人类蜕膜基质细胞的体外培养

目的 建立良好的人类蜕膜细胞培养方法。方法 选用早孕人工流产蜕膜组织进行体外培养，采用胰蛋白酶和EDTA消化，进行全组分蜕膜细胞培养，利用传3代的方法对蜕膜基质细胞进行分离提纯。制作细胞爬片，用泌乳素(prolactin，PRL)免疫组化试剂盒检测培养细胞成分。结果 免疫组化显示体外培养传代后97％蜕膜细胞为蜕膜基质细胞。结论 实验方法经济实用、简单，简化了蜕膜细胞的提纯程序，获得的蜕膜基质细胞纯度高。     

人早孕期蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞的分离培养方法

目的:建立一种经济、高效的人早孕期蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞分离、培养方法.方法:胶原酶、胰酶联合消化蜕膜组织,网筛过滤、密度梯度离心及差速贴壁法纯化细胞;免疫细胞化学法鉴定细胞纯度;MTT增殖实验分析细胞体外增殖活力.结果:利用此法可成功体外培养蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞,细胞纯度可达90％以上,并在体外呈现良好的生长状态.结论:此法经济、高效,能够同时获得纯度较高的蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞.     

人早孕期蜕膜及绒毛膜组织PRL和HPL的免疫组化定位

本研究用免疫组化方法观察了蜕膜组织及绒毛膜组织中的催乳索(Prolactin, PRL)和胎盘催乳素(Human placenta lactogen HPL)的分布。并用正常已婚未孕妇女子宫内膜对HPL作对照。结果:已婚未孕妇女子宫内膜HPL为阴性。②脱膜组织中蜕膜细胞的胞质对PRL显阳性,绒毛膜组织对PRL显阴性。③绒毛膜组织中合体滋养层细胞的胞质对HPL显强阳性。④某些部位蜕膜细胞之间分散或成群的小细胞对HPL显阳性。⑤侵入蜕膜组织中的绒毛外滋养层细胞的胞质对HPL显强阳性。⑥值得注意的是HPL在蜕膜组织的血管壁各层细胞中均呈阳性反应。特别是毛细血管内皮细胞对HPL的阳性反应,目前尚未见报道,有待进一步研究。     

人类蜕膜细胞体外培养研究

为了简化人类蜕膜细胞体外培养技术 ,采用复合消化酶改进蜕膜组织的消化过程 ,全组份蜕膜细胞培养加传代简化蜕膜基质细胞 (decidual stromal cell,DSC)提纯、泌乳素 (prolactin,PRL)免疫组化检测培养细胞组成。所采用的消化方法具有耗时少、消化彻底、活细胞率高等优点。PRL 免疫组化显示 95 %蜕膜细胞为 DSC。结果提示 :实验方法简单、经济、实用 ,简化了原来复杂的 DSC提纯程序。     

胎盘催乳素在米非司酮抗早孕流产后刮出物组织中的分布

对米非司酮抗早孕流产后子宫出血的３０ 例患者的刮出内膜组织,用免疫细胞化学方法显示胎盘催乳素（ｈＰＬ） 。结果：刮出组织含有正常子宫内膜组织、残留蜕膜组织和少量绒毛膜绒毛。ｈＰＬ 阳性物质分布于残留绒毛滋养层细胞、子宫内膜和蜕膜中的滋养层碎片及滋养层细胞芽,在残留蜕膜组织中还可见很多ｈＰＬ 阳性细胞（ 绒毛外滋养层细胞） 。药流后刮出组织ｈＰＬ 阳性细胞的显示有助于及时发现侵入母体组织细胞的增生和癌变。     

米非司酮对早孕大鼠蜕膜、黄体分泌组织型纤溶酶原激活因子及蜕膜组织学的影响

目的 进一步探讨米非司酮抗生育的作用机理。方法 应用酶联免疫吸附法检测早孕大鼠蜕膜、黄体组织培养液中组织型纤溶酶原激活酮子(tissue—type plasminogen activator，tPA)的含量，观察米非司酮对体外培养大鼠蜕膜形态学的影响。结果 加入米非司菌培养24h后，蜕膜和黄体组织培养液中的tPA含量与对照组比较均显著升高(P＜0．05)；米非司酮对早孕大鼠蜕膜形态学的影响表现为蜕膜组织退化，间质水肿，血管扩张及组织间血细胞渗出。结论 提示米非司酮还可能通过激活黄体和蜕膜的纤溶过程，引起黄体溶解及蜕膜细胞外基质退化、蜕膜剥脱，从而达到抗生育作用。     

人早孕蜕膜组织干细胞的分离与鉴定

目的 探讨人早孕蜕膜组织是否存在干细胞亚群(SP细胞)及其生物学特性.方法 取孕早期人流后子宫蜕膜组织,酶消化法获得组织细胞悬液,经Hoeehst33342染色或与维拉帕米共染后,采用免疫荧光细胞分选法(FACS)鉴定和分选干细胞,并以条件培养基培养观察细胞的增殖和集落生成能力.结果 孕早期子宫蜕膜组织中存在SP干细胞,其平均含量为(0.8±0.7)%,且在体外长期培养后有细胞增殖和形成集落.不同孕周间SP干细胞含量差异无统计学意义(P>0.05).结论 孕早期子宫蜕膜组织中存在SP干细胞,并具有细胞增殖和集落生成能力.     

Nur77促进人子宫内膜蜕膜化间质细胞中催乳素的表达

目的蜕膜化催乳素在妊娠的建立与维持中具有重要作用,但目前对参与蜕膜化催乳素表达调节因子的研究较少。文章旨在探讨孤儿核受体Nur77在人子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中对蜕膜化标志基因(Prolactin,PRL)的作用。方法制备Ad-Flag-Nur77重组腺病毒,通过荧光素酶报告基因和荧光定量PCR结合重组腺病毒介导的Nur77过表达及小干扰RNA沉默Nur77基因的实验,阐述Nur77对蜕膜催乳素的调控作用。结果成功获得滴度为8×1010ifu/ml的重组Nur77腺病毒,该腺病毒可在子宫内膜间质细胞中高表达Flag-Nur77融合蛋白;体外培养的人子宫内膜间质细胞经8-Br-cAMP和甲羟孕酮(medroxy progesterone,MPA)刺激后,Nur77的表达明显增加,并在体外诱导蜕膜化培养的第3天达到高峰;过表达Nur77可明显上调人子宫内膜间质细胞中dPRL(-332/+65)启动子活性>4倍,并以浓度依赖的方式明显增加人子宫内膜间质细胞中PRL mRNA的表达,P<0.01;功能缺失实验进一步表明基因沉默内源性Nur77蛋白表达明显抑制dPRL启动子活性达60%,同时显著抑制8-Br-cAMP和MPA诱导的人子宫内膜间质细胞中PRLmRNA的表达,P<0.01。结论孤儿核受体Nur77参与8-Br-cAMP和MPA诱导子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中PRL的表达调控。     

人早孕绒毛膜与蜕膜组织体外培养方法的研究

目的：探讨体外培养人绒毛膜组织和蜕膜组织的方法，并对其体外生长规律进行研究，方法：分别采取组织切割和胰酶消化处理两种人流组织，置RPMI－1640培养液，组织细胞可存活四周以上。结果：正常人流组织可在体外分离出绒毛膜组织和蜕膜组织，并能生长出单层组织，结论：分离培养的两种组织细胞可供体外基础与临床的实验研究。     

高纯度子宫内膜细胞分离和体外培养技术及其应用

目的：分离、纯化子宫内膜间质细胞（ESC）和腺上皮细胞，建立体外ESC蜕膜化模型。方法：选择正常育龄妇女的新鲜子宫内膜组织，经多酶消化制成细胞悬液，分离、纯化间质细胞和腺上皮细胞；分别培养至细胞聚合成片，随机分组，用等渗浓度的甾体激素诱导ESC体外蜕膜化改变。结果：分离的间质细胞其纯度达95%以上，其细胞活力达92%——95%。在此体外培养系统中，ESC对生理剂量激素的应答出现与活体相仿的蜕膜化改变。结论：利用此技术可在细胞和分子水平上研究子宫内膜的各种功能及其调节。     

人类早孕蜕膜对B淋巴细胞IgG分泌的影响

目的观察细胞因子对蜕膜细胞介导B淋巴细胞分泌IgG的影响，探讨蜕膜局部免疫微环境的免疫学特点。方法将γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素．2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）和表皮生长因子（EGF）加入培养的蜕膜细胞中，用蜕膜细胞的培养上清液刺激B淋巴细胞生长，通过放射免疫法测定作用不同时间后B细胞分泌的IgG的值。结果正常早孕蜕膜细胞的培养上清液可以刺激B淋巴细胞IgG的分泌：经细胞因子作用后的蜕膜细胞培养上清液使B细胞分泌的IgG明显上升，但这种作用与细胞因子的浓度、种类无明显相关性，而与细胞因子作用的时间具有一定关联．表现在第12小时实验组的IgG分泌显著上升（P〈0．05），到24、48h时实验组有逐渐下降趋势。结论在外源性细胞因子的作用下，蜕膜局部体液免疫反应增强，但这种增强可能是蜕膜局部免疫的自身调节作用．以维护妊娠的正常进行。     

蜕膜自然杀伤细胞趋化因子受体的表达及募集机制的研究

目的　研究早孕期人蜕膜自然杀伤 (NK)细胞趋化因子受体谱的表达及其特异性募集的机制。方法　收集早孕期蜕膜组织 ,免疫磁珠分选CD5 6 brightCD16 -NK细胞 ;逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测CD5 6 brightCD16 -NK细胞中 18种趋化因子受体的转录水平 ,筛选出高表达的趋化因子受体 (即CXCR4及CXCR3)。原位杂交及免疫组织化学分析CXCR4特异性配体基质细胞衍生因子 (SDF 1)在早孕胎盘的定位表达 ;ELISA检测早孕滋养细胞培养上清液中SDF 1α的浓度水平。趋化试验研究重组人SDF 1α(rhSDF 1α)及滋养细胞培养上清液对蜕膜CD5 6 brightCD16 -NK细胞的趋化作用。结果　人蜕膜CD5 6 brightCD16 -NK细胞可转录多种趋化因子受体 ,其中CXCR4及CXCR3mRNA呈高水平表达。人早孕期滋养细胞表达趋化因子SDF 1;原代培养的滋养细胞可自发分泌SDF 1α,培养 6 0h后上清液中SDF 1α的浓度达 385ng/L± 91ng/L。rhSDF 1α及滋养细胞培养上清液对蜕膜CD5 6 brightCD16 -NK细胞具有显著趋化作用。当rhSDF 1α为 10 μg/L时趋化至Transwell下室中的细胞可达总细胞数的2 2 9%± 4 3%。结论　人早孕期蜕膜CD5 6 brightCD16 -NK细胞高水平转录CXCR4 ,而滋养细胞则表达并分泌CXCR4的配体SDF 1。SDF 1趋化、募集CD5 6 br     

miR-181a促进人子宫内膜间质细胞蜕膜化催乳素的表达

目的目前虽已发现一些在胚胎着床过程中起重要作用的分子,但微小RNA(microRNA,miRNA)在蜕膜化过程中作用的研究报道较少,文中调查孕鼠围着床期子宫组织中miR-181a的表达规律,并探讨miR-181a对人子宫内膜间质细胞(human endometrial stromal cell,hESC)体外诱导蜕膜化过程中蜕膜化标志基因蜕膜化催乳素(decidual prolactin,dPRL)表达的调控作用。方法收集怀孕0～6.5 d孕鼠子宫组织,采用TRIZOL法提取总RNA,通过实时定量PCR检测子宫组织中miR-181a的表达。制备Ad-miR-181a重组腺病毒,并感染hESC,24 h后采用0.5 mmol/L 8-Br-cAMP和1μmol/L Medroxyproges-terone(MPA)联合进行体外蜕膜化诱导培养;通过化学发光免疫法和实时定量PCR分别检测细胞培养液上清中dPRL的浓度与间质细胞中催乳素(prolactin,PRL)mRNA的表达;同时采用荧光素酶报告基因检测miR-181a对hESC中dPRL(-332/+65)启动子的调控作用。结果早孕小鼠子宫组织中miR-181a的表达高于非妊娠小鼠子宫,且随着妊娠天数的增加呈逐渐上升的趋势,在小鼠着床"窗口期"即孕4.5 d达到高峰(2.60±0.15倍,P<0.01,n=5),孕5.5 d子宫miR-181a的表达开始平稳下降;成功获得滴度为5.19×1010ifu/ml的miR-181a腺病毒,该腺病毒介导的miR-181a过表达显著增加hESC蜕膜化标志基因dPRL mRNA表达水平,增高超过8倍(P<0.01);在8-Br-cAMP和MPA联合诱导hESC体外蜕膜化时,高表达miR-181a可明显增加8-Br-cAMP联合MPA诱导的PRL mRNA表达水平与PRL蛋白分泌(P<0.01)。荧光素酶报告基因进一步证实miR-181a可以激活dPRL(-332/+65)启动子的活性达到2倍(P<0.05)。结论 miR-181a参与8-Br-cAMP和MPA诱导子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中PRL的表达调控。