脂质体微泡对超声介导基因转染的增效作用研究

目的 探讨超声介导基因转染时,脂质体微泡(LM)对体内、外红色荧光蛋白基因(RFP)转染的增效作用及其安全性.方法将RFP和LM加入培养的Hela细胞后行超声辐照(US),对微泡浓度、超声强度、辐照时间进行优化研究,运用荧光显微镜、流式细胞术评估基因转染率,并对细胞损伤进行分析.在裸鼠移植瘤的体内实验中,将LM和RFP质粒(P)经尾静脉注入后予以超声辐照(P+LM+US),以单纯质粒注射(P)、P+US、P+LM作为对照,行冰冻切片,组织学检查,RFP表达检测.结果培养的Hela细胞经LM和超声辐照联合处理后,RFP基因转染率显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01),在超声强度为1.0 W/cm2、微泡浓度为6%、辐照3 min的条件下最显著,且未发现显著的细胞损伤.P+LM+US组的裸鼠移植瘤内RFP表达显著高于P组、P+US组或P+LM组,差异均有统计学意义(P＜0.01),且未观察到明显的组织损伤.结论 LM对超声介导基因转染的体内、外转染效率有显著的增效作用,而无明显的细胞或组织损伤,为临床基因治疗提供一种新颖、高效、安全的非病毒基因转染方法.     

超声辐照SonoVue增强脂质体介导pEGFP-N1转染乳腺癌细胞

目的 探讨超声辐照SonoVue介导增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP-N1)转染乳腺癌MCF-7细胞的最优条件以及超声联合微泡造影剂增强脂质体转染的效果.方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,按照不同的辐照条件分组:不处理组,超声辐照十质粒组,微泡浓效组,超声声张组,辐照时间组及工作周期组.分别进行超声辐照,辐照后以MTT法测细胞存活度,流式细胞仪测pEGFP-N1瞬时转染率,取得最佳的辐照条件.重新准备细胞后先以脂质体转染细胞,2 h后加入超声微泡并以最佳条件辐照,用同样的方法测细胞存活率及转染率.结果 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期(占空比)为超声辐照SonoVue介导pEGFP-N1转染MCF-7细胞的最优条件,转染率为(14.21±2.55)%,细胞存活率为(84.60±2.85)%.在增强脂质体转染的实验中,超声微泡脂质体组的转染率最高(22.15±2.69)%,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05),此时细胞存活率为(80.13±3.61)%.结论 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期是MCF-7细胞的最佳转染条件,超声联合微泡能够增强脂质体转染的效果.     

超声介导微泡破裂增强体外基因转染的方法学研究

目的 对超声促进基因转染的方法进行系统的优化研究,初步确定超声介导微泡破裂(UMMD)增强体外基因转染的最优参数.方法 选用 Ishikawa、Hela 和 MCF-7 3种细胞系为研究对象,用1 MHz超声仪.超声强度为1.0W/cm2,系统研究不同参数下的细胞活力及两种DNA质粒[红色荧光蛋白质粒(DsRed)和荧光索酶质粒(pCMV-LUC)的基因转染情况,优化UMMD的转染条件(质粒浓度、占空比及辐照时间),分析SonoVue微泡对基因转染的增强作用.结果 基因转染率随着质粒浓度的增加而增高,当质粒浓度达到30 μg/孔时转染率最高,两种DNA质粒的最佳转染浓度相同.与10%占空比的超声辐照相比,20%占空比的转染率显著提高(P＜0.01).辐照3 min时基因表达率最高,但存活率无明显下降(89.03±2.01)%,为最佳辐照时间.无超声辐照时,单独应用质粒或微泡十质粒的样本几乎不表达红色荧光蛋白.与单纯超声辐照相比,超声辐照联合SonoVue微泡可显著提高基因转染效率(P＜0.01).结论 UMMD的转染参数影响转染效率和细胞活力,优化的参数有利于促进基因转染.     

低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞

目的探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化。方法将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10%、20%、30%、40%和50%)6个亚组。经超声辐照,24h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率。结果脂质体+微泡+超声组基因转染效率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20%亚组基因转染率最高。结论低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20%是体外基因转染前列腺癌细胞的最佳微泡浓度。     

超声波与微泡声学造影剂增强体外培养肿瘤细胞基因转染实验研究

目的观察超声波与微泡声学造影剂能否增强体外培养肿瘤细胞基因转染及其转染效率,初步摸索适宜的超声辐照条件.方法将培养的HepG2细胞分为3组,第1组为单纯造影剂转染组:加入5 μg绿色荧光蛋白质粒(PEGFP-C1)与微泡声学造影剂混合液进行转染;第2组为脂质体转染组:用相同浓度PEGFP-C1质粒进行常规脂质体转染;第3组为造影剂加超声辐照转染组:加入5 μg PEGFP-C1质粒与微泡声学造影剂混合液,然后分别用0.25 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2超声波经培养板底部辐照10 s.24 h后用荧光显微镜观察各转染组细胞荧光蛋白表达情况,计录每高倍视野(400×)荧光蛋白表达阳性细胞数.结果单纯造影剂转染组未见荧光蛋白表达阳性细胞,造影剂加超声辐照转染组可见不同程度荧光蛋白表达,其中以0.5 W/cm2超声辐照组表达最强,每高倍视野绿色荧光蛋白表达阳性细胞数为(20.7±3.2)个/HP,高于0.25 W/cm2与1.0 W/cm2超声辐照组[分别为(4.8±1.9)个/HP;(9.9±2.3)个/HP],与脂质体转染组[(22.1±3.5)个/HP]比较无显著差异(P>0.05).结论微泡声学造影剂加一定强度的超声辐照能显著增强体外培养肿瘤细胞的基因转染与表达,超声辐照条件是影响转染率的重要因素,适宜条件时其转染效率与常规脂质体转染方法无显著差异.     

共聚物P85和微泡造影剂对小鼠骨骼肌超声介导基因转染的影响

目的 探讨共聚物P85、微泡造影剂和超声在质粒DNA对小鼠骨骼肌基因转染中的影响.方法 应用共聚物P85、微泡造影剂Optison与DNA混合后直接小鼠胫前肌(TA)注射,并辐照超声.1周后取出胫前肌并快速冰冻切片,荧光显微镜计数表达GFP转染的肌纤维数,HE染色评价肌肉损伤情况.结果 共聚物P85和微泡造影剂Optison均可促进质粒DNA的基因转染(P<0.01,P<0.05).辐照超声可使P85介导的基因转染效率显著提高(P<0.01),但对微泡造影剂介导的基因转染却无显著提高(P>0.05),并且P85所介导的基因转染效率高于微泡造影剂介导的基因转染效率(P<0.01).微泡造影剂和P85耦合并辐照超声可使质粒的基因转染效率显著提高,与所有各组的差异有统计学意义(P<0.01).同时辐照超声显著增加含微泡造影剂组骨骼肌的损伤面积(P<0.01).结论 共聚物P85和微泡造影剂可介导质粒DNA的基因转染,辐照超声对其有促进作用,三者联合应用具有协同作用.     

不同超声参数及转染方式对细胞活力和红色荧光蛋白基因传输的影响

目的 探讨不同超声参数和转染方式对细胞活力和红色荧光蛋白(RFP)基因传输的影响.方法 以两种不同的转染方案培养人宫颈癌细胞(Hela):(A)培养24 h以完全黏附培养板;(S)细胞悬液.对培养的细胞进行超声辐照(强度为1.0 W/cm2;占空比10%、20%、50%;辐照1 min或3 min),比较这两种转染方案和不同超声参数对细胞活力及RFP表达效率的影响.运用最优参数对其他4种不同类型的细胞(HepG2、lshikawa、MCF-7和B16-F10)行超声处理.结果 A组细胞活力随着占空比的增加、辐照时间的延长而逐步降低,超声辐照导致贴壁的细胞从培养板脱离.与A组相比,S组经相同超声参数转染的细胞数目明显增加,但存活率无明显下降.悬浮方式的转染方案,20%占空比,辐照3 min,是获得较高基因转染效率[(28.04±2.27)%]和存活率[(81.20±1.73)%]的最优选择.当培养细胞暴露于最优条件时,不同类型的细胞对超声的反应性不同.与非辐照组相比,辐照组转染率和死亡率均有不同程度的增加.结论 不同超声参数和转染方式对细胞活力和基因传输效率有较大的影响,对超声介导微泡增强的基因传输需要深人地进行优化研究,以提高转染效率.     

超声微泡造影剂促腺病毒介导MDR1基因转染兔骨髓单个核细胞的作用机制及安全性研究

目的 探讨超声微泡造影剂促进以腺病毒为载体介导的多药耐药基因1(MDR1)体外转染兔骨髓单个核细胞的作用机制和安全性.方法 根据是否加入超声微泡造影剂和进行超声辐照将分选的兔骨髓单个核细胞分为常规培养组(A)、腺病毒转染组(B)、腺病毒转染+超声辐照组(C)、腺病毒微泡造影剂转染组(D)和腺病毒微泡造影剂转染+超声辐照组(E).不同实验因素处理后,采用流式细胞仪检测各组细胞外源性MDR1基因的转染率,同时观测转染后不同时间各组细胞体外扩增情况;台盼蓝拒染法计数各组细胞的存活率;分别用扫描电镜和透射电镜观察超声辐照后细胞超微结构的改变.结果 流式细胞仪检测各组细胞MDR1基因的转染率分别为0.39%土0.11%、5.03%±0.35%、4.93%±0.38%、5.25%±0.80%,19.93%±1.51%,E组明显高于其余4组(P＜0.05);试验各组细胞在转染后不同时期体外增殖情况差异无统计学意义(P＞0.05),各组细胞存活率差异亦无统计学意义(P＞0.05);一定强度的超声辐照后,骨髓单个核细胞胞膜出现一过性的小孔,细胞器发生可逆性肿胀改变.结论 超声微泡造影剂可使兔骨髓单个核细胞通透性暂时性提高,促进腺病毒载体介导的MDR1基因转染;同时不会对细胞的增殖能力、存活率及超微结构造成严重的不可逆损害,证明其是一种安全可行的基因转移新方法.     

超声介导声诺维提高人血管内皮细胞基因转染效率的体外实验研究

目的探讨使用超声破坏微泡造影剂-声诺维的方法对脂质体介导的增强型绿色荧光蛋白(EPGFP)基因转染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的作用。方法在单孔培养皿中加入HUVEC细胞悬液,每孔加入脂质体介导EPGFP4μg,加或不加微泡造影剂或不同条件的超声辐照。24h后,用荧光显微镜及流式细胞仪测量EPGFP在细胞内的表达及基因的转染效率。结果超声组转染率提高,超声 微泡组转染率明显提高。超声 微泡组,超声辐照时间60s机械指数(MI)1.4组转染效率最高;超声机械指数1.0辐照时间90s组转染率最高。结论声诺维在超声作用下能明显提高脂质体介导的基因对细胞转染的效率,可能作为基因治疗的载体。     

超声微泡介导绿色荧光蛋白基因在视网膜神经节细胞表达的实验研究

目的探讨超声微泡介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中的转染效率、优化转染的条件及毒性。方法体外培养RGCs,以GFP基因为报告基因,微泡造影剂(声诺维)为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染RGCs。实验组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成亚组;对照组为空白对照。荧光显微镜和流式细胞仪测定GFP的表达,MTT法检测RGCs的活性。结果与超声+质粒组相比,超声+微泡+质粒组RGCs转染率增加约5倍。优化转染条件后,频率300kHz,声强1.25W/cm2,连续波,辐照时间60s,微泡浓度45μg/ml,质粒浓度50μg/ml时,24孔板培养的RGCs转染率为(26.87±3.12)%。毒性实验证明超声微泡在该条件下进行基因转染对RGCs无毒副作用。结论在一定条件下,超声破裂微泡能增强基因的转染与表达,有望成为一种安全、有效的基因载体。