抗人CD3人/鼠嵌合抗体的表达及特性

将从HIT3a基因库分离克隆的功能性抗CD3轻重链可变区基因插入含有人k轻链及γ1重链恒定区基因的哺乳动物表达载体中，构建了抗CD3嵌合抗体基因,用Lipofectin将抗CD3人／鼠嵌合轻重链基因共转染SP2／0细胞表达，获得稳定传代和稳定表达抗CD3嵌合抗体的转染杂交瘤细胞株C-HIT3a，ELISA，免疫荧光和PCR实验证实嵌合抗体与原鼠CD3单抗有相同的特异性和亲和性。体外生物活性的初步分析表明嵌合抗体与鼠CD3单抗对人的PBMC细胞的增殖有相同类型的作用，高剂量抗体抑制人T细胞的增殖，低剂量显示明显的激活增殖作用，当与IL-2联合应用其激活增殖作用增加20倍。细胞毒实验表明嵌合CD3抗体或由该抗体介导的免疫活性细胞(CD3-AK)对多种肿瘤细胞有明显的杀伤活性，较单用IL-2或单用LAK细胞其杀伤活性增加25倍。     

抗CD3人／鼠嵌合抗体的研究

已有的研究表明抗人T细胞CD3抗原的单抗具有激活和抑制人T细胞的双向功能。该单抗在抗肿瘤、抗多种器官移植排斥反应及再生障碍贫血的治疗中已显示出广阔的应用前景。但目前所用的CD3单抗都是鼠源的，大大地限制了它在临床治疗中的应用。为解决这一难题，本研究应用基因工程技术将鼠源CD3单机进行“人化”改造，在国内首次成功地构建并在其核细胞表达了抗CD3人／鼠嵌合抗体。这里综合报道研究结果如下：一、CD3单抗可变区基因cDNA的克隆和鉴定从分泌抗CD3单抗的小鼠杂交瘤HIT3a提取分离RNA，用小鼠Ig轻重涟恒定区保守序列为引物，…     

基因工程抗体的研究

本文综述了本实验室近年来在基因工程抗体方面所做的工作：①从杂交瘤细胞基因组中筛选和鉴定出抗乙型脑炎病毒单克隆抗体的重链、轻链可变区基因，构建成人-鼠嵌舍基因并在骨髓瘤细胞中表达出抗乙型脑炎病毒的人-鼠嵌合抗体；②根据文献中抗CD3单抗的序列，进行了分子设计，设计出改形抗体的分子序列．用合成和PCR补齐的方法构建了改形的单域抗体（Vn)表达载体，并在大肠杆菌中表达；④构建了外分泌型-附着型的表达单链抗体的表达载体；④克隆和测序了抗人肺腺癌．膀胱癌、CD3的单抗重,轻链可变区基因，并正在构建鼠的抗体库。     

抗人胃癌3H11人-鼠嵌合抗体的构建及表达

为了降低抗人胃癌鼠单抗3H11的免疫原性,以利于该单抗在临床中的应用。我们构建并表达了3H11的人-鼠嵌合抗体,将3H11的轻、重链可变区基因分别插入到含有人k链及IgGl重链恒定区基因的真核细胞表达载体中,构建了3H11人-鼠嵌合抗体轻、重链表达载体。应用Lipofectin方法先将嵌合轻链表达载体转染到Sp2/0细胞中,经用含霉酚酸的选择培养基筛选及克隆化培养,获得稳定分泌3H11人-鼠嵌合轻链的转染细胞株。再将嵌合重链表达载体转染该细胞系,用含有组氨醇的选择培养基筛选,获得组氨醇抗性细胞株,经亚克隆后得到可稳定分泌人k链和人IgGl的转染细胞系,经ELISA检测该细胞系所分泌的上清含有可与人胃癌细胞系803结合的人IgG抗体活性,RT-PCR结果显示该细胞株有人-鼠嵌合抗体mRNA的转录,证明已获得分泌3H11人-鼠嵌合抗体的细胞系。     

抗CEA抗体可变区基因的克隆及其嵌合抗体的表达

目的 在真核细胞中表达抗癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA)人－鼠嵌合抗体。方法 从分泌抗CEA鼠单抗C50的杂交瘤细胞扩增、克隆可变区基因。测序鉴定后连入真核表达载体,导入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢（dihydrofolate reductase-deficient Chinese hamster ovary CHO-dhfr）细胞进行表达。采用间接和竞争抑制ELISA检测表达产物的人源性和抗原结合特异性。结果 序列测定初步确定所克隆的是功能性抗体可变区基因。在转染细胞上清中测到抗CEA嵌合抗体的表达。ELISA试验证实嵌合抗体具有人的恒定区,并与原鼠单抗C50有相同的抗原结合特异性。结论 成功地在真核细胞中表达了抗CEA人－鼠嵌合抗体。     

抗人小细胞肺癌单抗4B3重、轻链可变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

目的　获得抗人小细胞肺癌单抗 4B3的重 ,轻链可变区基因。方法　根据小鼠免疫球蛋白可变区骨架区的保守序列分别设计了 4B3单抗重 ,轻链的可变区基因体外扩增的两对引物 ,从体外培养的 4B3杂交瘤细胞中提取总RNA ,反转录成cD NA ,以cDNA为模板 ,分别用设计的两对引物进行PCR扩增 ,扩增出的重 ,轻链基因片段 ,分别插入载体 pT Adv中 ,筛选出阳性克隆 ,并测序、分析。结果　重链可变区基因全长 345bp ,编码 115个氨基酸 ,轻链可变区基因全长 315bp ,编码 10 5个氨基酸。结论　上述研究为 4B3单抗的进一步改造和利用提供了实验基础。     

单价抗CD20抗体诱导人B细胞淋巴瘤Raji细胞的凋亡

背景与目的:抗CD20抗体和片段已应用于非霍奇金淋巴瘤的临床治疗,但仍需要开发新的抗CD20抗体和片段(未修饰的或放射性标记的),以治疗对美罗华(利妥昔单抗)无反应的患者。鼠源性抗CD20抗体HI47的嵌合抗体片段Fab和F(ab)'2已被构建。本研究目的是观察HI47(鼠抗-CD20抗体)和其嵌合抗CD20抗体片段抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。方法:用免疫荧光法测定抗CD20抗体与CD20+人B细胞淋巴瘤Raji细胞的结合能力;MTT法测定抗CD20抗体片段对Raji细胞生长的影响;用膜联蛋白Ⅴ染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测和验证抗CD20抗体片段诱导Raji细胞凋亡。结果:HI47和其嵌合的抗CD20抗体片段均可与CD20+Raji细胞结合,结合率可达90%以上;HI47不能与美罗华竞争结合Raji细胞;HI47和其嵌合的抗CD20抗体片段浓度为100μg/ml对Raji细胞的抑制率分别为:(57.0±1.5)%、(65.2±2.5)%、(77.2±3.2)%;单价的抗CD20抗体片段Fab(20μg/ml)能够诱导Raji细胞的凋亡,早期凋亡率为17%。结论:HI47的嵌合抗体片段对Raji细胞有抑制作用,能诱导Raji细胞的凋亡。     

抗人血管内皮生长因子165嵌合抗体的构建及其真核表达

目的 在真核细胞中表达抗人血管内皮生长因子１６５（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １６５，ＶＥＧＦ１６５）人／鼠嵌合抗体。方法 将抗ＶＥＧＦ１６５鼠单抗ＶｍＤ１１的轻，重甸可变区基因克隆入基因工程抗体真核表达载体中，转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ －ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａ     

抗CD20单克隆抗体联合CHOP化疗方案治疗人B细胞淋巴瘤的实验观察

目的:以人B细胞淋巴瘤裸鼠皮下移植模型为基础,研究抗CD20单克隆抗体体内、体外活性,评价该抗体联合CHOP化疗方案治疗人B细胞淋巴瘤的有效性。方法:体内实验:建立人B细胞淋巴瘤裸鼠皮下移植模型。52只荷瘤鼠随机分为5组进行实验。用TUNEL法检测肿瘤凋亡,并绘制肿瘤体积曲线和裸鼠体质量曲线。体外实验:用CellTiter96 AQueous非同位素细胞增殖试验试剂盒检测抗CD20单克隆抗体、化疗和联合化疗对Raji细胞体外杀伤作用,并绘制剂量反应曲线。结果:体内实验:鼠抗人CD20单抗组及嵌合CD20抗体组均出现大量肿瘤细胞凋亡。联合治疗组疗效最佳,与其他组相比差异有统计学意义,P<0.05。化疗组及联合治疗组体质量下降明显,与其他组相比差异有统计学意义,P<0.05。体外实验:发现鼠抗人CD20单克隆抗体及嵌合型CD20抗体均可增加Raji细胞对化疗药物的细胞毒敏感性。结论:CD20单克隆抗体对B细胞淋巴瘤具有明显的抑制作用,可以诱发大面积肿瘤细胞凋亡,能提高肿瘤对化疗药物的细胞毒敏感性,且较常规化疗毒副反应小。     

抗CEA人鼠嵌合F(ah’)_2在昆虫细胞中的表达

癌胚抗原(CEA)是一种非特异性肿瘤标记(TW).在结肠癌,胃癌,肺癌,乳腺癌,宫颈癌等许多恶性肿瘤中均有较高表达.利用抗CEA单克隆抗体进行放免显像研究近年来发展较快,但都存在着放射性本底较高的问题,影响了显像结果.F(ab’)_2.由于分子量小,没有Fc段,从血液中清除较快,可减少非特异结合,而因显像效果较好,但仍然受HAMA反应的影响.为此,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统在SF9细胞中表达了抗CEA人鼠嵌合F(ah’)_2,以利于临床肿瘤的放免显像.提取一株表达完整抗CEA嵌合抗体的CHO细胞的总RNA,分别用与人轻链k恒区基因及α1重链CH2基因互补的3’引物进行反转录,再以CDNA为模板,5’引物相同,都与鼠重链前导肽互补,3’引物与反转录相同分别进行PCR扩增,得到含有鼠重链前导肽,轻链可变区,完整的k恒区的680bp的轻链基因和含有鼠重链前导肽,重链可变区,     

抗人肝癌单克隆抗体HAb18 Fd及轻链基因的克隆与鉴定

目的: 克隆抗人肝癌单抗HAb18 Fd及轻链基因，并对其可靠性和准确性进行验证。方法: 从分泌单抗HAb18的杂交瘤细胞株中提取总RNA，利用RTPCR扩增抗体Fd及轻链基因，连入pMD18T载体后，挑选阳性克隆进行序列测定并利用相应的软件对序列进行分析。然后将轻链及Fd基因依次克隆到噬菌体展示载体pComb3中，转化大肠杆菌XL1blue并利用辅助噬菌体M13K07进行挽救，收获噬菌体后利用间接ELISA方法检测其抗原特异性。结果: 扩增的HAb18全长轻链和Fd 基因大小分别为665 bp和668 bp，序列分析显示：VH及VL均含有2个特征性的半胱氨酸，CH1属于IgG1亚类，CL属于κ亚型。ELISA证实，Fab基因表达产物具有与相应抗原特异结合的活性。结论：成功克隆了肝癌单抗HAb18的Fd及轻链基因，为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。     

PPO基因单克隆抗体的制备以及在恶性黑色素瘤中表达的研究

目的：制作PPO的单克隆抗体并研究其在恶性黑色素瘤中的表达。方法：利用细胞融合法制作单克隆抗体,蛋白免疫电泳法检测单克隆抗体,免疫组化法研究PPO基因在恶性黑色素瘤中的表达情况。结果：制作了PPO基因的特异性单克隆抗体,在恶性黑色素瘤中有过表达。结论：PPO抗体是一种特异性的抗体,该抗体对恶性黑色素瘤的检测有特异性。     

Prostate-specific Membrane Antigen (PSMA)-specific Monoclonal Antibodies in the Treatment of Prostate and Other Cancers

Prostate-specific membrane antigen (PSMA) is a cell surface glycoprotein that is expressed by prostate epithelial cells. PSMA-specific monoclonal antibodies have been utilized to characterize the biologic function and in vivo biodistribution of PSMA. PSMA is an attractive target protein for monoclonal antibody directed imaging or therapeutics for prostate cancer since its expression is relatively restricted to prostate epithelial cells and is over-expressed in prostate cancer, including in advanced stages. Currently, clinical usage of PSMA specific monoclonal antibodies has been limited to diagnostic immunohistochemistry and imaging of patients with prostate cancer. Novel applications for these antibodies will be discussed.     

基因免疫制备人PAK4单克隆抗体及其部分特性的鉴定

背景与目的:制备人PAK4单克隆抗体可以用于临床诊断恶性肿瘤,同时为深入探讨PAK4蛋白的功能提供可靠途径.材料与方法:用重组PAK4质粒(以P3XFLAG-CMV-10表达质粒为载体)免疫6～8周龄雌性Balb/C小鼠,通过细胞融合与克隆,筛选PAK4特异性单抗.结果:得到稳定分泌PAK4抗体的单克隆杂交瘤细胞2株,分别命名为2D1和3H4;间接ELISA方法测得2株PAK4单抗腹水效价为1∶1.0×104;单抗亚类鉴定表明2D1是IgG类,3H4是IgM类;免疫组化试验显示2株单抗均与临床两例乳腺癌组织管状上皮细胞高度反应.结论:PAK4单克隆抗体特异性较好,可用于临床肿瘤组织诊断.     

检测肺癌患者血清p53抗体的临床意义

目的:探讨检测肺癌患者血清p53抗体的临床意义。方法:采用酶联免疫吸附法检测120例肺癌患者血清p53抗体,并以30例肺部良性疾病患者和120例正常健康人作对照。结果:肺癌患者血清p53抗体水平明显高于肺部良性疾病患者和正常人(P<0.05),而正常人与肺部良性疾病患者间无显著性差异(P>0.05)。120例肺癌中26例p53抗体阳性,阳性率为21.7%,而30例肺部良性疾病患者和120例正常人无1例阳性。肺癌者血清p53抗体与肺癌细胞分化程度和临床分期有密切关系(P<0.01)。结论:检测血清p53抗体水平有助于肺部良恶性疾病的诊断及鉴别诊断。     

CLONING AND SEQUENCING OF IMMUNOGLOBULINVARIABLE－REGION GENE OF A MONOCLONALANTIBODY SPECIFIC FOR HUMANHEPATOCARCINOMA

ＣＬＯＮＩＮＧＡＮＤＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧＯＦＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮＶＡＲＩＡＢＬＥ－ＲＥＧＩＯＮＧＥＮＥＯＦＡＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＹＳＰＥＣＩＦＩＣＦＯＲＨＵＭＡＮＨＥＰＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＹａｎｇＰｉｎｇ杨萍；ＧａｏＬｅｉ高...     

Prodrugs in cancer chemotherapy

At present, chemotherapy is not very effective against common solid cancers especially once they have metastasised. However, laboratory experiments and studies on dose intensification in humans have indicated that some anti-cancer agents might be curative but only if the dose given was very much higher than that presently obtainable clinically. Prodrugs, activated by enzymes expressed at raised level in tumors, can deliver at least 50-fold the normal dose and can cure animals with tumors normally resistant to chemotherapy. This approach has not yet proved to be practicable clinically because of the rarity of human tumors expressing a high level of an activating enzyme. However, new therapies have been proposed overcome this limitation of prodrug therapy. Enzymes that activate prodrugs can be directed to human tumor xenografts by conjugating them to tumor associated antibodies. After allowing for the conjugate to clear from the blood a prodrug is administered which is normally inert but which is activated by the enzyme delivered to the tumor. This procedure is referred to as ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy). Early clinical trials are promising and indicate that ADEPT may become an effective treatment for all solid cancers for which tumor associated or tumor specific antibodies are known. Tumors have also been targeted with the genes encoding for a prodrug activating enzymes. This approach has been called genedirected enzyme prodrug therapy (GDEPT) or VDEPT (virus-directed enzyme prodrug therapy) and has shown good results in animal models. These new therapies may finally realise the potential of prodrugs in cancer chemotherapy.     

用BC2单抗检测胃癌及癌前病变组织中MUC1基因表达及其意义

 目的　揭示胃癌及肠化组织中MUC1基因的表达与其临床病理行为之间的联系。方法　用BC2抗体和免疫组化SP法检测人正常胃肠道粘膜、肠化粘膜以及胃癌组织中MUC1基因核心肽的表达。结果　人正常胃粘膜组织中广泛分布MUC1基因产物(100%),抗原主要位于上皮层和胃腺的中下部;肠化和胃癌组织中的表达阳性率分别为79.3%和82.6%;胃癌组织中MUC1基因表达与患者的性别、部位、大小、淋巴结转移、分化类型、浸润深度、临床分期和Lauren氏分型之间无关(P>0.05);但MUC1基因强阳性者与中弱阳性者之间的临床分期存在明显的差别(P<0.05),表达越强,Ⅰ～Ⅱ期的可能性越小;不同类型肠化中MUC1基因的表达无差异(P>0.05)。结论　上述结果提示用BC2抗体检测的MUC1基因可能是胃癌进展的有用标志,可能与胃癌患者的临床病理行为之间有关,而与肠化分型无关。