鼠损伤脊髓后对其IκBa的表达及活性的影响.方法 家兔10只用于制备兔坐骨神经组织的胞悬液.成年SD大鼠120只随机分为4组:微囊组(微囊化兔坐骨神经组织细胞移植组,n=36)、细胞组(坐骨神经组织细胞移植组,n=36)、单损组(单纯损伤组,n=36)、假手术组(n=12).微囊组、细胞组和单损组大鼠在脊髓半横断伤后,立即于损伤处分别植入明胶海绵吸附的10μL微囊化坐骨神经组织细胞、明胶海绵吸附的10μL坐骨神经组织细胞以及明胶海绵吸附的10 μL生理盐水.分别于术后6 h、12 h、24 h、3 d、7 d,14 d(每个时相取6只大鼠)取出损伤部位脊髓标本,假手术组(每个时相取2只大鼠)则取相应节段脊髓.石蜡包埋后切片,行免疫组织化学染色观IκBa的表达变化.结果 IκBa阳性细胞主要见于神经元细胞及胶质细胞的胞浆内.大鼠脊髓损伤后上述细胞IkBa表达降低,24 h降到最低点,3 d后表达开始回升,7 d逐步恢复正常水平.微囊组与单损组、细胞组比较差异有显著性(P<0.05).结论 微囊化兔坐骨神经组织细胞移植于大鼠损伤脊髓后,可以通过抑制IκBa磷酸化降解环节,从而抑制炎症反应.     

GDNF基因修饰的骨髓间充质干细胞对脑出血大鼠脑源性神经营养因子及其受体的影响

目的:观察GDNF基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)对脑出血大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体的影响。方法:通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,并随机分为BMSCs组、GDNF/BMSCs组和生理盐水组共3组,并于建模后第3d在脑出血部位分别移植BMSCs、GDNF/BMSCs以及生理盐水;各组又根据细胞移植后再喂养时间的不同(1周、2周)分为2个亚组,每亚组8只大鼠。采用RT-PCR法观察BDNF和受体TrkB mRNA的表达;免疫组织化学染色观察BDNF蛋白的表达。结果:与生理盐水组和BMSCs组相比,BDNF及受体TrkB mRNA的表达上调。在1周和2周时间点,GDNF/BMSCs组与BMSCs组和生理盐水组相比BDNF阳性细胞数明显增加。结论:GDNF基因修饰的BMSCs移植治疗脑出血大鼠能增强BDNF及其受体的表达,有利于大鼠神经功能恢复。     

红花黄素对骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的影响

目的:通过研究红花黄素对骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植修复大鼠脊髓损伤(SCI)的影响,探讨其可能的作用机制。方法:骨髓细胞贴壁法分离、培养、扩增BMSCs,并进行腺病毒介导的绿色荧光蛋白(GFP)标记。45只SD大鼠行改良Allen法制备SCI模型后,随机分为红花黄素组、单纯BMSCs组和PBS组,红花黄素组于损伤脊髓局部注入GFP-BMSCs,腹腔注射红花黄素40 mg/kg;单纯BMSCs组脊髓注入GFP-BMSCs,PBS组注入同体积0.9%氯化钠溶液。术后1、2、3、4、7 d检测损伤脊髓组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;分别于7、14、21、28 d检测损伤脊髓组织神经元特异性核蛋白(NeuN)和神经生长因子(NGF)表达,BBB评分法进行后肢运动功能评分。结果:红花黄素组BBB评分、脊髓损伤局部SOD活性及NeuN和NGF的表达均明显高于单纯BMSCs组和PBS组(P<0.05),而MDA含量较低(P<0.05)。结论:红花黄素通过抑制脊髓自由基生成、减轻脂质过氧化、上调NeuN和NGF表达而增强骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的效果。     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后COX-2基因表达的影响

目的观察骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）移植对大鼠脊髓损伤后COX-2 mRNA表达的影响。方法分离培养BMSCs并传代。取Wistar雌性大鼠72只随机分为3组：A组18只（假手术组）、B组27只（细胞培养基对照组）和C组27只（BMSCs组）。B组和C组脊髓损伤后进行DMEM或BMSCs损伤周围区注射。应用RT-PCR法和免疫荧光方法检测损伤脊髓组织内COX-2 mRNA的表达及COX-2蛋白分布情况。结果 COX-2 mRNA在A组大鼠脊髓组织中低水平表达。脊髓损伤移植术后,C组COX-2 mRNA表达水平均显著高于相应时间点的B组（P〈0.01）。免疫荧光结果显示,A组COX-2仅表达于脊髓内的血管。脊髓损伤后,B组和C组COX-2表达分布则发生变化,主要见于损伤周围区脊髓内的血管和少数脊髓腹侧灰质内的神经元。结论 BMSCs移植能够增加脊髓损伤后COX-2 mRNA的表达。     

骨髓间充质干细胞移植联合孕酮应用对脊髓损伤的修复作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植联合孕酮应用对大鼠脊髓损伤修复的协同作用及其可能的分子机制.方法 将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、孕酮组、BMSCs组、BMSCs+孕酮组,除假手术组外其余各组均为采用改良的Allen法建立的脊髓损伤(SCI)模型鼠.按上述分组分别在脊髓损伤后立即将BMSCs移植到损伤部位,和(或)在脊髓损伤后第1～5天腹腔注射孕酮(8 mg/kg).脊髓损伤术后第0、3、7、14、21、28天用BBB评分法评价后肢运动功能的恢复情况;RT-PCR和Western blot检测脊髓损伤后第0天和第28天局部组织脑源性神经营养因子(BDNF)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)和生长相关蛋白GAP-43的mRNA和蛋白表达水平.结果 孕酮或BMSCs移植单独应用均可以有效促进大鼠后肢功能的恢复,二者联合运用效果更好.Real-time PCR和Western blot结果显示脊髓损伤后第0天各脊髓损伤组局部组织BDNF、MBP和GAP-43的表达水平均较假手术组明显降低;第28天孕酮组、BMSCs组和BMSCs+孕酮组上述指标较模型组明显升高,孕酮+BMSCs组的表达水平最高.结论 单纯孕酮或BMSCs移植均能促进SCI大鼠后肢运动功能的恢复,其机制之一可能是上调损伤局部BDNF、MBP和GAP-43的表达水平,促进髓鞘和神经元再生,两者联合应用具有协同作用.     

BMSCs并BDNF移植治疗大鼠陈旧性脊髓损伤效果

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)并脑源性神经营养因子(BDNF)移植治疗大鼠陈旧性脊髓损伤的效果。方法对48只Wistar大鼠采用改良的ALLEN撞击法建立脊髓损伤模型,将其随机分为4组,4周后4组分别注射BMSCs+BDNF、BMSCs、BDNF及DMEM干预。分别于移植后1、2、4周采用BBB评分评估大鼠后肢运动情况,并于移植后4周采用免疫组化法检测BMSCs在脊髓损伤部位的分布,及生长相关蛋白43(GAP-43)的表达。结果移植后4周,BMSCs+BDNF组及BMSCs组的BMSCs在脊髓损伤部位均得以存活。BMSCs+BDNF组与BMSCs组及BDNF组比较,脊髓空洞较少并且GAP-43阳性表达面积较高(F=35.57,q=4.97～25.84,P<0.05)。BMSCs+BDNF组BBB评分与其他组比较,差异有显著性(F=27.51,q=3.89～11.57,P<0.05)。结论 BMSCs+BDNF联合移植对于大鼠陈旧性脊髓损伤有较好的修复作用。     

永生化的BMSCs移植促进大鼠脊髓损伤后功能恢复

目的探讨神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)和脑源性神经生长因子(BrainDerivednervegrowthfactor,BDNF)基因修饰后永生化的骨髓基质细胞(Bonemarrowstemcells,BMSCs)移植促进大鼠脊髓损伤后功能恢复。方法SD大鼠制备成脊髓损伤动物模型。随机分为损伤对照组(A组)、BMSCs移植组(B组)和NGF、BDNF基因修饰后永生化的BMSCs移植组(C组)。治疗后2、4、6周,每组动物分别进行联合行为评分(GBS)、运动诱发电位(MEP)、感觉诱发电位(SEP)检查、双下肢功能测定(爬坡试验),评价脊髓损伤功能恢复情况。结果随时间的延长,B组GBS、MEP、SEP及下肢功能明显改善,与其它组相比较,差异有显著性,P<0.05。结论NGF、BDNF基因修饰后永生化的BMSCs移植能恢复损伤脊髓的功能。     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后环氧化酶-2和血管内皮生长因子表达的影响

目的：观察骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）移植对大鼠脊髓损伤后环氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白表达的影响。方法大鼠随机分为3组：A为假手术组,B为细胞培养基（DMEM）对照组,C为BMSCs移植组。B组和C组大鼠进行脊髓压迫损伤模型制作。脊髓损伤后, B组和C组大鼠分别给予DMEM培养液或BMSCs脊髓损伤周围区注射。术后应用Western Blot方法检测COX-2、VEGF蛋白在损伤脊髓组织中的表达变化。结果 COX-2、VEGF蛋白在A组大鼠未损伤脊髓组织中均低水平表达。B组与A组相比,脊髓损伤后COX-2蛋白表达水平明显增加（P＜0.01）,VEGF蛋白表达水平则短暂显著增加（P＜0.05）。C组与B组相比, COX-2和VEGF蛋白表达水平均显著增加。结论 BMSCs移植能够增加脊髓损伤后COX-2、VEGF蛋白的表达。     

嗅鞘细胞移植联合应用GDNF对大鼠脊髓损伤的治疗作用

目的：研究嗅鞘细胞（OECs)移植并联合应用胶质细胞源性神经营养因了（GDNF）对脊髓损伤的保护和促进再生作用。方法；建立成年SD大鼠脊髓T8半横断损伤模型，将体外培养纯化的OECs植入脊髓损伤处，同时局部应用GDNF，采用斜板试验和BBB联合功能评分观察大鼠运动功能恢复情况，并通过辣根过氧化物酶逆行示踪技术评价OECs和GDNF对神经元存活和纤维再生的影响。结果：（1）OECs和GDNF联合应用时对皮质和红核神经元有逆行性保护作用；可促进脊髓下行传导束再生，肢体运动功能恢复，（2）OECs和GDNF联合应用组对脊髓损伤的修复作用最强，高于GDNF或OECs单用组。结论：联合应用GDNF和OECs在脊髓损伤修复治疗中具有协同作用。     

实验性大鼠脊髓损伤后环氧化酶2的表达及意义

目的：检测大鼠脊髓损伤后环氧化酶-2(COX-2)的表达，以探讨脊髓损伤后的继发性损伤机制。方法：将60只SD大鼠随机分为两组：损伤组48只，行脊柱椎板切除及脊髓打击术；对照组12只，仅行椎板切除术。应用免疫组化及Westem blot analysis方法，分别测定脊髓细胞质内COX-2表达的变化情况。结果：在损伤后2h，COX-2表达开始升高，24h升至最高点，损伤48h后开始逐步降至正常。结论：COX-2活性变化可作为急性创伤性脊髓损伤时炎症反应程度的一项观测指标，抑制COX-2成为抑制炎症反应的新途径。