抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅲ CD3AK与常规LAK细胞的比较

抗CD3单抗激活的杀伤细胞(Anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells．CD3AK)是用抗CD3单抗(Anti-monoclonal antibody，Anti-CD3 mAb)激活的一类杀伤细胞，具有较强的增殖能力和细胞毒活性。在CD3AK诱生扩增过程中除抗CD3单抗外也需要rIL-2作为生长因子，这就提出一个问题。     

CD3AK细胞的生物学特性及其抗肿瘤作用

CD3AK细胞是用抗T细胞表而CD3分子的单克隆抗体激活的新型杀伤细胞，在肿瘤的免疫疗法中愈来愈受到重视。本文用抗CD3单克隆抗体(北医太免疫室提供)和rIL-2(日本盐野义制药株式会社产品)共同刺激人外周血单个核细胞(PBMC)，诱导CD3AK细胞，系统地研究了其生物特性及其体外抗肿瘤活性并与LAK细胞作比较。     

淋巴结来源的CD3AK细胞的增殖和表型变化分析

目的：研究肺癌清扫淋巴结的淋巴细胞，经CD3单克隆抗体激活后的杀伤细胞（CD3AK细胞）在体外的增殖和表型变化。方法：取肺癌清扫淋巴结，用机械方法分离成单细胞悬液，加CD3单克隆抗体和小剂量IL2共同培养，每隔1天用流式细胞术进行细胞表型分析及用台盼蓝活细胞计数法观察细胞增殖情况。结果：表型分析显示CD3，CD8，CD56，CD25增加。培养第8天淋巴细胞增殖达高峰，数量是培养前的2.33倍。结论：CD3单克隆抗体能明显激活各种T细胞增殖，使CD3AK细胞维持杀伤功能。     

荷CEA-rV的DC增强CD3AK对CEA阳性肿瘤特异杀伤作用的研究

目的 观察荷CEA-rV的DC增强CD3AK细胞对CEA阳性肿瘤细胞的特异性杀伤功能。方法 用脐血制备脐血单个核细胞（UBMC），培养3h后，收集悬浮细胞制备CD3AK，重悬贴壁细胞制备DC。DC培养3d时加入CEA-rV，制备CEA-vV＋DC；在CD3AK培养8d时，加入CEA-rV＋DC混合培养，制备CEA-rV＋DC＋CD3AK。用MTT法测效应细胞UBMC，CD3AK，DC＋CD3AK，CEA-rV＋DC＋CD3AK，分别对CEA阳性靶细胞：LOVO，A549和CEA阴性靶细胞：肝癌细胞株BEL-7402，红白血病细胞株K652的杀伤活性。结果 ①用CEA兔抗人单克隆抗体对四种靶细胞株的鉴定结果表明，LOVO和A549确是CEA阳性细胞株，BEL．7402和K562确是CEA阴性细胞株。②培养10d的DC流式细胞仪检测结果示：高表达MHCI，Ⅱ类分子CD86（82．7％），CD80（51．1％），CD83（57．5％），CD40（69.4％），低表达CD123分子，光学和电子显微镜观察，DC细胞呈不规则形，有大量突起和伪足，成熟DC直径15-20um，胞浆线粒体，内质网丰富。证明为成熟DC。③CD3AK细胞和单纯UBMC细胞的流式细胞仪的免疫分子表型结果是，无论CD3，CD4，CD8和CD28，在CD3AK细胞组中的比率都是UBMC组的二倍以上。说明CD3AK组中成熟T淋巴细胞量明显高于UBMC细胞组。④三种效应细胞CEA-rV＋DC＋CD3AK，DC＋CD3AK和CD3AK对四种靶细胞的杀伤率均比单纯UBMC组明显提高（P〈0.01），而且CEA-rV＋DC＋CD，AK组〉DC＋CD3AK组〉CD3AK组〉UBMC组。说明细胞因子，DC和CEA-rV都有进一步提高UBMC广谱的杀伤肿瘤细胞活性的作用。⑤CEA-rV＋DC＋CD3AK和CD，AK相比较，对CEA阳性细胞LOVO和A549的杀伤活性提高的显著性（P〈0．01）明显优于对CEA阴性细胞K562和BEL-7402显著性（P〈0．05）。说明CEA-rV＋DC能显著提高CD3AK细胞对CEA阳性肿瘤的特异杀伤活性。CEA-rV＋DC＋CD3AK组和DC＋CD3AK组相比，对CEA阴性细胞株的杀伤活性无显著差异（P〉0．05），而对CEA阳性细胞株的杀伤活性确能明显提高（P〈0．01）。进一步证实了CEA-rV能明显提高CD3AK对CEA阳性肿瘤的特异杀伤作用。结论 CEA-rV＋DC能明显提高CD3AK细胞对CEA阳性细胞株杀伤作用，单纯DC对提高CD3AK杀伤CEA阳性细胞的作用不显著，结果表明CEA-rV在提高CD3AK对CEA阳性肿瘤的特异杀伤作用中起着关键作用。     

CD3AK/iNOS细胞对白血病细胞体外杀伤的研究

背景与目的:LAK细胞已用于临床移植物净化。CD3AK细胞是CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞。本研究旨在经逆转录病毒介导iNOS基因转染人免疫活性细胞CD3AK建立CD3AK/iNOS细胞,并探讨其对白血病细胞株K562及其耐药株K562/ADM的杀伤作用。方法:培养PA317/pLNC-iNOS细胞获得病毒上清;CD3McAb联合小剂量的IL-2激活分离的外周血单个核细胞;含逆转录病毒颗粒的细胞培养上清感染靶细胞CD3AK细胞。测定CD3AK/iNOS、CD3AK细胞培养上清NO含量以及iNOS活性。MTT法观察CD3AK/iNOS、CD3AK对K562和K562/ADM细胞杀伤活性。结果:(1)CD3AK/iNOS、CD3AK中NO含量分别为(378.60±41.57)μmol/L,(98.07±22.31)μmol/L(P<0.001);CD3AK/iNOS、CD3AK中iNOS活性分别为(20.77±2.49)U/ml,(9.81±1.96)U/ml(P<0.001)。(2)MTT法观察CD3AK/iNOS对K562和K562/ADM杀伤活性分别为(64.85±18.13)%,(63.80±9.93)%。CD3AK杀伤活性分别为(45.66±17.46)%,(47.85±12.01)%。CD3AK/iNOS与CD3AK相比差异有显著性(P<0.05)。结论:CD3AK/iNOS分泌的NO含量、iNOS活性较CD3AK明显提高,且对K562及K562/ADM杀伤作用也更强;但CD3AK/iNOS对K562及K562/ADM杀伤作用无显著性差异。     

CD3MCAb+rIL-2激活的人胎脾细胞的体外扩增、免疫表型和杀伤活性研究

本文对人胎儿脾脏来源的抗CD3单抗激活的杀伤细胞(CD3AK细胞)的增殖特性，细胞形态和免疫表型以及杀伤活性进行了初步研究。实验材料为5～6个月胎龄经水襄引产获得的胎脾组织，制成单细胞悬液并经淋巴细胞分离液离心得到单个核细胞，台兰拒染率大于95%。对影响增殖特性的细胞培养浓度，     

荷肿瘤抗原的DC细胞增强CD3AK细胞特异杀伤作用的研究

目的 探讨肺癌细胞株A549的肿瘤冻融抗原（Ag）负荷脐血来源树突状细胞（DC）（Ag＋DC）与CD3AK细胞混合培养制备的Ag＋DC＋CD3AK对肺癌细胞株A549特异杀伤活性的影响。方法 用脐带血单个核细胞（UBMC）分别制备DC细胞、CD3AK细胞，用肺癌细胞株A549的制备肿瘤抗原（Ag），用Ag负荷DC制备Ag＋DC，再把Ag＋DC和CD3AK共培养制备Ag＋DC＋cD3AK细胞；用MTT法检测不同效应细胞：UBMC、CD3AK细胞，Ag＋CD3AK和Ag＋DC＋CD3AK细胞对A549肺癌细胞株的杀伤活性。结果 各种效应细胞对A549细胞的杀伤活性分别是：Ag＋DC＋CD3AK（62．11％）〉Ag＋CD3AK（50．34％）〉CD3AK（45．91％）〉UBMC（34．35％），而且Ag＋CD3AK组的杀伤活性高于CD3AK组（P〈0．05）；Ag＋DC＋CD3AK组的杀伤活性更明显的高于CD3AK组（P〈0．01）。结论 Ag能增强CD3AK细胞对亲本靶细胞的特异杀伤活性，肿瘤抗原负荷的DC（Ag＋DC）能进一步增强CD3AK细胞对亲本靶细胞的特异杀伤活性，为CD3AK细胞的特异免疫治疗的临床应用提供了基础资料。     

脐血CD_3AK细胞的制备、生物活性测定及临床应用初探

 目的　研究用脐血单个核细胞制备CD3 AK细胞的抗肿瘤作用 ,探讨肿瘤生物治疗近期疗效的免疫指标。方法　分离脐血单个核细胞 ,分别用IL 2和IL 2 +CD3 Ab诱导LAK和CD3AK细胞 ,并测其扩增数量和对K5 6 2细胞的杀伤活性 ;测定肿瘤患者用CD3 AK细胞治疗前后外周血单核细胞(PBMC)的NK杀伤活性。结果　脐血LAK细胞和脐血CD3 AK细胞均于培养后第 11天时扩增倍数最高 ,分别是培养前的 18倍、2 4倍 ,对K5 6 2的杀伤活性分别是培养前的 2 .6倍和 3.2倍 ;肿瘤患者输注CD3 AK细胞一疗程后 ,其PBMC的NK杀伤活性由 6 2 %升高到 82 % ,平均升高 32 %。结论　 (1)脐血单个核细胞是LAK细胞和CD3 AK细胞良好的前体细胞。 (2 )LAK和CD3 AK细胞的数量和杀伤能力在培养的第 11天时达高峰 ,而且CD3 AK细胞数量和杀伤活性明显优于LAK细胞。 (3)CD3 AK细胞输注能明显提高肿瘤患者PBMC的NK活性。 (4 )肿瘤病人PBMC的NK活性测定可望成为肿瘤生物治疗的一个近期疗效参数     

肝癌患者自体CD3AK细胞与LAK细胞的杀伤活性比较

目的 比较肝癌患者自体CD3AK细胞和LAK细胞的杀伤活性,为临床是供依据。方法 以流式细胞仪检测细胞的杀伤活性。结果 原发性肝癌患者自体的CD3AK细胞的NK活性和LAK活性均高于LAK细胞。结论 CD3AK细胞效果稳定,抗瘤效应明显高于LAK细胞,CD3AK细胞可望作为一种新的生物治疗手段用于肿瘤治疗。     

双特异抗体介导的CD_3AK对人小细胞肺癌细胞株的细胞毒作用

目的 :研究在双特异性抗体的介导下CD3AK细胞 (CD3单克隆性激活的杀伤细胞 )对人小细胞肺癌细胞株LTEP sm1的细胞毒作用。方法 :用51Cr Na2 CrO4 释放试验检测单抗 (2D6、UCHT1)和双特异性抗体 (WST H7)与CD3AK共同对人小细胞肺癌细胞株的杀伤活性。结果 :双特异性抗体体外能明显增强CD3AK细胞对人小细胞肺细胞株LTEP sm1的杀伤活性。结论 :与单纯CD3AK相比 ,加入双特异性抗体后的CD3AK细胞的细胞毒活性显著增强     

CD3AK细胞的研究进展

过继免疫疗法是目前治疗恶性肿瘤的一个重要辅助治疗方法。它是指体内回输免疫活性细胞,从而达到杀伤恶性肿瘤细胞的目的。与其他抗肿瘤药物相比,它可以在没有损伤机体免疫系统结构和功能的前提下,直接杀伤肿瘤细胞,并且调节和增强机体的免疫功能。用于过继免疫疗法的免疫活性细胞必须具有较强的细胞毒活性和增殖力,目前常用的有抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CDlmon-odonal antibody activated killer cells,CD3AK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cells,LAg)及细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,aKl)[1~3]。其中研究最多最重要的就是CD3AK细胞。本文拟就其研究进展作一综述。     

抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅴ CD3AK介导的MHC非限制性溶瘤作用的机制分析

MHC(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类抗原缺失是一些肿瘤细胞逃逸抗原特异性CTL攻击的重要机制。CTL能否通过MHC非限制性，MHC Ⅰ类非依赖性机制杀伤肿瘤细胞是值得深入探讨的。我们用抗CD3单抗和rIL-2共刺激法诱导的CD3AK作为效应细胞，研究了CD3AK对两株MHC Ⅰ类阴性肿瘤细胞株K562和Daudi杀伤作用，     

抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅰ 抗CD3单抗和rIL-2共刺激对PBMC的激活作用

本实验结果表明采用抗CD3单抗和rIL-2共刺激外周血单个核细胞(Peripheral blood mononueleacells，PBMC)可诱导其增殖、活化、分化为具有杀瘤活性的抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞 (Anti CD3 monoclcnal anybody activated killer cells．CD3AK)。(1)抗CD3单抗和rIL-2共刺激可诱导PBMC增殖，     

中高度恶性淋巴瘤在化疗的基础上应用CD3AK生物细胞治疗的疗效研究

CD3AK细胞是由抗CD3单克隆抗体和IL-2共同激活诱导的肿瘤细胞,具有高效激活与扩增、长期存活、低IL-2依赖性、体内外抗肿瘤活性高及低毒副反应的特点.其抗肿瘤机理:(1)直接杀伤肿瘤细胞;(2)CD3非特异性激活的淋巴细胞介导的MHL非限制性溶瘤作用;(3)CD3单抗通过识别T细胞表面的CD3/TCR复合体,促使其产生TNF和IFN等多种细胞因子而杀伤肿瘤细胞;(4)CD3诱导癌细胞程序性死亡[1,2].     

脐血CD3AK细胞治疗恶性肿瘤的临床应用研究

目的:研究用脐血单个核细胞制备CD3AK细胞的抗肿瘤作用,探讨肿瘤生物治疗近期疗效的免疫指标.方法:分离脐血单个核细胞,分别用IL-2和IL-2 CD3Ab诱导LAK和CD3AK细胞,并测其扩增数量和对K562细胞的杀伤活性;测定肿瘤患者用CD3AK细胞治疗前后外周血T淋巴细胞亚群绝对计数的变化情况和外周血单核细胞(PBMC)的NK杀伤活性.结果:脐血LAK细胞和脐血CD3AK细胞均于培养后11天时扩增倍数最高,分别是培养前的18倍、24倍,对K562的杀伤活性分别是培养前的2.6倍和3.2倍;肿瘤患者输注CD3AK细胞一疗程后,其外周血T淋巴细胞亚群绝对计数有明显升高:总T升高66.0%,Th升高68.0%,Ts升高58.0%;其PBMC的NK杀伤活性由63.0%升高到81.0%,平均升高28.0%.结论:1)脐血单个核细胞是LAK细胞和CD3AK细胞良好的前体细胞.2)LAK和CD3AK细胞的数量和杀伤能力在培养的11天时达高峰,而且CD3AK细胞数量和杀伤活性明显优于LAK细胞.3)CD3AK细胞输注能明显提高肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群绝对计数和PBMC的NK活性.4)肿瘤患者的外周血T淋巴细胞计数和PBMC的NK活性测定可望成为肿瘤生物治疗的一个近期疗效参数.     

CD3AK细胞对恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响

目的：观察抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞（CD3AK细胞）对恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响。方法：65例恶性肿瘤病人分为两组，实验组（CD3AK细胞＋化疗）35例，对照组（单纯化疗）30例，两组病人分别于治疗前及治疗后作外周血T细胞亚群和血清可溶性白细胞介素2受体（sIL-2R）水平测定。结果：恶性肿瘤病人细胞免疫功能均校正常人低，化疗病人辅以CD3AK细胞治疗后外周血CD3^ 、CD4^ T细胞及CD4^ /CD8^ 比值均明显升高，sIL-2R水平显著下降；对照组病人经化疗后CD3^ 、CD4^ T细胞与CD4^ /CD8^ 比值明显下降，sIL-2R水平也下降，但其下降幅度比CD3AK细胞治疗组小，两者比较有统计学意义（P＜0.05)。结论：CD3AK细胞能有效地提高化疗中恶性肿瘤患者的细胞免疫功能。     

抗CD3/抗CD20偶联物的制备及其介导激活T细胞杀伤活性研究

目的：研究抗CD3/抗CD20抗体偶联物介导的激活T细胞杀伤活性。方法：通过SPDP偶联，经分子筛层析法纯化得到抗CD3/抗CD20抗体偶联物，并用FACS和玫瑰花环试验鉴定纯化产物；采用^51Cr释放试验测定该抗体偶联物介导的体外靶向杀伤活性。结果：纯化的抗CD3/抗CD20抗体偶联物具有与jurkat(CD3^ )和Daudi细胞（CD20^ )的结合活性，且能同时将Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环；在体外能介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞。结论：抗CD3/抗CD20抗体偶联物体外能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞，为B细胞恶性肿瘤临床治疗提供实验依据。     

抗人CD3人/鼠嵌合抗体的表达及特性

将从HIT3a基因库分离克隆的功能性抗CD3轻重链可变区基因插入含有人k轻链及γ1重链恒定区基因的哺乳动物表达载体中，构建了抗CD3嵌合抗体基因,用Lipofectin将抗CD3人／鼠嵌合轻重链基因共转染SP2／0细胞表达，获得稳定传代和稳定表达抗CD3嵌合抗体的转染杂交瘤细胞株C-HIT3a，ELISA，免疫荧光和PCR实验证实嵌合抗体与原鼠CD3单抗有相同的特异性和亲和性。体外生物活性的初步分析表明嵌合抗体与鼠CD3单抗对人的PBMC细胞的增殖有相同类型的作用，高剂量抗体抑制人T细胞的增殖，低剂量显示明显的激活增殖作用，当与IL-2联合应用其激活增殖作用增加20倍。细胞毒实验表明嵌合CD3抗体或由该抗体介导的免疫活性细胞(CD3-AK)对多种肿瘤细胞有明显的杀伤活性，较单用IL-2或单用LAK细胞其杀伤活性增加25倍。     

CD3AK杀伤机理及其杀伤活性调控效应的初步研究

应用抗CD3单抗和人rIL-2共同诱导人外周血单个核细胞制备人CD3AK细胞(CDAK).采用LDH释放法、ABC-CELISA法、流式细胞术等方法观察了CD3AK杀伤癌细胞的机理及人rIFN-α、rIFN-γ、rTNF细胞因子、化疗药顺氨氯铂(CDDP)和阿霉素(ADM)对CD3AK杀伤活性的调控效应.结果表明,①粘附分子ICAM-1/LFA-1参与CD3AK的杀瘤过程,并且rIFN-α、rTNF的促CD3AK杀伤效应亦是通过上述途径实现的.③CD3AK通过分泌可溶性杀伤因子间接杀伤癌细胞.③CD3AK通过膜相关TNF参与杀伤效应.④CD3AK介导癌细胞凋亡.⑤化疗药CDDP和ADM处理癌细胞后,提高其对CD3AK杀伤活性的敏感性,CDDP促杀伤效应与其上调癌细胞表面ICAM-1、HLA-ABC抗原表达有关.     

CD_3单克隆抗体激活细胞的体外抗肿瘤作用

目的:观察CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3AK)的体外杀伤肿瘤作用。方法:采用MTT法测定不同时期CD3AK细胞的杀伤活性。结果:培养到第4天的CD3AK细胞已有明显的杀伤活性,第10天达高峰;CD3AK对K562、H7402和MNK45肿瘤细胞的杀伤活性显著高于LAK和NK细胞(P<0.05),对Hela-3肿瘤细胞的杀伤活性略低于LAK细胞。结论:CD3AK是一种广谱、高效的肿瘤杀伤细胞,但它对不同种类的肿瘤细胞的杀伤效应又存在着较大的差异。