人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4片段的克隆和在寻常型天疱疮中免疫识别的初步研究

目的 扩增人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4(desmoglein 4,Dsg4)胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4的核酸序列,为寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris, PV)发病机制的研究提供依据.方法 根据GenBank中的Dsg4序列(登录号为AY177664)分析,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人正常皮肤组织中抽提RNA,逆转录合成cDNA,聚合酶链反应(PCR)扩增皮肤组织桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4目的基因;应用基因重组技术将目的基因分别与质粒pET32a在T4 DNA连接酶作用下相连接,转化E.coli DH5α感受态细菌,用含氨苄青霉素的LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子DNA序列测定鉴定;重组融合蛋白经ELISA法与PV患者、正常对照组血清进行反应.结果 RT-PCR扩增产物经凝胶电泳得到均约为350 bp的4条条带;质粒载体pET32a连接的目的基因经序列测定后与在GenBank登录的Dsg4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4核酸序列完全一致,4个Dsg4胞外区域cDNA读码框架正确;Dsg4 EC1、EC2、EC3和EC4与患者血清反应,而不与正常对照组血清反应.结论 Dsg4胞外区域多肽片断在PV发病中可能有作用.     

化脓性链球菌高毒力株特异基因文库的构建和分析

目的构建化脓性链球菌高毒力株特异基因文库,克隆和筛选化脓性链球菌高毒力株特异表达基因。方法采用抑制消减杂交技术(SSH),以从患者体内所分离链球菌为毒力菌株,分离特异表达基因,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10进行文库扩增后,转化菌液涂布于LB固体平板,构建化脓性链球菌毒力株特异基因消减文库,用斑点杂交初步筛选消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析。结果酶切产物为100～2 000bp,连接效率大于50%,消减组与非消减组差异明显,成功构建了化脓性链球菌毒力株特异基因消减文库,所得阳性克隆经斑点杂交筛选后测序,与Genebank数据库进行同源性比对,5个未知序列可能为新基因,7个与已知基因有高度的同源性。结论用SSH及T/A克隆技术成功构建了人源化脓性链球菌高毒力株基因文库,5个未知的新序列有待于进一步的研究。     

二期梅毒皮疹中梅毒螺旋体基因检测和浸润细胞研究

目的：探讨二期梅毒皮疹的形成机制和细胞免疫在梅毒皮疹形成中的作用。方法：用巢式PCR方法对24例10％甲醛溶液固定、石蜡包埋的二期梅毒疹标本进行了梅毒螺旋体DNA检测；用免疫组化方法对二期梅毒皮损中的浸润细胞进行检测。结果：24份二期梅毒疹标本中10例(45．8％)检出了梅毒螺旋体DNA，所有标本银染色未发现苍白螺旋体(TP)。二期梅毒皮损浸润细胞中CD45RO( )T细胞100％阳性，68．2％有CD68( )巨噬细胞，此外还有少量CD20( )B淋巴细胞和CD57( )NK细胞。结论：二期梅毒疹的形成原因可能为螺旋体感染皮肤局部所致；二期梅毒疹皮损中浸润细胞主要为T淋巴细胞和巨噬细胞，细胞免疫在二期梅毒皮损发病中可能发挥重要作用。     

高迁移率族蛋白1及其受体在系统性红斑狼疮中的作用

高迁移率族蛋白1(HMGB1)是存在于真核细胞的一种非组蛋白核蛋白,在胞外HMGB1可作为警报素在固有与适应性免疫反应中起"预警作用"。系统性红斑狼疮(SLE)是影响多个器官功能的典型的自身免疫病,SLE患者的血清HMGB1水平提高,并且狼疮患者的皮损组织中也检测到HMGB1的表达增加。现就HMGB1的基本特征、胞外的生物学活性及在SLE免疫病理机制中的作用予以综述。     

ITS结合RPS0两步PCR快速鉴定临床5种假丝酵母菌

目的:建立快速准确鉴定常见假丝酵母菌种类的基因检测技术。方法:提取假丝酵母菌基因组DNA;第一步PCR用通用引物扩增ITS基因;第二步三重PCR用种特异性引物扩增RPS0基因;分别对已知及未知样本检测、验证。结果:ITS基因扩增,光滑假丝酵母菌(Cg)和克柔假丝酵母菌(Ck)分别得到与预期结果吻合的881bp和419bp的PCR产物;白假丝酵母菌(Ca)、热带假丝酵母菌(Ct)和近平滑假丝酵母菌(Cp)的ITS扩增片段均略大于500bp;RPS0三重PCR对Ca、Ct和Cp DNA扩增,分别得到约310bp、147bp及110bp的片段,与预期结果相符;30株已知假丝酵母菌两步PCR检测结果,种类符合率为100%;43株未知样本两步PCR鉴定结果,经RPS0扩增产物序列测定,符合率亦为100%。结论:建立了ITS通用基因结合RPS0种特异基因鉴定5种常见假丝酵母菌种类的两步PCR技术,该技术简单、快速、准确及廉价;对双重感染患者更有鉴别优势,有临床应用价值。     

基因芯片技术分析系统性红斑狼疮患者外周血白细胞基因表达谱的初步研究

目的 比较系统性红斑狼疮(SLE)患者与正常对照外周血白细胞的基因表达谱的改变,筛选SLE差异表达基因。方法 采集静脉血5ml提取总RNA后,反转录合成、标记cDNA探针,与基因芯片杂交后检测。结果 9例患者与正常人对照均有相似差异表达的基因共89个,涉及细胞因子及受体相关基因、免疫相关基因、细胞信号和传递蛋白、蛋白翻译合成、离子通道和运输蛋白、凋亡相关基因、DNA和RNA结合、转录蛋白、细胞的外基质成分等。聚类分析结果显示在不同病人间尽管存在个体差异性,但是在其基因表达变化模式上仍然具有极大的相似性。结论 基因芯片技术筛选出的差异表达基因可能为进一步研究SLE的发生和发展以及寻找分子诊断标志和药物治疗靶标提供线索。     

基因芯片技术分析系统性红斑狼疮患者外周血白细胞基因表达谱的初步研究

目的比较系统性红斑狼疮（SLE）患者与正常对照外周血白细胞的基因表达谱的改变，筛选SLE差异表达基因。方法采集静脉血5ml提取总RNA后，反转录合成、标记cDNA探针，与基因芯片杂交后检测。结果9例患者与正常人对照均有相似差异表达的基因共89个，涉及细胞因子及受体相关基因、免疫相关基因、细胞信号和传递蛋白、蛋白翻译合成、离子通道和运输蛋白、凋亡相关基因、DNA和RNA结合、转录蛋白、细胞的外基质成分等。聚类分析结果显示在不同病人间尽管存在个体差异性，但是在其基因表达变化模式上仍然具有极大的相似性。结论基因芯片技术筛选出的差异表达基因可能为进一步研究SLE的发生和发展以及寻找分子诊断标志和药物治疗靶标提供线索。     

抑制消减杂交技术筛选肺炎链球菌多耐药相关DNA片段

目的筛选肺炎链球菌多耐药相关DNA片段,探索肺炎链球菌多耐药的分子机制。方法提取多耐药菌株09062407与标准菌株ATCC49619基因组DNA,应用抑制性消减杂交技术得到富含差异DNA片段的消减混合物,与pEASY-T3克隆载体连接并转化到TP10感受态细胞中,构建多耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库。结果耐药株与敏感株间差异片段大量富集,得到大小200～1 500 bp弥散状DNA条带;将这些差异DNA片段富集后构建成消减文库,随机挑取192个白色克隆,经PCR扩增,155个克隆插入有200～800 bp大小片段。结论抑制消减杂交技术能有效筛选肺炎链球菌多耐药株与敏感株间差异DNA片段,可进一步通过克隆鉴定等生物信息学方法寻找与肺炎链球菌多耐药相关基因。     

云南省不同地理株恶性疟原虫的MSP-2基因多态性研究

目的研究云南省不同地理株恶性疟原虫的裂殖子表面抗原蛋白基因2(MSP-2)的多态性，探索其多态性的地域特征，为鉴定不同地理株恶性疟原虫提供重要的科学依据。方法使用随机扩增多态DNA-多聚酶链反应(RAPD-PCR)为主的分子生物学方法。结果分析云南不同疟疾流行区的169份样本，PCR扩增获得6个不同大小的MSP-2基因片段，600bp片段占多，其频度为34．8％，540bp片段其次，占28．3％；同时显示具有一定的地理分布差异。结论研究证实云南不同地区恶性疟原虫的MSP-2具有较为明显的地理多态性特征。     

女性外阴尖锐湿疣及湿疣样病变组织中人类乳头瘤病毒 DNA 的检测

用生物素和~(32)P-人类乳头瘤病毒 HPV11、HPV16和 HPV18型 DNA 探针,以斑点和 SouthernBlot 杂交方法检测了49例北京地区女性外阴尖锐湿疣和湿疣样病变组织中 HPV DNA。在24例尖锐湿疣组织中,HPV DNA 阳性者为18例(75%);其中 HPV11 DNA 阳性者16例,占阳性例数的88.9%;HPV16 DNA 阳性者2例,占阳性例数的11.1%;没有发现 HPV18 DNA 阳性者.25例湿疣样病变组织中,8例含有 HPV DNA(32%),全为 HPV11型。本文对湿疣样病变与 HPV 感染的关系,外阴部尖锐湿疣的分型及诊断标准进行了初步探讨。     

结合珠蛋白mRNA及其蛋白在尖锐湿疣皮损中的表达

目的:从mRNA和蛋白水平检测尖锐湿疣皮损中结合珠蛋白的表达,探讨结合珠蛋白在尖锐湿疣皮损局部免疫异常机制中的作用.方法:采用原位杂交、免疫组织化学技术和Western免疫印迹的方法,检测30例尖锐湿疣患者皮损及20例正常包皮组织中结合珠蛋白mRNA及其蛋白的表达情况.结果:结合珠蛋白mRNA及其蛋白表达部位主要在表皮的基底层和棘细胞层.结合珠蛋白mRNA在尖锐湿疣皮损组和对照组中原位杂交染色灰度值分别为106.24±5.85和122.72±4.41,差异有统计学意义(P＜0.05);结合珠蛋白在尖锐湿疣皮损组和对照组中免疫组化染色灰度值分别为120.24±1.83和128.72±2.41,差异有统计学意义(P＜0.05);Western免疫印迹检测结果显示尖锐湿疣皮损组和对照组光密度值分别为0.53±0.11和0.24±0.06,尖锐湿疣皮损组表达较对照组明显升高(P＜0.05).结论:尖锐湿疣皮损表皮细胞中结合珠蛋白mRNA表达增强,合成结合珠蛋白水平升高.尖锐湿疣皮损中结合珠蛋白可能通过抑制朗格汉斯细胞的功能成熟和抑制角质形成细胞的免疫活性参与尖锐湿疣的局部免疫逃逸.     

一种去除聚合酶链式反应引物二聚体的简便方法

目的提供一种去除聚合酶链式反应(PCR)引物二聚体的简便方法。方法根据聚乙二醇(PEG)能够选择性沉淀DNA片段的原理,确定分别去除100 bp、100～200 bp、100～300 bp条带的PEG 6000最终质量分数,因引物二聚体大小一般为200 bp,最终运用到去除含有引物二聚体的PCR产物中。结果最终质量分数为10.67%、9.00%、8.00%的PEG能分别除去100 bp、100～200 bp、100～300 bp条带。最终质量分数为24.00%的PEG能有效去除PCR引物二聚体并纯化PCR产物。结论 PEG 6000能有效去除PCR扩增产物的引物二聚体,达到纯化PCR产物的效果。     

皮肤鳞状细胞癌组织中HB-EGF的表达意义

目的：探讨肝素结合表皮生长因子样生长因子（HB－EGF）在皮肤鳞状细胞癌中的作用机制。方法：用原位杂交的方法检测正常组织；癌旁组织和鳞状细胞癌皮损组织中HB－EGF mRNA的表达。结果：在正常皮肤组织中，HB－EGF表达于基底层（100．0％），基底上层仅有少量表达（12．5％）；在癌旁组织中，HB－EGF不仅位于基底层（100．0％），且在基底上层也有表达（91．7％）；在鳞状细胞癌皮损中，全层几乎无HB－EGF的表达（8．3％）。结论：HB－EGF在鳞状细胞癌发病的早期阶段起关键作用，基底层中的HB－EGF对保持这表皮形态有重要作用。     

Detection of Varicella Zoster Virus DNA within Lesions and Healed Skin Lesions of Herpes Zoster by PCR

ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶａｒｉｃｅｌａＺｏｓｔｅｒＶｉｒｕｓＤＮＡｗｉｔｈｉｎＬｅｓｉｏｎｓａｎｄＨｅａｌｅｄＳｋｉｎＬｅｓｉｏｎｓｏｆＨｅｒｐｅｓＺｏｓｔｅｒｂｙＰＣＲＺｈａｎｇＭｅｉｈｕａ（张美华）ＺｈｕＷｅｎｙｕａｎ（朱文元）ＸｕＭｅｉｐｉｎｇ...     

皮损FLT-1和KDR水平的测定对SLE患者疾病活动性及治疗转归的预测价值

目的:探讨系统性红斑狼疮(systemlupus erythematosus,SLE)患者皮损血管内皮生长因子受体FLT-1和KDR水平的测定对疾病活动性及治疗转归的预测价值。方法:采用免疫组化(SP免疫组织化学法)法检测皮损FLT-1及KDR蛋白的表达水平,分析FLT-1和KDR的含量与SLE患者的疾病活动度指数SLEDAI和免疫指标(ANA、ds DNA等)的相关性,研究用FLT-1和KDR指标判断疾病的活动性,并进行SLE病例的前瞻性和治疗前后对照研究。结果:SLE患者皮损血管内皮生长因子受体FLT-1和KDR水平显著高于正常对照组。SLE患者皮损血管内皮生长因子受体FLT-1和KDR水平活动期均高于非活动期(P<0.01),抗核抗体(ANA)高滴度组高于ANA低滴度组,dsDNA抗体阳性组高于dsDNA抗体阴性组,肾损害组高于非肾损害组;且SLE患者皮损血管内皮生长因子受体FLT-1和KDR水平与SLE患者SLEDAI呈正相关。结论:FLT-1和KDR与SLE发病有关,可反映SLE患者的疾病活动性,同时定量检测可有助于预测患者的病情活动和转归。     

巢式PCR检测胎儿组织人细小病毒B19感染

作用设计合成的两对引物建立了巢式ＰＣＲ－ＥＢ染色法检测Ｂ１９ＤＮＡ新技术，扩增产物为１０４ｂｐ片段，敏感性达０．００７ｆｇ，是一般ＰＣＲ的１００倍，是一种特异、敏感、简便、快速诊断Ｂ１９感染的新方法。用该方法检测了５７例自然流产和死胎的胎儿组织，１７例阳性，其中自然流产１１／４２（２６５），死胎６／１５（４０％），证实了国内胎儿有Ｂ１９病毒感染，和自然流产、死胎可能相关，并对ＰＣＲ实验中防污染措     

HBV感染者外周血单个核细胞中HBV DNA的检测

目的；研究乙型肝炎毒（ＨＢＶ）感染者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）中ＨＢＶ ＤＮＡ的存在及其与血清ＨＢＶ ＤＮＡ的关系。方法：用ＰＣＲ法及斑点杂交法对５０例ＨＢｓＡｇ（＋）的感染者ＰＢＭＣｓ ＨＢＶ ＤＮＡ进行检测。同时用ＰＣＲ法检测感染者血清ＨＢＶ ＤＮＡ。结果：ＰＣＲ法和斑点杂交法分别从３５份和３２份ＰＣＭＣｓ检出率均为６０．０％左右。ＰＣＲ法检测血清ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率为３６．０％。结论：Ｈ     

Study on the Specific Gene Expression during Spermatogenesis of Rat

Testicular spermatogenic cells possess the characteristics of selectable geneexpression during the germ cell differential process. There is a property oftransitional expression of the gene types during spermatogenesis[1 ] .For example,when structure genetic expression of testicular somatic cells was terminated,thespecific gene expressions of the testicular germ cell were activated[2 ] . Therefore,differential process of germ cells of differentdevelopmental stage is performed underthe programme…     

牛Y染色体DNA富集文库的构建

According to the fundamentals of DNA renatured kinetics, we made a study in which genomic DNA from male cattle was completely digested with Sau 3A, while female DNA was sheared to an average size of 500 bp fragments. The Y derived DNA sequence rich library of bovine has been contracted with pUC19 plasmid as vector and JM109 as host bacteria by reassociation of male and female DNA. Male and female DNA probes, were used. The result of colony hybridization showed that out of 1000 recombinants analysed, 6 were found to be stronger signal with male probe. Analysis of Pvu' I digested DNA fragment revealed that most of the inserts were in the 90-300 bp.     

Leber遗传性视神经病相关的三种原发性线粒体突变的无创检测方法建立

目的：建立1种Leber遗传性视神经病（LHON）相关的3种原发性线粒体突变11778G＞A、14484T＞C和3460G＞A的无创检测方法。方法：研究对象为在温州医科大学附属眼视光医院就诊的3例（WZ1481、WZ1478、WZ1435）基因检测确定为m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者。采集3例LHON患者和2例野生型健康对照的静脉血样及口腔黏膜细胞样本,然后分别用手工法和试剂盒法提取全基因组DNA,分析比较2种样本、2种方法提取的DNA的纯度及浓度有无差别。最后以携带m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者和野生型的口腔黏膜细胞和外周血提取的全基因组DNA作为模板,通过PCR扩增分别包含以上3种突变的DNA片段,然后进行焦磷酸测序、斑点杂交和Southern blot分析PCR产物。结果：口腔黏膜细胞和血液提取的DNA浓度的差异无统计学意义（P＞0.05）。手工法提取的口腔黏膜细胞DNA纯度低于试剂盒法提取的口腔黏膜细胞和血液DNA的纯度,差异有统计学意义（P＜0.05）。口腔黏膜细胞提取的DNA产量与血液相似。DNA测序结果显示血液样本和口腔黏膜细胞样本具有很好的一致性,对照组均检测不到突变,而突变组可以检测到相应的突变。斑点杂交和Southern blot的结果也一致,对照组均为阳性而突变组均为阴性。结论：口腔黏膜细胞DNA可用于筛查和鉴定LHON的3个主要线粒体突变。本研究建立了一种方便、无创的方法来检测LHON相关的m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变。