从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：以表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体,对其抗原结合活性的序列进行分析鉴定。结果;经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗角蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判断所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体1

目的从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛(Dig)人单链抗体(ADAScFv),为Dig中毒的诊断和治疗提供人源性抗体.方法1以改良法制备Dig-BSA偶联物;2以固相化的Dig-BSA偶联物对人噬菌体ScFv抗体库进行了4轮筛选,通过ELISA筛选出能结合Dig的抗体克隆并鉴定其活性,通过ELISA竞争抑制实验分析其特异性,对阳性克隆的DNA进行测序分析.结果1在对抗体库的筛选过程中可见有明显的富集;2获得一株可结合Dig及其类似物的阳性克隆;3阳性克隆的可变区分别属于VH5和Vλ1亚群.结论利用噬菌体抗体库技术获得了能与Dig及其它洋地黄类药物结合的人ADAScFv,经进一步分析及抗体工程改造后,有可能为临床上诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源性抗体.     

从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛（Dig）人单链抗体（ADA ScFv），为Dig中毒的诊断和治疗提供人源性抗体。方法：①以改良法制备Dig-BSA偶联物②以固相化的Dig-BSA偶联物对人噬菌体ScFv抗体库进行了4轮筛选，通过ELISA筛选出能结合Dig的抗体克隆并鉴定其活性，通过ELIS竞争抑制实验分析其特异性，对阳性克隆的DNA进行测序分析。结果：①在对抗体库的筛选过程中可见有明显的富集；②获得一株可结合Dig及其类似物的阳性克隆；③阳性克隆的可变区分别属于VH5和Vλ1亚群。结论：利用噬菌体抗体库技术获得了能与Dig及其它洋地黄类药物结合的人ADA ScFv，经过一步分析及抗体工程改造后，有可能为临床上诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源性抗体。     

从噬菌体库中筛选抗SARS病毒S蛋白的Fab中和活性抗体研究

目的 从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性的抗S蛋白Fab片段抗体。方法ELISA方法对抗体库进行富集筛选及人源抗体克隆结合活性的测定，竞争ELISA初步筛选有中和活性的抗体，中和试验进一步确定中和活性，进而对其序列进行测定和分析。结果特异性富集了抗S蛋白噬菌体抗体，竞争ELISA筛选出两株抗体可部分阻断中和抗体2C5与S蛋白的结合，中和试验确定其具有一定巾和活性，编号为M1A和P8A，测序结果表明它们为两株不同的抗体克隆。结论筛选获得了两株抗体可部分中和SARS病毒活性，它们的获得为探索SARS病毒感染的被动免疫治疗打下了一定基础。     

抗恶性疟原虫HRP—Ⅱ单链抗体的筛选与特性分析

目的：筛选抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白2（HRP－Ⅱ）单链抗体（SeFv)并对其进行鉴定。方法：从抗恶性疟原虫HRP－Ⅱ ScFv库中，挑取单菌落鉴定重组噬粒，采用ELISA法筛选能与重组抗原HRP－Ⅱ结合的阳性噬粒，采用ELISA法筛选能与重组抗原HRP－Ⅱ结合的阳性克隆，并选其中2株强阳性克隆进行序列分析。结果：筛选到8株具有HRP－Ⅱ结合活性的阳性克隆，所测2株克隆的基因序列一致，其重链及轻链分别属于鼠抗体基因家族中第I及kVI亚群。结论：从抗体库中成功地筛选出阳性克隆，为基因工程抗体在恶性疟诊断试剂中的应用奠定了基础。     

抗人巨细胞病毒中和性人源基因工程抗体的研究

目的 研究抗人巨细胞病毒(HCMV)人源基因工程抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术。首先从HCMV感染者外周血中分离淋巴细胞，提取RNA，逆转录后用特异性引物扩增轻、重链基因。然后插入噬菌体载体pComb3，构建噬菌体抗体库。使用纯化的HCMV病毒裂解物对噬菌体抗体库进行4轮富集，然后通过ELISA筛选阳性克隆，并对获得的克隆进行功能鉴定。结果 克隆和表达了3株抗HCMV人源Fab抗体，经ELISA证明均具有抗原结合活性，间接免疫荧光试验证明具有较高的特异性，最后通过病毒中和试验证明其中2株具有中和活性。结论 获得2株抗HCMV人源Fab抗体，具有一定的中和活性，为下一步研究抗HCMV人源全抗体奠定了基础。     

从噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白单链抗体

目的　从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体 (scFv)并进行鉴定。方法　以人表皮角蛋白为抗原 ,通过“吸附 洗脱 扩增”过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白单链抗体 ,对其抗原结合活性、识别角蛋白的相对分子质量 (Mr)和序列进行分析鉴定。结果　经过筛选 ,获得 6株能与角蛋白特异性结合的阳性克隆 ,所识别角蛋白的Mr 相同 ,均在 5 6 0 0 0～ 5 70 0 0之间 ;序列分析显示 ,所获抗体克隆的可变区基因分别属于免疫球蛋白基因家族的不同亚群。结论　利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫制备出高特异性的人源性抗角蛋白单链抗体     

利用噬菌体抗体库制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ抗体

目的： 制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ（β2GPI）抗体Fab片段。方法: 以人β2GPI为抗原,从人源性天然抗体库中筛选特异性Fab抗体,并用ELISA方法对所获抗体进行抗原结合活性和特异性鉴定。结果: 通过4轮“亲和吸附-洗脱-扩增”筛选,获得2株抗β2GPI抗体。酶切去掉载体上的噬菌体基因III,得到了可溶性表达的Fab段。经过鉴定,所获抗体具有良好的抗原结合活性和特异性。结论: 利用人源性天然抗体库成功制备了2株抗β2GPI Fab抗体,为深入研究该抗体在抗磷脂抗体综合征发病机理中的作用和探讨新的治疗措施奠定了基础。     

人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定

目的 用重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体(scFv).方法 用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果 从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论 通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.     

从噬菌体抗体库中筛选抗Cry1Ac蛋白单链抗体

目的:从Tomlinson J噬菌体抗体库中筛选人源化抗Cry1Ac蛋白单链抗体(scFv)并进行鉴定.方法:以Cry1Ac蛋白为抗原包被固相,经4轮"吸附-洗脱-扩增"过程后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对其进行基因序列测定.结果:经过4轮筛选,获得了2株能与Cry1Ac蛋白特异性结合的阳性克隆.结论:利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Cry1Ac蛋白scFv,为Cry1Ac毒素蛋白检测提供了条件.     

人源抗梭曼过渡态类似物(P6)的抗体筛选

目的:从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗梭曼过渡态类似物的人源单链抗体(scFv)并进行鉴定。方法:以膦酸梭曼水解过渡态类似物五配位-羟基膦酸酯,3-羟基-1-对硝基苯基甲膦酸单频哪基醇酯,为半抗原,通过吸附-洗脱-扩增过程从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性抗体,对其抗原结合活性进行鉴定。结果:经过4轮的筛选,分别获得14个抗梭曼类似物的阳性克隆。经DNA指纹分析,判断所获克隆分别包含4个不同的抗梭曼类似物的scFv基因。结论:利用噬菌体抗体库技术获得了特异性的人源抗梭曼类似物抗体。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

从大容量人源噬菌体抗体库中筛选抗黑素瘤特异性抗体

目的:用黑素瘤(MM)细胞系筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与MM细胞特异性结合的人源性单链抗体(scFv)。方法:用完整的MM细胞对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,并通过细胞ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步做DNA序列测定和免疫组化染色鉴定。结果:从80个随机挑选的克隆中,筛得1株抗MM细胞的抗体,该抗体对人的鳞癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、角蛋白、胰蛋白酶、转铁蛋白及小鼠IgG等细胞或抗原的结合反应均呈阴性。免疫组化染色显示,该抗体与MM细胞系Libr的染色呈阳性,对黑素细胞和痣细胞的染色呈阴性。DNA测序结果表明,该抗体VH属于人IgGVH5亚群,VL属于人Vκ亚型。结论:通过筛选噬菌体抗体库获得到1株抗MM细胞的特异性抗体,为MM的靶向治疗研究奠定了基础。     

Screening of human anti-TNF-alpha scFv from large phage library

AIM: To clone human anti-TNF-alpha scFv from large phage antibody library. METHODS: Panning of large phage library against TNF-alpha was conducted to select specific antibodies. The antigen binding activity and DNA sequence were determined and analyzed by ELISA, restriction enzyme map. RESULTS: After 4 rounds of panning, 62 positive clones were obtained and 27 clones had specific binding ability to TNF-alpha. DNA fingerprinting of the 27 clones showed 7 different stripes indicated 7 different positive clones. 5 of the 7 clones expressed soluble anti-TNF-alpha activity. DNA sequence analysis showed that the variable regions of these scFvs belonged to different subgroups. CONCLUSION: Human TNF-alpha scFv have been successfully obtained from large phage antibody library.     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。