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1.
目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性. 相似文献
2.
目的 表达重组人SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)蛋白并制备单克隆抗体.方法 构建含人SUMO1基因的重组表达质粒pET32a-HIS-SUMO1,在大肠杆菌中表达重组蛋白HIS-SUMO1;以纯化后的HIS-SUMO1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过ELISA和Western blot方法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定抗体Ig的类型及亚类;取一株筛选细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore抗体纯化试剂盒进行抗体纯化,Western blot方法检测抗体效价.结果 表达纯化了重组人HIS-SUMO1蛋白;3株稳定分泌特异性抗人SUMO1的单克隆抗体杂交瘤细胞株被筛选出,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得效价较高的鼠抗人SUMO1单克隆抗体.结论 通过表达纯化人SUMO1重组蛋白,制备出高效价鼠抗人SUMO1的单克隆抗体,该抗体可用于蛋白质SUMO化的研究. 相似文献
3.
人重组TNF-α突变体471蛋白的初步纯化及生物学活性 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:在利用原核表达系统表达重组人突变体471 TNF—α蛋白的基础上,对该蛋白进行初步纯化及生物学活性检测。方法:利用最佳发酵和表达条件,诱导基因重组的人突变体471 TNF—α工程菌表达目的蛋白。收集菌体,经超声破碎,分离人突变体471 TNF—α的包涵体,并观察变性剂及蛋白浓度对蛋白折叠的影响。采用MTT比色法检测并比较人野生型及突变体471 TNF—α的生物学活性。结果:在适当的变性与复性条件下,已成功地将突变体471 TNF—α折叠并聚合形成具有生物学活性的三聚体。突变体471 TNF—α对L929的细胞毒活性高于野生型TNF—α的15倍。结论:原核表达系统中表达的人突变体471 TNF—α经复性处理后具有显著的生物学活性,为进一步进行动物实验及临床研究奠定了基础。 相似文献
4.
目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性.方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性.结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104 IU/mg.结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当.为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础. 相似文献
5.
目的:利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人T-bet基因全长序列,并对表达产物进行纯化、免疫动物和制备多克隆抗体。方法:利用PCR技术从克隆载体pGEM-T/T-bet获得人T-bet的全长编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pT-bet;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌JM109,测序鉴定后转化M15,经IPTG370C诱导4h后,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色判断以包涵体形式存在的带有6×His标签的融合蛋白(表达产物),用Ni^2+ -IMAC层析柱对融合蛋白进行纯化;将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备人T-bet的多克隆抗体。结果:成功表达和纯化了人T-bet,并制备了多克隆抗体,ELISA和Western blot结果显示了血清抗体的高效价(1:100000)和高度特异性。结论:成功构建了原核表达载体pT-bet,并在工程菌M15中获得大量表达,经纯化后获得高纯度的人T-bet蛋白,制备了效价和特异性良好的多克隆抗体,为进一步研究T-bet的生物学功能奠定了的基础。 相似文献
6.
目的:制备高纯度的重组人MAdCAM-1蛋白。方法 采用PCR技术从pUC21/hMadCAM-1质粒上,选择性扩增编码成熟MAdCAM-1胞外区两个Ig域的基因片段。将其克隆至pQE30载中,转化大肠杆菌后,以IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA亲和层析纯化。结果:诱导表达出相对分子质量(Mt)约29000的融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的50%左右。经亲和层析纯化得到高纯度的蛋白产品。结论 获得了重组人MAdCAM-1胞外区蛋白,为后续功能研究及其单抗研制奠定了基础。 相似文献
7.
目的:构建原核表达质粒pGEX-4T-1 -GRP78,诱导表达、纯化后检测GRP78蛋白的抗原活性.方法:利用PCR方法从本实验室已构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)上扩增GRP78基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组载体pGEX-4T-1 -GRP78.转化至大肠杆菌BL21( DE3)中诱导表达,再将所表达的融合蛋白进行纯化.经SDS-PAGE分析后,将所得产物用Thrombin切割;进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价.结果:酶切和测序结果均证实GRP78原核表达载体构建正确,可诱导表达;ELISA检测显示纯化后的人GRP78抗原具有免疫原性.结论:成功构建了人GRP78基因的原核表达载体,获得了纯化的GRP78蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以GRP78为基础的肝细胞癌的血清学检测提供了抗原. 相似文献
8.
synucleins是脊椎动物中高度保守的小分子量蛋白家族 ,主要在神经元表达 ,在突触前末梢尤为丰富。SNCG(synucleingamma;spersyn ;breastcancer specificprotein 1)是该家族的第三个成员 ,在脑中广泛表达 ,其表达异常与神经退行性病变和细胞恶变都有一定的相关性。它在神经元胞质中广泛分布 ,可能起到维持神经纤维网络完整性的作用[1 ] 。γ synuclein蛋白的N末端与脑中参与多种信号通路的 14 3 3蛋白家族成员有较高的同源性 ,具有分子伴侣的特性 ,参与MAPK途径的调节。为了研究SNCG基因及其表达产物在神经系统中的作用 ,本研究采用RT… 相似文献
9.
目的 克隆血小板衍生的生长因子A链(PDGF-A)的基因,并在大肠杆菌中表达。方法 利用RT-PCR法,从人肝癌细胞系(HHCC)的总RNA中,扩增PDGF-A的全长cDNA,再用PCR法扩增PDGF-A成熟蛋白的全长编码序列,编码序列经测序验证后,克隆入表达载体pGEX-4T-1中,构建PDGF-A的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白,并进行谷胱甘肽(GST)亲和层析纯化。结果 以RT-PCR扩增的PDGF-A基因的全长为1255bp,以PCR扩增得到其成熟蛋白的编码序列为531bp,构建了PDGF-A基因的原核高效表达载体pGEX-PDGF-A。表达产物主要位于包涵体内,对包涵体蛋白进行变性和复性处理后,利用亲和层析法获得纯化的目的蛋白,结论 成功地扩增到PDGF-A成熟蛋白的编码序列,并在大肠杆菌高效表达,为进一步对PDGF-A功能的研究提供了有利的工具。 相似文献
10.
目的:以特定形式对高度疏水性的人Bcl-2(hBcl-2)蛋白进行可溶性表达,获得非疏水性hBcl-2蛋白并具备生物学结合活性,为进一步研究hBcl-2三维结构并在此基础上研发特异性小分子药物提供充足的蛋白样品。方法:用PCR方法对hBcl-2基因进行克隆重组,插入原核表达载体pET28a( )中。用Western Blot和MALDI-TOF生物质谱鉴定,采用荧光极化方法进行活性测定。结果:重组hBcl-2在E.Coli中实现了高效、可溶性的融合表达,重组蛋白经纯化至电泳纯,具备了与Bcl-2家族Bak蛋白BH3功能域特异结合的能力,表明原核表达的重组hBcl-2具有较好的结合活性。结论:成功地对重组hBcl-2蛋白进行了可溶性表达和活性测定。 相似文献
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Cloning, sequencing, expression, and purification of SARS-associated coronavirus nucleocapsid protein for serodiagnosis of SARS 总被引:7,自引:0,他引:7
Khalid Amine Timani Li Ye Linbai Ye Ying Zhu Zhenghui Wu Zuojiong Gong 《Journal of clinical virology》2004,30(4):309-312
A novel coronavirus has been associated with a worldwide outbreak of atypical pneumonia referred to as Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS-CoV). SARS-CoV nucleocapsid (N) protein has been cloned sequenced and expressed in Escherichia coli strain. Purified N protein was used to measure the SARS-CoV specific IgG antibodies from 16 SARS-CoV infected patients' sera and from 131 control subjects using ELISA assay. Specific antibody responses to the purified recombinant N protein after 10, 20, and 30 days of disease onset were observed in 13 of 16 (81.3%), 16 of 16 (100%) and 16 of 16 (100%) SARS patients sera, respectively. Comparison of detection results with a commercially available diagnostic kit coated with a mixture of SARS-CoV viral proteins showed 9 of 16 (56.3%), 13 of 16 (81.3%), and 15 of 16 (93.7%) positive responses, respectively. None of 131 control sera gave positive reaction in either assay. This data suggests that the N protein of SARS-CoV is immunodominant and this ELISA based test assay for detecting the SARS-CoV N antigen may hold a significant value for SARS diagnosis. 相似文献
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人促血液血管生成素的原核表达、分离纯化及活性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的利用基因工程技术获得重组的人促血液血管生成素(HAPO),以探讨其对骨髓细胞的作用。方法提取人胎肝总RNA,利用RT-PCR、克隆HAPO cDNA插入表达载体pET32c,使之在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;用DEAE Sephamse Fast Flow阴离子交换柱、Ni-Chelating Sepharose Fast Flow亲和柱以及SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱分离纯化,肠激酶酶切,液体培养小鼠骨髓细胞。结果经IPTG诱导HAPO实现了在大肠杆菌中的可溶性表达,经一系列层析获得融合的rh-HAPO,肠激酶酶切除去N-端融合部分后,获得高纯度的rh-HAPO。液体培养小鼠骨髓实验发现rh-HAPO可促进CD34^+细胞和flk-1细胞的增殖。结论重组蛋白rh-HAPO可促进造血干/祖细胞的增殖。 相似文献
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重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因(hspA),并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后,克隆于表达载体pIM-1中,转化大肠杆菌。以SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达,并测定N-端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析,对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp,并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60.5%。免疫印迹及氨基酸测序结果证实,表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87.8%,结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化,为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。 相似文献
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目的:新近研究发现EGFL7蛋白与肝癌密切相关。本研究对基因egfl7进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法:通过RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增egfl7目的片段,利用基因重组技术构建pET21a(+)-TRX-EGFL7原核表达载体,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白EGFL7,SDS-PAGE鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中EGFL7蛋白水平。结果:成功地构建了原核表达质粒pET21a(+)-TRX-EG-FL7。并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以包涵体的形式存在。SDS-PAGE和Western blot证实,重组EGFL7蛋白质与预期结果一致,抗血清能够特异地识别重组蛋白和血清蛋白质。结论:成功制备了EGFL7蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究。 相似文献
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目的为了提高肺表面活性物质的疗效及减少异性蛋白造成的免疫反应,我们对猪肺组织中的肺表面活性物质蛋白B和C进行了提取及纯化.方法用生理盐水灌洗猪肺后,经低温离心,萃取,层析来提取肺表面活性物质蛋白B和C,又用高效液相色谱纯化蛋白B和C.并用膜天平测定所提纯的肺表面活性蛋白SP-B和SP-C的生物活性.结果用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,显示杂蛋白条带明显减少,分子量分别为6.7×1000、17.9×1000.且提纯的蛋白用较好的生物活性.P<0.05.结论高效液相色谱能在分子水平上纯化肺表面活性物质蛋白B和C,并较好地保持了其生物活性. 相似文献
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目的构建人络氨酸激酶6(PTK6)与His融合蛋白重组表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。方法通过PCR在编码PTK6的cDNA序列两端添加EcoR I和BamH I酶切位点,双酶切后将编码PTK6的cDNA序列亚克隆至原核表达载体PHUE构建重组蛋白表达载体PHUE/PTK。重组载体经鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞。IPTG诱导重组蛋白表达。收集菌体裂解后,用尿素洗涤和溶解包涵体。溶解上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化产物。结果成功构建人PTK6重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为55 000,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度大于80%的目的重组蛋白。结论人PTK6 His融合蛋白的纯化为多克隆及单克隆抗体的制备以及结构和功能的研究奠定了基础。 相似文献
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目的 克隆人乳腺珠蛋白(hMAM)基因,原核表达重组蛋白并纯化,为建立一种新的乳腺癌诊断方法奠定基础.方法 从人乳腺癌组织中提取总RNA,经RT-PCR合成cDNA,设计特异性的引物,用PCR的方法扩增出目的片段,构建PET-32A-hMAM和PGEX-4T1 -hMAM表达载体,在BL21菌中表达hMAM重组蛋白,纯化,并进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定.结果 经RT-PCR、PCR扩增后得到一条207 bp的DNA片段,构建载体后DNA测序,结果与预期序列一致.表达和纯化的融合蛋白相对分子质量大约为28 000,与预期结果一致.结论 成功克隆hMAM基因,并获得高纯度的hMAM重组蛋白,为进一步开发hMAM诊断试剂打下基础. 相似文献
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目的:为了得到可溶性表达的人促血液血管细胞生成素(HAPO)蛋白, 构建含HAPO基因片段的pET22b(+)表达载体, 获得纯化的HAPO蛋白并检测其生物学活性.方法:利用RT-PCR技术从人胎肝中获得HAPO cDNA片段, 并克隆至表达载体pET22b(+)中, 利用基因工程菌BL21(DE3)进行表达, 产物利用Ni2+-螯合亲和层析及SP Sepharose FF柱层析分离纯化. 采用黏附实验检测HAPO对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)黏附性的影响.结果:从人胎肝中克隆出长为897 bp HAPO目的片段, 成功构建重组质粒pET22b(+)-HAPO, 其表达的融合蛋白以可溶状态存在, 表达量占菌体总蛋白的10%, 经分离纯化融合蛋白的纯度可达80%.活性测定结果表明HAPO以剂量依赖性方式增加HUVEC的总黏附性.结论:可溶性表达了HAPO蛋白, 并用体外实验证实HAPO对造血干/祖细胞归巢有一定促进作用. 相似文献