刺激血管生长的血管生成素已分离成功并对其基因进行克隆

Bert Vallee及其同事提纯了一种蛋白质,称之为血管生成素(angiogenin),并对其基因进行克隆。这一研究是在Judah Folkman工作的基础上进行的,Folkman证实肿瘤的生长需由连续向内生长的新生血管提供营养,并提示这是由于一种可扩散的物质的缘故,他命名为肿瘤血管生成因子(TAF)。Folkman的研究与血管生成素无关;Vallee认为血管生成素不同于TAF。 Folkman和Vallee采用了不同方法来提纯血管生成物质,并从此发现了两种纯化物质。     

分子克隆人血小板生成素基因

目的：克隆人血小板生成素基因，方法：采用ＲＴ一ＰＣＲ的方法。结果：从人胎肝中克隆出全长的血小板生成素（ＴＰＯ）基因，并亚克隆至ＰＵＣｌｌ８载体中。该ｃＤＮＡ全长１０６２ＢＰ，编码３５３个氨基酸，经序列测定与Ｂａｒｔｌｅｙ等人报道的完全一致［１］。结论：已获得人血小板生成素基因，此项工作为基因工程生产ＴＰＯ奠定了良好基础。     

树鼩Retn基因的克隆及序列测定

目的 克隆树鼩(Tupaia belangeri)Retn基因,为在树鼩中开展Retn相关研究提供实验资料.方法 在树鼩脂肪组织中抽提总RNA,用RT-PCR进行基因扩增,通过基因克隆、重组质粒的酶切鉴定,对Retn克隆质粒的序列测定和分析.结果 抽提的总RNA完整性较好,RT-PCR产物电泳检测得到了目的条带,重组克隆质粒经Pst I单酶切证明了Retn基因已克隆至质粒载体,测序获得了363个核苷酸序列,1个编码114个氨基酸的开放阅读框,序列提交GenBank,登录号为JF267792；经Blast软件进行序列分析,其核苷酸序列和氨基酸序列与鼠类的同源性分别为95％和99％.结论 成功克隆了树鼩Retn基因及序列测定,为树鼩Retn基础数据的建立和开展相关研究提供了实验资料.     

膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的 对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析。方法 应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法,以膜荚黄芪根总RNA为模板克隆PAL基因。结果 所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为AmPAL,Genbank登录号为EF567076。序列分析表明,AmPAL全长为2 650 bp,含有一个完整的2 154 bp开放读码框。AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,相对分子质量为7.805×104,等电点为5.96,与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且相似性都大于80%。结论 首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础。     

家兔泛素样小分子修饰因子-2基因克隆与序列分析

目的克隆家兔泛素样小分子修饰因子-2（SUMO-2）基因,并预测其蛋白质结构和功能。方法应用分子克隆技术从家兔肝组织中克隆SUMO．2基因,用DNAMAN、CBS等生物软件及网络分析平台分析克隆所得到的SUMO-2基因序列及其编码的蛋白结构。结果测序结果显示成功克隆家兔SUMO-2基因片段,序列分析显示氨基酸序列与其他物种源性SUMO-2同源性较高。家兔SUMO-2蛋白氨基酸序列相对分子质量为10826．9,等电点为4．70,蛋白主要以无规则卷曲形式存在（56．84％）,可能含有1个N-糖基化位点,2个N．豆蔻酰化位点,1个丝氨酸磷酸化位点,2个苏氨酸磷酸化位点及2个蛋白激酶C磷酸化位点。无信号肽区域。无跨膜区,该蛋白可能为可溶性蛋白。结论成功克隆家兔SUMO-2基因,为进-步研究SUMO-2与肝纤维化的关系及其功能奠定基础。     

克隆的丙型J肝炎病毒NS2基因中发现数个N端终止突变序列

探讨丙型肝炎病毒(HCV)准种在NS2区的基因结构特征.利用逆转录-巢式PCR从一份HCV慢性携带者的阳性血清及一份急性丙肝患者的血清中获得HCV NS2全长cDNA,将其克隆于T载体,各随机挑取5个阳性克隆进行序列测定.结果显示在克隆到的HCV NS2全长基因中,慢性携带者该区序列有一个于HCV多聚蛋白第835位氨基酸的位置出现终止信号,丙肝患者该区序列有三个于第835位氨基酸的位置出现终止信号,一个小于第887位氨基酸的位置出现终止信号.在克隆到的HCV NS2基因中存在多个N端终止突变序列,提示NS2 N端跨膜区可能与包膜蛋白区有着密切的联系.     

小鼠血管抑素基因的克隆、测序与真核表达载体的构建

目的：克隆小鼠血管抑素（mAS)基因，测序并构建其真核表达载体。方法：从小鼠肝组织中提取总RNA，用RT－PCR方法将mAS的cDNA扩增出，克隆到pcDNA3真核表达载体中，测定其DNA序列。结果：测序结果表明我们克隆的血管抑素基因，其序列与GenBank中鼠的mAS基因序列有4个碱基不同，所编码的氨基酸有3个发生突变。结论：已成功构建鼠mAS的真核表达载体，为进一步应用AS进行肿瘤基因治疗研究打下基础。     

狸猫α-干扰素全基因的克隆及生物信息学分析

根据猫α-干扰素基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增狸猫α-干扰素全基因,并克隆、测序.用DNAStar软件及在线分析方法对克隆的IFN-α基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行分析,并与人和其他种动物的IFN-α基因进行同源性和进化分析.结果表明,获得了狸猫α-干扰素全基因序列,其大小为631 bp,编码194个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和7个潜在的O-糖基化位点.IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.狸猫IFN-α基因的成功克隆为进一步研究猫IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

AdPPO4基因部分序列的cDNA克隆与序列分析

目的克隆大劣按蚊(An dirus)前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)基因部分序列.方法根据已报道的多种昆虫以及冈比亚按蚊PPO基因编码的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊幼虫总RNA为模板进行RT-PCR扩增,目的片段经TA克隆后测定其核苷酸序列,然后进行序列查询与比对.结果从大劣按蚊幼虫中获得的PPO4基因(AdPPO4)部分序列长597 bp,编码199个氨基酸;AdPPO4与冈比亚按蚊PPO4基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达84%和90%.结论从大劣按蚊幼虫中成功地克隆出了AdPPO4基因的部分序列,与冈比亚按蚊PPO4基因具有很高的同源性.     

大劣按蚊AdPPO2、AdPPO3基因cDNA克隆与组织定位

目的克隆大劣按蚊PPO基因家族新成员的cDNA部分序列,并对所克隆基因进行蚊体组织定位研究.方法根据已报道的多种昆虫PPO的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊总RNA为模板进行RT-PCR扩增、目的片段克隆入T载体,然后,用PCR方法筛选新的PPO克隆并测序;以RT-PCR方法分析AdPPO2和AdPPO3在蚊血淋巴、蚊胃和唾液腺的分布情况.结果 AdPPO2和AdPPO3基因cDNA部分序列长均为597 bp,编码199个氨基酸;它们在血淋巴、蚊胃和唾液腺均有分布.结论从大劣按蚊成功克隆获得2种新的PPO基因家族成员的cDNA部分序列,为进一步克隆其全序列奠定了基础.     

人血管形成素cDNA克隆和序列分析

０　引言　人肿瘤的发生、转移和血管形成密不可分．近年来,已发现多种具有血管形成活性的因子,如纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）,转化生长因子（ＴＧＦ）,血管形成素（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）等．其中血管形成素是第一个肿瘤来源的具有血管形成活性蛋白,在体外可以诱导鸡胚绒毛尿囊膜及兔角膜血管形成［１］,因此可能在肿瘤发生中有重要作用．文献［２,３］报道,从人肝ｃＤＮＡ文库中获得人血管形成素的基因全长,并推导出氨基酸．我们利用ＲＴＰＣＲ从人肺癌细胞株Ａ５４９中提取总ＲＮＡ,成功克隆了人血管形成素ｃＤＮＡ,其序列…     

小鼠整合素β7基因克隆、序列分析及突变修复

目的:克隆小鼠整合素β7基因cDNA,同时对其序列进行分析,对造成氨基酸突变的碱基进行定点突变修复.方法:采用RT-PCR的方法,从小鼠小肠PP结获得β7基因cDNA,克隆到pMD19-T载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定,对造成氨基酸突变的碱基进行定点突变修复.结果:扩增得到的β7基因cDNA为2418bp,编码806个氨基酸,与GenBank中公布的序列比较,有10个碱基发生突变,其中造成氨基酸发生改变的有5个碱基,涉及3个氨基酸,对发生突变的5个碱基进行定点突变修复.结论:获得小鼠整合素β7基因的克隆,为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础.     

人抗甲肝噬菌体抗体重链可变区基因的序列分析

目的：对人抗甲肝病毒噬菌体抗体阳性克隆５９７和６４６，进行重链ＤＮＡ序列分析，方法：用Ｓａｎｇｅｒ末端终止测定序列，计算机软件进行分析。结果：经同源性分析，这两个克隆的同源基因均来源于人免疫球蛋白重链基因序列，氨基酸序列推导可知，克隆６４６重链Ｆｄ基因和克隆５９７重链可变区基因均为单一开放读框，各编码２２５个氨基酸和１１９个氨基酸，２株克隆重链可变区含有明确的四个框架区和３个抗原决定互补区，结论：     

nrhTNF 对Beagle犬长期毒性的试验

0 引言随着分子生物学技术的发展,人肿瘤坏死因子(Human Tumor Necrosis Factor,hTNF)的氨基酸序列已搞清,并克隆出其编码的cDNA,可大量制备TNF用于癌症治疗. 天然TNF(基因重组人TNF, rhTNF)可产生较多的副作用如肝脏损伤,肠道组织坏死性改变和发热等[1],妨碍了其临床应用.对天然TNF的基因改造后获得新型基因重组人TNF(nrhTNF)[2].     

银杏苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因克隆

目的通过克隆银杏苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因并深入研究其结构,利用生物技术改良叶用银杏品质.方法利用PAL氨基酸序列中的保守区设计的简并引物,应用PCR等分子克隆技术,首次成功地从银杏基因组中克隆出了PAL基因片断.结果及结论 PAL基因长度为1140bp,所得序列已登录在NCBI的GenBank中,核酸序列和推测的氨基酸序列的Accession分别为AY231176和AAO73468.     

恶性疟原虫类巨噬细胞迁移抑制因子基因的克隆和表达

目的克隆、表达恶性疟原虫的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)同源基因PfMif.方法参照人MIF基因(Humif)氨基酸序列在P.falcip arum基因组中找到同源核苷酸序列,设计特异引物,采用RT-PCR方法从恶性疟原虫3D7株红内期RNA扩增获得Pfmif基因;利用生物信息学软件分析所扩增的基因;原核表达重组PfMIF蛋白,并亲和纯化.结果从恶性疟原虫RNA中扩增到Pfmif基因,长度为351 bp,编码116个氨基酸,具有MIF家族蛋白的典型特征.成功的表达及纯化了融合有GST标签的重组PfMIF蛋白.结论获得来自恶性疟原虫的MIF同源基因,初步确定PfMIF是MIF家族的一个新成员.     

IFITM1克隆测序及生物信息学分析

目的 研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因(interferon induced transmembrane protein 1.IFITM1)克隆、测序,对序列进行分析,并获取生物学信息.方法 以IFITM1的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,在EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,将IFITM1的cDNA片段克隆到pUCm-T质粒,对重组的pUCm-T-IFITM1测序后,采用All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB Sequences Database 和 Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)对IFITM1的cDNA进行生物信息学分析. 结果扩增后,含有IFITM1基因cDNA的PCR产物约1000 bp,IFITM1的 cDNA成功克隆到pUCm-T质粒并进行测序.序列分析结果显示,IFITM1结构cDNA全长683bp, 有2个外显子.IFITM1的 mRNA编码的氨基酸在37～57和87～107有2个跨膜区,编码125个氨基酸的多肽,其蛋白相对分子质量为14kDa.结论 IFITM1基因的成功扩增、克隆、测序,获取了IFITM1基因的cDNA、mRNA以及编码蛋白质氨基酸的生物学信息,有利于研究IFITM1基因与大肠癌的关系.     

克隆的丙型肝炎病毒NS2基因中发现数个N端终止突变序列

探讨丙型肝炎病毒 ( HCV)准种在 NS2区的基因结构特征。利用逆转录 -巢式 PCR从一份 HCV慢性携带者的阳性血清及一份急性丙肝患者的血清中获得 HCV NS2全长 c DNA,将其克隆于 T载体 ,各随机挑取 5个阳性克隆进行序列测定。结果显示在克隆到的 HCV NS2全长基因中 ,慢性携带者该区序列有一个于 HCV多聚蛋白第 83 5位氨基酸的位置出现终止信号 ,丙肝患者该区序列有三个于第 83 5位氨基酸的位置出现终止信号 ,一个小于第 887位氨基酸的位置出现终止信号。在克隆到的 HCV NS2基因中存在多个 N端终止突变序列 ,提示 NS2 N端跨膜区可能与包膜蛋白区有着密切的联系     

新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

黄粉甲抗冻蛋白基因克隆及生物信息学分析

目的：获得黄粉甲抗冻蛋白基因afpTx及相关生物信息学资料.方法：从黄粉甲幼虫中提取总RNA,通过RT-PCR合成黄粉甲抗冻蛋白基因afpTx的cDNA片段,克隆入载体pMD19-T,进行测序分析.酶切后将其亚克隆入表达载体pET32a（＋）,构建表达质粒pET32a-afpTx,并转化到大肠杆菌DL21后提取质粒,双酶切鉴定.采用MEGA4.0,BioEdit5.0.6软件对本研究克隆的抗冻蛋白基因afpTx进行氨基酸序列同源性变异及进化分析.结果：测序结果afpTx的cDNA长度为336bp;编码112个氨基酸;酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功.抗冻蛋白氨基酸序列相似性分析表明afpTx与GenBank上提交的23条黄粉甲抗冻蛋白的氨基酸序列平均一致性为88%;与11条赤翅甲抗冻蛋白氨基酸序列的平均一致性为67%,2种甲虫的平均一致性为63%.进化树分析结果显示黄粉甲与赤翅甲抗冻蛋白序列是同源序列.赤翅甲的序列趋异度显著大于黄粉甲抗冻蛋白基因序列.结论：成功克隆了本地黄粉甲的afpTx基因,该序列是GenBank上提交的黄粉甲与赤翅甲抗冻蛋白的同源序列.