肿瘤混合粘液核芯肽诱导的人肿瘤引流区淋巴结细胞毒反应

我们采用凝胶过滤和密度梯度离心技术从胰腺癌细胞株SW1990细胞匀浆和细胞培养上清中提取了肿瘤粘液，用无水氢氟酸去掉糖链后，经鉴定为不含糖的肿瘤混合粘液核芯肽(MUC)，主要成份为MU-C1、MUC2和MUC3。动物实验表明具有诱发细胞免疫反应作用，本研究进一步观察其诱导人肿瘤引流区淋巴结细胞的体外扩增及溶瘤的作用。     

肿瘤粘液核芯肽MUC3诱导小鼠的免疫反应实验研究

我们采用凝胶过滤和密度梯度离心技术从胰腺癌细胞株SW1990细胞匀浆和细胞培养上清中提取了肿瘤粘液，用无水氢氟酸去掉糖链后，经鉴定为不含糖的肿瘤混合粘液核芯肽(MUC)，主要成份为MU-C1，MUC2和MUC3。动物实验表明具有诱发细胞免疫反应的作用，为分析混合粘液核芯肽诱发机体免疫功能的有效成份，我们用MUC3的合成肽作了进一步的实验研究。     

乳腺癌细胞来源Exosomes提取和鉴定

目的:从MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清中分离获得Exosomes,并进行形态学观察鉴定.方法:通过低速离心、高速离心、超滤及超高速离心等方法,从MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清中分离Exosomes,用透射电子显微镜观察其形态特征,Lorry方法蛋白定量,通过用免疫印记进行MHC分子鉴定.结果:MDA-MB-231乳腺癌细胞上清中分泌大量的Exosomes,电镜下观察呈椭圆形或圆形的双层膜的囊泡,直径为50～100 nm,具有完整的细胞膜.结论:用离心的方法可从MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清中提取Exosomes,有可能作为乳腺癌免疫治疗的潜在抗原.     

肺癌细胞分泌蛋白特异性抗体检测

目的研究肺癌患者血清中是否存在肺癌细胞分泌蛋白的特异性抗体。方法收集34例非小细胞肺癌患者血清、12例小细胞肺癌肺癌患者血清及15例健康对照者血清。收集A549细胞及HBE细胞培养的培养液上清液，同时收集胎牛血清培养液做对照；进行蛋白SDS—PAGE分离及电转膜。用肺癌患者及健康对照者的血清作第一抗体进行蛋白印迹检测。只与A549培养液蛋白样品有反应条带，而与HBE及对照无反应即认为是蛋白印迹阳性。结果在分子量约为30kD的蛋白条带处，有61．8％（21／34）的非小细胞肺癌患者血清中存在分泌蛋白的抗体，小细胞肺癌患者（0／12）及健康对照者血清中未发现阳性条带（0／15）。结论非小细胞肺癌患者血清中存在分子量约为30kD的A549分泌蛋白特异性抗体。     

喉癌Hep-2细胞来源的exosomes的发现和鉴定

目的:观察喉癌Hep-2细胞可否分泌exosomes,并从形态学角度鉴定。方法:大量培养喉癌Hep-2细胞,热休克处理,收集培养上清。先通过3/0.8μm深层过滤小型滤芯对上清进行预处理,去除直径较大的颗粒和杂质。采用Exosome Isolation Kit（商品化试剂盒）收集培养上清液4ml,依次加入Exosome Isolation Kit内试剂,通过exosomes提取专用过滤柱,收集浓缩液。用高倍透射电子显微镜对exosomes做鉴定。结果:成功从喉癌Hep-2细胞培养上清中分离提取出exosomes,电镜观察见exosomes呈圆形或椭圆形双层膜的囊泡状结构,直径约20~100nm,密度较高,分散均匀。结论:首次发现喉癌细胞自身能分泌exosomes,为喉癌免疫治疗做出新的探求。     

负载肿瘤干细胞膜微粒的DC-CIK/CTL细胞协同西妥昔单抗对结直肠癌细胞的杀伤作用及其机制

目的:探讨负载结直肠癌干细胞膜微粒(membrane microparticles,MMPs)DC-CIK与西妥昔单抗(Cetuximab,C225)对EGFR靶向药耐药结直肠癌细胞的靶向协同杀伤作用及其机制.方法:PCR法检测结直肠癌SW480、SW620、HCT1 16株细胞k-RAS突变状态,无血清悬浮细胞培养法富集SW480、HCT116肿瘤干细胞,RT-PCR检测干细胞标志物Sox-2和Oct-4.提取外周血单个核细胞培养DC与CIK,将结直肠癌干细胞MMPs负载DC后再与CIK共孵育.形态观察及MTT法分别检测DC-CIK/CTL细胞及其培养上清、C225单独和合并处理对SW480、SW620、HCT116及其干细胞的杀伤效应;RT-PCR检测DC-CIK/CTL细胞培养上清、C225单独和合并作用对SW480、SW620、HCT116细胞凋亡相关基因Fas和上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关E-钙黏蛋白和波形蛋白基因的表达,划痕实验测定DC-CIK/CTL细胞培养上清、C225单独及联合作用对结直肠癌细胞侵袭行为影响.结果:SW480、SW620和HCT116细胞均为k-RAS突变型;富集培养获得的结直肠癌干细胞样细胞高表达Sox-2和Oct-4 mRNA.MMPs负载DC-CIK/CTL细胞及其分泌上清与C225对结直肠癌细胞的抑制有协同作用.C225与MMPs负载DC-CIK/CTL上清联合组相对于两者单独作用组能提高Fas与E-钙黏蛋白基因的表达;联合组的迁移率比两者单独作用组小.结论:负载结直肠癌干细胞MMPs的DC-CIK/CTL细胞对EGFR靶向药耐药结直肠癌细胞有体外特异靶向杀伤效应,且与C225显著协同,其发生机制与逆转细胞EMT和诱导细胞凋亡有关.     

ConA诱导的人脐血基质细胞上清对脐血细胞DNA合成代谢的影响

目的探讨脐血综合利用途径.方法收集脐血基质细胞培养1～5周的上清,观测其对脐血细胞DNA合成代谢的影响.结果ConA诱导的人脐血基质细胞上清对脐血细胞DNA合成随培养时间变化而表现出抑制和刺激作用.结论该上清中至少含有两种以上生长因子.     

MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白的构建、表达及其双重生物学功能的初步研究

目的：利用基因工程技术制备具有双重生物学活性的MIP2γ/GMCSF融合蛋白。方法：通过引物设计和分级克隆的策略构建了MIP2γ/GMCSF融合基因真核表达载体，MIP2γ与GMCSF由（Gly4Ser）3相连；瞬时转染293T细胞后收集含融合蛋白的细胞培养上清；研究了该融合蛋白在体外的促造血细胞增殖活性和对免疫细胞的趋化活性。结果： MIP2γ/GMCSF融合基因载体构建正确；融合蛋白分子量约为24.9 kD；初步生物学功能研究表明，融合蛋白能有效促进TF1细胞增殖，比活性约为2.2×107IU/mg,并能显著刺激骨髓细胞的集落形成；融合蛋白能有效趋化未成熟树突状细胞和CD3+T细胞。结论： MIP2γ/GMCSF融合蛋白具有促进造血和趋化免疫细胞的双重活性，有望成为在造血调控和抗肿瘤免疫中具有良好开发应用前景的新型细胞因子。     

骨肉瘤细胞(MG-63)条件培养基中骨形态蛋白(BMP)的实验研究--BMP的分离、纯化、鉴定

目的 探索从骨肉瘤细胞条件培养基中提取骨形态蛋白(BMP)的方法，并测定其生物学活性。方法 收集骨肉瘤细胞(MG-63)条件培养基，通过浓缩、透析，SephcrylS—100凝胶层析纯化，BMP单克隆抗体鉴定所需洗脱峰，SDS—PAGE测定分子量，小鼠肌袋实验检测其骨诱导活性。结果 BMP单抗鉴定所提蛋白为BMP，SDS—PAGE显示分子量在21kD，能够在小鼠肌肉内产生异位骨化。结论 骨肉瘤细胞条件培养基中含有BMP，分离后具有良好的生物学活性，而骨肉瘤细胞可以在体外长期培养生长，为BMP的大量提取、临床应用提供一个有益的方法。     

胶质瘤U87细胞培养上清诱导CD133+内皮细胞血管生成及其可能的机制

目的： 探讨胶质瘤U87细胞培养上清诱导CD133+内皮细胞血管生成及其可能的机制。 方法： 磁珠法分选脐血CD133+细胞,体外诱导为CD133+内皮细胞并以共聚焦显微镜加以鉴定。U87细胞培养上清作用于CD133+内皮细胞（以DMEM作用为对照）,体外血管生成实验检测其体外血管生成,Transwell法检测其迁移能力,Western blotting检测CD133+内皮细胞中VEGFR-1、VEGFR-2与基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase,MMP-9）的表达,明胶酶谱检测MMP-9的活性。 结果： 脐血CD133+细胞体外诱导培养14 d后,约90%的细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双阳性,具有内皮细胞特性,鉴定为CD133+内皮细胞。与DMEM对照组相比,U87细胞培养上清可诱导CD133+内皮细胞血管生成\[（40.7±3.3）vs（21.0±23）,P<0.05\],促进CD133+内皮细胞迁移\[(0.60±0.04) vs (0.27±0.02),P<0.05\]。U87细胞培养上清上调CD133+内皮细胞中VEGFR-2与MMP-9的表达（P<0.05）,而VEGFR-1的表达基本不变;U87细胞培养上清还可增强CD133+内皮细胞中MMP-9的酶活性。 结论： 胶质瘤U87细胞培养上清通过上调CD133+内皮细胞中VEGFR-2与MMP-9的表达促进内皮细胞血管生成。     

胃粘液癌的肿瘤增殖与DH7识别抗原的表达

应用免疫组化ＡＢＣ法，分析单克隆抗体ＤＨ７识别抗原在１９例胃粘液癌中的表达。结果显示有腺样结构的粘液腺癌阳性率为１００％（９／９），无腺样结构的粘液细胞癌（即印戒细胞癌）阳性率仅为２０％（２／１０），其中２例阳性均属粘液细胞癌的前期——单核细胞样癌细胞形式，而另８例所见的后期印戒样癌细胞均为阴性。提示，粘液癌的肿瘤增殖发生于腺样结构的癌组织和单核细胞样癌组织中，而非发生于散在的印戒样癌细胞中，后者乃是肿瘤增殖后期的终末期癌细胞形式，从而验证了粘液细胞癌从前期单核样癌细胞到后期印戒样癌细胞的这一形态演化过程。     

Entinostat影响NK细胞对非小细胞肺癌杀伤作用的体外研究

  目的  观察Entinostat对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞A549和HCC-827表面NKG2D配体表达的影响，比较经Entinostat处理前后A549和HCC-827细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性。  方法  通过MTT法检测Entinostat对A549和HCC-827细胞增殖的影响，流式细胞术检测NKG2D配体表达的变化，RT-PCR检测配体在mRNA水平的变化，并用ELISA检测细胞培养上清中可溶性MICA的含量。乳酸脱氢酶释放实验检测Entinostat作用后的A549和HCC-827细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性。  结果  Entinostat对A549和HCC-827细胞的生长抑制作用具有时间-剂量依赖性。以0.5、1 μmol/L Entinostat诱导A549和HCC-827细胞48h后，细胞表面NKG2D配体表达水平升高，MICA和MICB的mRNA转录水平升高。1 μmol/L Entinostat提高了A549细胞培养上清中可溶性MICA表达水平。0.5、1 μmol/L Entinostat增强了HCC-827细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性。  结论  Entinostat通过上调NSCLC NKG2D配体的表达，提高NK细胞对NSCLC的杀伤作用，为探讨NSCLC的治疗提供了新的方法和理论依据。      

MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白的构建、表达及其双重生物学功能的初步研究

目的:利用基因工程技术制备具有双重生物学活性的MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白.方法:通过引物设计和分级克隆的策略构建了MIP-2γ/GM-CSF融合基因真核表达载体,MIP-2γ与GM-CSF由(Gly4Ser)3相连;瞬时转染293-T细胞后收集含融合蛋白的细胞培养上清;研究了该融合蛋白在体外的促造血细胞增殖活性和对免疫细胞的趋化活性.结果:MIP-2γ/GM-CSF融合基因载体构建正确;融合蛋白分子量约为24.9 kD;初步生物学功能研究表明,融合蛋白能有效促进TF-1细胞增殖,比活性约为2.2×107IU/mg,并能显著刺激骨髓细胞的集落形成;融合蛋白能有效趋化未成熟树突状细胞和CD3 T细胞.结论:MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白具有促进造血和趋化免疫细胞的双重活性,有望成为在造血调控和抗肿瘤免疫中具有良好开发应用前景的新型细胞因子.     

75例胃粘膜活检中粘液细胞癌的临床病理分析

 本文总结分析75例活检诊断的胃粘液细胞癌，详细描述了粘液细胞癌的临床病理特征，着重讨论了胃活检粘膜中，粘液细胞癌容易漏诊或误诊的原因，并提出了需与粘液细胞癌鉴别的有关病变。通过观察和实验，本文作者支持球样异型增生是胃粘液细胞癌重要的癌前病变的观点。     

小儿支气管粘液表皮样癌1例

患儿女，8岁，因间断咳嗽5年，X线及CT检查发现右肺中叶肿物于1996年4月30日入院。手术发现有肺中叶近肺门处有约5cm×5cm×3cm大小的实性肿块，界清，肺门及气管旁淋巴结未见肿大，完整切除右肺中叶。病理检查送检为右肺中叶，大小7．5cm×6cm×4cm，切面见中叶外侧段支气管内一椭圆形肿物，大小5cm×4cm×2．5cm，灰白，表面略发亮，质细腻，边界尚清．邻近肺组织淤血，支气管旁淋巴结未见肿大。镜下瘤组织由粘液细胞、表皮样细胞及中间细胞构成，粘液细胞丰富占大多数，并形成腺腔及羹样腔隙，腔内见粘液及脱落上皮细胞；小灶状表皮样…     

蚯蚓组织中抑制肿瘤细胞生长物质的分离提取及其作用机制初探

目的 探索一条从蚯蚓中分离有效抑癌成分的途径，并对其作用机制进行初探。方法 选取赤子爱胜蚓(Eisenia Foe—tida)，采用硫酸铵分段盐析、DEAE纤维素-DE52离子交换柱层析、SephadexG100凝胶过滤柱层析等方法分离纯化。MTT方法测定各分离步骤所得样品对于肿瘤细胞的抑制作用。流式细胞术、共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡。结果 蚯蚓组织抽提液经分离纯化后，得一蛋白组分。它可有效抑制BEL-7402细胞(人原发性肝癌细胞系)、HeLa细胞(人宫颈癌细胞系)的生长。凝胶过滤测其分子量为42．2kD，SDS-PAGE显示两条带(分别为33和10kD)。细胞凋亡检测结果证实此组分有促肿瘤细胞凋亡的作用。结论 对蚯蚓组织进行分离提取，可得到抑制实体瘤细胞生长的活性组分。它可引起肿瘤细胞的凋亡，凋亡机制有待进一步探索。     

急性髓细胞性白血病细胞培养上清对树突细胞分化、成熟、凋亡及功能的影响

背景与目的:树突细胞(dendritic cell,DC)存机体抗瘤免疫中起重要作用.研究已表明肿瘤患者和荷瘤动物体内DC功能受损并伴有DC数量的降低.最近的研究提示这种DC功能的受损可能是肿瘤细胞分泌的可溶性因子介导的免疫抑制所致.本研究拟观察急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞分泌的可溶性因子对单核细胞来源DC的分化、成熟、凋亡及其功能的影响.方法:原代AML细胞培养24 h后收集上清.在含有或不含有AML细胞培养上清的培养液中,利用IL-4和GM-CSF刺激单核细胞分化成不成熟DC(immature DC,iDC),IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE-2促进DC成熟.流式细胞仪检测DC表型和凋亡率的变化.计算前体细胞频率(precursorfrequency,PF),观察DC对异基因CD4 T细胞和CD8 T细胞的刺激功能.结果:AML细胞培养上清可显著抑制DC表面协同刺激分子CD80和CD86的表达,并可降低促成熟细胞因子对DC的促成熟作用.同时,与对照组相比,AML细胞培养上清可显著诱导DC的凋亡,凋亡率分别为(15.1±4.2)%和(29.4±9.5)%(P＜0.01).相对于正常成熟DC,AML细胞培养上清诱生的DC对异基因CD4 T细胞和CD8 T细胞的刺激功能显著降低(P＜0.01),其中CD4 T细胞的前体细胞频率分别为(5.2±1.6)%和(1.8±0.5)%,CD8 T细胞的前体细胞频率分别为(6.5±2.0)%和(2.1±0.6)%.结论:AML细胞分泌的可溶性因子可抑制DC的发育和功能.     

痰内细胞浓集法改良

使痰内粘液液化,离心,取其沉渣制作涂片,可以提高检出率。胰蛋白酶、糜蛋白酶、番木瓜素和透明质酸酶都有使粘液液化的作用,但也都有使细胞破坏的作用。我们使用物理机械作用使凝固的痰液粉碎后,再做离心涂片,细胞结构清     

T—2毒素对CHL细胞的微核试验

T-2毒素是1种单端孢霉烯类毒素,为判断该毒素是否具有诱变性,我们对其进行了CHL细胞微核试验。T-2毒素由上海农科院植保所提供培养物,本所提取,细胞为中国仓鼠肺细胞克隆亚系CHL-1,细胞培养于HAMF-12培养基,37℃、5％、CO_2、95％湿度下单层培养,另加10％新生牛血清。细胞接种量为每25ml培养瓶2-4×10~5,接种后24h加入T-2毒素等。根据T-2毒素对CHL细胞     

大肠各类型息肉腺腔内脱落细胞及其粘液物质的病理研究

对７３例大肠各类型息肉的腺腔内脱落细胞和粘液物质进行了研究。脱落细胞按形态特征分为增生上皮型，异型上皮型，核固缩型，核凋谢型和微核型五种。结果炎性息肉，幼年性息肉和增生性息肉粘液分泌增多，并以唾液酸粘液和混合粘液为主，腺腔内有数量不等的中性白细胞浸润，少数病例有增生上皮型，异型上皮型和微核型细胞脱落，息肉状腺瘤，绒毛状腺癌和腺癌瘤变的粘液分泌减少，显示硫酸粘液和混合粘液为主，腺腔内有多量异型上皮型，核固缩型，核凋谢型和微核型细胞脱落，并随异型增生程度加重而递增，同管状腺癌相一致。提示观察大肠各类型息肉腺腔内脱落细胞的分型和粘液物质的变化，有助于判断病变的性质和发展趋势。