反义内皮素受体抑制血管平滑肌细胞增殖的研究

动脉旁路术或介入方法治疗外周动脉硬化闭塞症 ,可达到较好的早期治疗效果 ,然而术后 3～ 6个月内 ,约 30 %～ 50 %的病人发生血管再狭窄[1 ,2 ] 。研究表明 ,血管平滑肌细胞 (ｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ,ＶＳＭＣ)的过度增殖可能是血管再狭窄发生的主要原因之一[3 ] ,如何抑制血管平滑肌细胞的过度增殖成为防治血管再狭窄的关键。我们通过反义核酸技术特异性抑制内皮素受体 (ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒＡ ,ＥＴＡＲ)的表达 ,以达到抑制ＶＳＭＣ增殖的目的 ,为血管再狭窄的防治提供一种有效的方法。材料…     

转化生长因子—α表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人大肠癌细胞增殖的

目的 探讨转化生长因子－α（ＴＧＦ－α）、表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）反义寡脱氧核苷酸（ＡＳＯＤＮ）对人大肠癌细胞株ＨＲ８３４８的作用。方法 将ＴＧＦ－α、ＥＧＦＲ反义寡核苷酸经脂质体包裹后转染人大肠癌细胞（浓度均为１０ｕｍｏｌ／Ｌ）。采用四唑蓝比色法（ＭＴＴ法）、细胞周期分析、裸鼠体内接种等方法测定瘤细胞体内外增殖的变化。结果 ＴＧＦ－α反义ＯＤＮ、ＥＧＦＲ反义ＯＤＮ均可明显抑制ＨＲ８３４８的增殖（抑制率分别为８０．０％、８２．５％），并使裸鼠体内成瘤率下降（均为２０．０％；对照组为１００．０％）。Ｇ０／Ｇ１期细胞数明显增多（分别为６３．９％、６７．１％；对照组为３１．１％），Ｓ期细胞数相应减少（分别为３５．６％、３２．６％；对照组为５３．９％）。结论 ＴＧＦ－α反义ＯＤＮ、ＥＧＦＲ反义ＯＤＮ均能有效抑制大肠     

转化生长因子-α表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人大肠癌细胞增殖的研究

目的 　探讨转化生长因子-α（TGF-α）、表皮生长因子受体（EGFR）反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对人大肠癌细胞株HR8348的作用。　方法　将TGF-α、EGFR反义寡核苷酸经脂质体包裹后转染人大肠癌细胞（浓度均为10 μmol/L）。采用四唑蓝比色法（MTT法）、细胞周期分析、裸鼠体内接种等方法测定瘤细胞体内外增殖的变化。结果　TGF-α反义ODN、EGFR反义ODN均可明显抑制HR8348的增殖（抑制率分别为80.0%、82.5%）,并使裸鼠体内成瘤率下降（均为20.0%;对照组为100.0%）。G0/G1期细胞数明显增多（分别为63.9%、67.1%;对照组为31.1%）,S期细胞数相应减少（分别为35.6%、32.6%;对照组为53.9%）。结论　TGF-α反义ODN、EGFR反义ODN均能有效抑制大肠癌细胞的体内外生长增殖。     

内皮素—1促进血管平滑肌细胞增殖

内皮素是一种由２１个氨基酸构成的血管收缩肽和有丝分裂原。当血管内膜缺血，损伤或存在病变时，内皮素－１可直接或与其它因子交互作用于血管平滑肌细胞，通过细胞表面内皮素受体激活Ｃａ＾２＋通道开放和磷脂酶Ｃ活化。内皮素和内皮素受体的表达与血管平滑肌细胞增殖和内膜增生呈正相关。     

γ干扰素抑制血管平滑肌细胞增殖

血管平滑肌细胞增殖除了受局部生长因子的调控外，还受细胞因子的作用，其中γ干扰素具有独特的效应。离体实验证实，γ干扰素有明显的抑制平滑肌细胞增殖和分化作用，促进细胞内诱导型ＮＯ合酶和ＮＯ的生成及表达，使ＤＮＡ集聚受抑，发挥细胞毒作用。在体研究表明，外源性γ干扰素亦能抑制血管平滑肌细胞增殖。     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞生长抑制的研究

本实验旨在探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸 (ＡＳＯＤＮ ｔ)抑制端粒酶活性[1] ,诱导肝癌细胞凋亡 ,从而抑制肝癌细胞生长的作用[2 ] ,为肝癌基因治疗提供依据 ,现将结果报道如下。一、材料和方法1.ＡＳＯＤＮ ｔ对细胞抑制作用的观察 :取 2× 10 7个 /Ｌ对数生长期肝癌细胞 (肝癌细胞株ＳＭＭＣ 772 1引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库 )接种于 96孔的细胞培养板中 ,每孔 10 0 μｌ,设3个复孔。分别加入ＡＳＯＤＮ ｔ(上海生工生物工程公司合成 ,序列为 5’ ＣＴＣＡＧＴ ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡ 3’ ,调节其终浓度分别为 1、2、3…     

反义寡聚脱氧核糖核苷酸对猪促卵泡刺激素受体表达的影响

目的 :本研究旨在评价反义寡聚脱氧核糖核苷酸 (ODN)对促卵泡刺激素受体 (FSHR)mRNA表达的调节作用。　方法 :转染FSHR的CHO细胞系的mRNA水平用反转录 竞争性PCR方法进行定量测定。　结果 :结果显示用 10 μmol/L反义ODN可导致mRNA表达显著上升 ,2 4h后mRNA水平从 0 89± 0 0 6pg/ μg总RNA升至 1 6 4±0 0 8pg/ μg总RNA(P <0 0 5 )。用 0 33μmol/L反义ODN进行脂转染也得到相同结果 ,mRNA水平从 0 95± 0 0 8pg/ μg总RNA升高至 1 5 3± 0 0 7pg/ μg总RNA。这可能是由于FSHR蛋白翻译被抑制后上行调节mRNA合成所致 ,无义ODN对FSHRmRNA的表达没有任何作用。　结论 :本文结果提示针对猪FSHR翻译起始位点的反义ODN能上行调节猪FSHRmRNA的表达水平。     

反义寡聚核苷酸抑制人膀胱癌T24细胞系端粒酶活性的研究

目的研究反义寡聚核苷酸(asONs)能否抑制人膀胱肿瘤T24细胞系端粒酶活性和增殖活性。方法设计并合成2条针对端粒酶RNA模板区的asONs片段,在其作用于T24细胞第5天时,用7复孔法用聚合酶链反应-酶标法(PCR-ELISA)检测其对端粒酶活性的影响;分别在实验的第1、3、5、7天,用7复孔四唑盐比色试验(MTT)法检测其对细胞增殖活性的影响。结果经不同浓度(0、5、10μmol/L)处理5d后T24细胞端粒酶活性受到抑制,吸光度(A)值分别为0.79±0.10、0.24±0.14;经10μmol/L处理1、3、5、7d,T24细胞的增殖活性逐渐下降,A值分别为0.59±0.11、0.39±0.09、0.21±0.02、0.19±0.07,各组分别比较差异有非常显著性(P＜0.001)。结论asONs能够同时抑制人膀胱肿瘤T24细胞系端粒酶及细胞增殖活性,提示asONs可能通过抑制端粒酶活性达到抑制人膀胱肿瘤T24细胞系的增殖。     

血管内膜增生和平滑肌细胞增殖的反义治疗

反义技术在血管平滑肌细胞增殖和内膜增生的基因治疗中占有重要的地位，目前人们对反义靶基因序列，载体系统和生物学效应方面进行了深入研究，可望在血管基因治疗领域内取得一定的突破，但对反义载体的可行性和反义药物的安全性等问题尚需作进一步研究。     

DNA聚合酶α反义寡聚脱氧核苷酸抑制人胃癌细胞生长的研究

反义药物的研究为肿瘤的特异性治疗开拓了广阔的前景。DNA聚合酶α是真核细胞DNA合成的关键酶,与肿瘤的发生及发展密切相关。我们用DNA聚合酶α(DNA pol-α)mRNA作靶核酸,合成反义聚脱氧核苷酸(ASODN),作用于胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803,结果发现互补于pol-α mRNA翻译起始区的ASODN可特异地抑制二株人胃癌细胞系的生长,而对正常人脐静脉内皮细胞则不起作用。流式细胞仪分析癌细胞G0/1期比率升高,S期及G2M期比率降低,说明ASODN通过抑制DNA pol-α表达而抑制了细胞DNA合成。     

反义mTOR逆转录病毒载体对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：观察反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)逆转录病毒载体对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活性的影响。方法：采用脂质体介导转染包装细胞后构建mTOR的反义重组逆转录病毒载体(pLXIN-AmTOR)感染VSMC，检测mTOR及其下游底物包括真核细胞启动子4E结合蛋白1(4E-BP1)和核糖体蛋白S6激酶(p70S6k)的表达变化，以及VSMC细胞增殖周期和增殖活性的改变。 结果：反义逆转录病毒载体转染PT67细胞后感染VSMC，能显著抑制mTOR的mRNA和蛋白产物表达，mTOR通路下游p70S6k表达相应减少，而4E-BP1的表达却显著增强;感染后的VSMC的分裂、增殖过程受阻，更多细胞停滞在G1期。 结论：成功构建反义mTOR逆转录病毒载体;感染VSMC后能明显抑制VSMC的分裂、分化和增殖。     

反义碱性成纤维细胞生长因子对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)反义脱氧寡核苷酸(AODN)对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响,并探讨其作用机制。方法利用脂质体分别将浓度为5μmol／L的bFGF反义、正义及随机寡核苷酸(ODN)导入体外培养的VSMCs;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot半定量测定方法,观测ODN对bFGF基因表达的影响;通过细胞活性测定观察ODN对VSMCs增殖的抑制作用。结果 bFGF、AODN作用于VSMCs后1-5 d,其相应的mR-NA表达和蛋白表达均明显减弱,细胞增殖活性受到抑制。反义组与对照组相比,mRNA在第1-4天表达差异有非常显著性(P<0.01),第5天有显著性(P<0.05);蛋白表达在1-5d差异有显著性(P<0.05);细胞增殖率在1-4 d差异有非常显著性(P<0.01),第5天差异无显著性(P>0.05)。而正义、随机组无此效应,同单纯脂质体和空白对照组相比差异无显著性(P>0.05)。结论 反义bFGF ODN可通过特异性抑制其相应基因表达来实现阻遏血管平滑肌细胞增殖。     

内皮素受体A反义寡核苷酸对人前列腺间质细胞增殖的抑制作用

目的　探讨内皮素受体A反义寡核苷酸 (ETAR ASODN)对人前列腺间质细胞体外增殖活性的抑制作用。　方法　原代培养前列腺间质细胞 ,第 4～ 6代细胞经鉴定后加入不同浓度人工合成的ETAR ASODN片段 ,观察细胞增殖情况 ,放射配基结合实验检测内皮素受体A(ETAR)蛋白合成。　结果　加入 5、10、15 μmol/LETAR ASODN的前列腺间质细胞A540 值分别为 0 .30 4± 0 .0 82、0 .2 96± 0 .0 0 8和 0 .194± 0 .0 6 1,增殖活性均较对照组明显降低 (P <0 .0 1) ,且呈浓度依赖性 (P<0 .0 5 ) ;15 μmol/LETAR ASODN对ETAR蛋白合成有明显抑制作用。 　结论　ETAR ASODN能有效抑制前列腺间质细胞的ETAR蛋白表达及体外增殖活性。     

中药及其分离物抑制血管平滑肌细胞增殖的研究进展

中药及其分离物抑制血管平滑肌细胞增殖的研究进展上海市中西医结合脉管病研究所（上海２０００８２）柳国斌吴金鸾屈立志宁炼陆婷动脉粥样硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＳ）是严重危害人类健康的常见病。近年来，在我国由于人民保健事业的发展，生活水平的提...     

反义N-ras寡脱氧核苷酸对前列腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨N-ras反义寡脱氧核苷酸（ASODN）对前列腺癌细胞增殖的影响。方法：针对N-ras基因转录、翻译起始区分别合成硫代修饰的ASODN，采用^3H-TdR掺入、流式细胞荧光免疫和斑点杂交法检测LNCaP细胞增殖和N-ras基因表达。结果：两种ASODN单独作用后，LNCaP细胞内N-ras mRNA、p21蛋白和PSA表达水平以及^3H-TdR掺入率明显低于对照组，10μmol/L浓度对细胞生长的抑制率分别达63％，51％；二者联合应用后，N-ras基因表达、PSA水平以及^3H-TdR掺入率进一步降低，细胞生长抑制率进一步增高达85％。结论：N-ras ASODN可有效抑制前列腺癌细胞增殖；同时证明N-ras在前列腺癌发生发展中起重要作用。     

血管紧张素Ⅱ1型受体的短发夹环RNA抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究

目的　探讨血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1R)的短发夹环RNA(shRNA)质粒 (pAT1R shRNA)对大鼠血管平滑肌细胞增殖变化的影响并探讨其发生机制。方法　构建pAT1R shRNA质粒转染入鼠血管平滑肌细胞中 ,应用逆转录聚合酶链反应及Westernblot检测血管平滑肌细胞 (VSMC)AT1R的mRNA和蛋白表达的变化 ;倒置相差显微镜观察VSMC形态学的变化 ;锥虫蓝染色法和MTT法检测VSMC增殖的变化等。结果　构建的质粒经测序鉴定验证与预期相符。转染细胞后逆转录聚合酶链反应的吸光度值比值结果pAT1R shRNA1和pAT1R shRNA2 组分别为 1 37± 0 15和 1 4 5± 0 12 ,与对照组 2 0 9± 0 2 6相比差异有显著性意义 (P <0 0 1) ;Westernblot吸光度值比值结果两质粒转染组分别为 1 12± 0 0 4和 1 2 0± 0 0 7,与对照组 3 17± 0 2 1相比差异有显著性意义 (P <0 0 1) ,提示两质粒均能明显降低AT1R的mRNA和蛋白表达。转染质粒同时加血管紧张素Ⅱ组的细胞计数结果两质粒转染组分别为 5 4 8± 0 4 4和 5 5 5± 0 4 5 ,与对照组 8 13± 0 4 1相比均减少、差异有显著性意义 (P <0 0 1) ,MTT法结果两质粒转染组吸光度值分别为 0 36 5± 0 0 2 4和 0 30 7± 0 0 2 5 ,与对照组 0 4 85±0 0 11相比均降低、差异有显著性意义     

VEGF反义核苷酸抑制胃癌生长及血管生成的在体实验研究

目的：探讨脂质体介导VEGF反义核苷酸对裸鼠胃癌肿瘤生长以及肿瘤血管生成的抑制作用,为临床应用反义核苷酸技术治疗胃癌提供理论依据。 方法：用人胃癌细胞SGC-7901建立裸鼠胃癌模型后,将胃癌裸鼠分为治疗组与对照组,治疗组腹腔内注射脂质体介导VEGF反义核苷酸,对照组注射生理盐水,连续注射4周。10周后处死裸鼠,比较两组肿瘤生长、转移情况以及肿瘤毛细血管密度等。 结果：与对照组比较,治疗组肿瘤的体积、质量明显减小、肿瘤周围的毛细血管密度、腹腔转移率明显降低（均P<0.05）。 结论：脂质体介导VEGF反义核苷酸对胃癌的生长转移以及血管生成等均有明显抑制作用。

     

血管平滑肌细胞增殖及定量分析研究

血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）过度增殖不仅直接导致移植静脉阻塞和血管成形术后再狭窄，而且与动脉粥样硬化形成密切相关，为深入研究其内在联系，近年开始寻求对ＳＭＣ增殖的定量分析方法，为进一步以分子生物学手段研究生长因子、细胞因子等与ＳＭＣ增殖间量效关系，为探讨再狭窄机理奠定了基础。     

反义寡聚脱氧核苷酸对黑素细胞TYR基因和黑素产量的调控作用

目的 设计并合成针对人酪氨酸酶的反义寡核苷酸，从基因表达水平调控细胞黑素的合成，为色素沉着性疾病的治疗寻找新途径。方法 将培养的黑素细胞分为内皮素处理组、紫外线处理组和对照组，并分别加入5′端反义核酸、3′端反义核酸、混合反义核酸或单纯脂质体，分别检测黑色素含量和酪氨酸酶mRNA的表达。结果 反义核酸对内皮素及紫外线照射引起的黑素细胞色素含量的增加以及TYR基因表达的增强有明显的抑制作用，其中3′端反义核酸作用最强。结论 反义寡聚脱氧核苷酸对黑素细胞黑素产量和TYR的基因表达有显著的调控作用，3′端反义核酸的调控作用优于5′端反义核酸。