腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因转移及诱导胃癌细胞凋亡

目的：探讨p21^WAF1/CIP1基因（p21基因）过表达对人胃癌细胞恶性表型和细胞凋亡的影响，进一步了解p21基因对肿瘤细胞的治疗作用。方法：通过腺病毒介导外源性p21基因转移到有p53基因突变的人胃癌细胞系SGC－7901，对p21基因的表达、细胞生长的抑制与投机和对肿瘤模型的治疗效果进行分析。结果：外源性p21基因在靶细胞高水平表达显著抑制了胃癌细胞的生长和集落形成，流式细胞仪检测显示G1期阻滞并发生了凋亡。瘤内注射Ad-p21对裸鼠体内移植瘤有一定抑瘤作用。结论；p21基因可能参与肿瘤细胞凋亡的诱导，使p21基因在肿瘤的基因治疗，特别是在与其他凋亡诱导因子联合作用的方案中有更好的应用前景。     

联合应用新城疫病毒及其 HN基因对小鼠黑色素瘤抑制效应的研究

背景与目的:尽管新城疫病毒( Newcastle disease virus, NDV)对多种肿瘤具有抑制作用 ,但其抑瘤机制尚不完全清楚.以前的研究结果表明,该病毒的血凝素神经氨酸酶( hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因在该病毒的抗肿瘤作用上发挥重要作用且 HN蛋白表达后能够定位于肿瘤细胞膜上,以 HN蛋白作为肿瘤细胞的外源抗原来研究其抑瘤作用尚未见报道.本研究拟探讨 HN蛋白作为外源抗原在新城疫病毒抗肿瘤的作用以及二者联合应用对小鼠黑色素瘤的抑制效应.方法:在 C57BL/6小鼠右后肢皮下接种 B16黑色素瘤细胞 2× 105个.荷瘤第 2天,左后肢肌肉注射含新城疫病毒 HN基因的重组质粒,荷瘤第 7天,瘤内注射新城疫病毒 2× 109pfu;同时设单独 HN基因或 NDV治疗组及注射 PBS的对照组.通过抑瘤率观察动物体内的抑瘤效果;通过特异性细胞毒 T淋巴细胞( cytotoxic T lymphocyte,CTL)实验, ICAM Ⅰ、 CD48及新城疫病毒 HN蛋白在肿瘤细胞表面表达检测,探讨 HN蛋白所介导的抑瘤作用.结果:联合应用新城疫病毒及该病毒 HN基因对肿瘤的抑制效果明显好于单独 HN基因及新城疫病毒,抑瘤率达 82.8%,特异性 CTL反应增强,对靶细胞的杀伤率为 18.4%;单独 HN基因及新城疫病毒治疗组的抑瘤率分别为 56.6%、 41.0%,特异性 CTL活性分别为 4.4%、 10.1%;瘤内注射 NDV的肿瘤细胞表面检测到 HN分子的表达, ICAM Ⅰ、 CD48分子表达上调.结论:定位于肿瘤细胞表面的 HN蛋白介导机体对肿瘤细胞的特异性杀伤,联合应用新城疫病毒及该病毒 HN基因显著增强了机体对肿瘤细胞的杀伤效应.     

脂质体介导的体内外细胞因子基因转移效果的初步研究

本研究用反相蒸发技术制备出包裹IL-2 DNA或IL-6 DNA的脂质体，将其与体外培养的靶细胞共育，或将其直接注射至小鼠腹腔内及荷瘤小鼠的瘤体内．研究其介导体内外基因转移的效果，结果表明我们研制的脂质体不但能将目的基因转移至体外培养的靶细胞中，并可通过腹腔内注射及瘤体内注射后，在腹腔内及肿瘤原位直接将IL-2和IL-6基因转移至腹腔细胞及肿瘤细胞中，稳定表达IL-2和IL-6。     

TNFα基因和IL-2基因共转染的肿瘤细胞体内致瘤性和瘤苗效果的观察

如同联合应用两种具有协同作用的细胞因子可以达到更佳的免疫治疗效果一样，如果将两种具有协同作用的细胞因子基因共转染人一种肿瘤细胞内，此肿瘤细胞可能会具有更佳的抗肿瘤效果。IL-2和TNFα具有协同抗肿瘤作用和免疫调节作用。因此，本文选用IL-2基因和TNFα基因为共转染的目的基因，通过两步基因转移共转染人B16黑色素瘤细胞，观察了体内致瘤性和瘤苗效果。     

腺病毒介导的FasL基因转移及对肺癌细胞生长和凋亡的影响

目的：探讨FasL基因对人肺癌的作用以及FasL基因治疗肺癌的可能性。方法：通过腺病毒载体介导FasL基因转移到低水平表达FasL的人肺腺癌细胞系A549,对FasL基因的表达、细胞生长的抑制和肿瘤生长模型的治疗效果进行分析。结果：外源性FasL基因在靶细胞高水平的表达显著抑制了A549的生长和集落形成，流式细胞仪检测显示细胞G1期阻滞并发生了凋亡。瘤内注射Ad-FasL对裸鼠体内移植瘤有一定的抑瘤作用。结论：FasL基因参与了肿瘤细胞凋亡的诱导，能抑制肺腺癌细胞的生长，因此本基础在肿瘤的基础治疗上有着广泛的应用前景。     

Rb基因对肺腺癌细胞株生长的抑制作用

目的：探讨重组腺病毒载体的转染效率及其介导外Ｒｂ基因进肿瘤细胞的效果，观察外源Ｒｂ基因在肿瘤细胞内的表达及其对捉瘤细胞生长的抑制作用。为肿瘤的基因治疗提供实验依据。方法：构建Ｒｂ基因重组腺病毒载体。体外转染人肺腺癌细胞标ＧＬＣ－８２。应用免疫组化和聚合酶链反应等技术，观察Ｒｂ基因在细胞内的状态及表达情况。应用细胞计数及流式细胞仪检测肿瘤细胞的生长情况。结果：ＧＬＣ－８３细胞内存在基因组Ｒｂ基因，但     

重组复制缺陷型腺病毒Ad-p53AIP1的抗肿瘤效应及其作用机制

目的：探讨外源性p53AIP1（p53-regulated apoptosis—inducing protein1）基因抗肿瘤效应及其作用机制，以评估声3A，H基因在肿瘤基因治疗中应用的可行性。方法：构建携带p53AIP1基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad—p53AIP1，感染人肝癌细胞HepG2，应用MTT比色法、Westernblotting、流式细胞术、罗丹明染色以及电镜等观察外源性p53AIP1基因表达对肿瘤细胞的作用及其相关机制。小鼠皮下接种感染Ad—p53AIPl的小鼠乳腺癌4T1细胞，观察Ad—p53AIP1对肿瘤细胞体内成瘤性的影响；建立4T1细胞皮下移植瘤小鼠模型，直接瘤内多点注射重组腺病毒，观察Ad—p53AIP1的抗肿瘤疗效。结果：感染Ad—p53AIP1的HepG2细胞能够高效表达p53AIP1蛋白。MTT检测显示Ad—p53AIP1对人肝癌细胞HepG2的生长抑制率达50％以上；流式细胞术分析证实p53AIP1使肿瘤细胞周期阻滞于G2／M期；罗丹明染色、电镜观察以及凋亡相关蛋白PARP表达的检测均证实p53AIP1能诱导肿瘤细胞发生明显凋亡。感染Ad—p53AIPl的肿瘤细胞体内成瘤受到非常明显的抑制（P〈0．01），Ad—p53AIP1瘤体注射对移植瘤生长也有明显的抑制作用（P〈0．05）。Western blotting以及RT—PCR检测证实Ad—p53AIP1对声3mRNA表达无影响，能下调mdm2基因的表达；p53AIP1能上调P53蛋白的表达、下调MDM2蛋白的表达水平，同时还影响P21等细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达。结论：p53AIP1有明显的体内外抗肿瘤作用，其作用机制与其反向调控P53蛋白、调控多种细胞周期和细胞凋亡相关蛋白、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡有关，该基因在肿瘤基因治疗中具有潜在的应用前景。     

脂质体介导Endostatin IL-12基因联合治疗移植型鼠肝癌的实验研究

目的:探讨脂质体介导Endostatin及IL-12基因联合治疗肝癌的可行性.方法:将已构建的Endostatin和IL-12真核表达载体给荷瘤BALB/c鼠瘤内注射,每周两次测量瘤体积.ELISA法检测肿瘤局部IL-12、IL-2、Endostatin含量,MTT法检测NK细胞杀伤活性,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡情况.结果:联合治疗组肿瘤体积明显小于其它各组(P＜0.05);肿瘤局部IL-12、IL-2、Endostatin的表达明显高于pVAX1空载体和生理盐水对照组(P＜0.05);NK细胞杀伤率和肿瘤细胞凋亡率分别为52.0%和48.2%.结论:联合应用Endostatin和IL-12基因可有效抑制鼠肝癌的生长.     

重组复制缺陷型腺病毒Ad p53AIP1的抗肿瘤效应及其作用机制

目的:探讨外源性p53AIP1（p53regulated apoptosisinducing protein 1）基因抗肿瘤效应及其作用机制，以评估p53AIP1基因在肿瘤基因治疗中应用的可行性。方法：构建携带p53AIP1基因的重组复制缺陷型腺病毒Adp53AIP1，感染人肝癌细胞HepG2，应用MTT比色法、Western blotting、流式细胞术、罗丹明染色以及电镜等观察外源性p53AIP1基因表达对肿瘤细胞的作用及其相关机制。小鼠皮下接种感染Adp53AIP1的小鼠乳腺癌4T1细胞，观察Adp53AIP1对肿瘤细胞体内成瘤性的影响;建立4T1细胞皮下移植瘤小鼠模型, 直接瘤内多点注射重组腺病毒，观察Adp53AIP1的抗肿瘤疗效。结果：感染Adp53AIP1的HepG2细胞能够高效表达P53AIP1蛋白。MTT检测显示Adp53AIP1对人肝癌细胞HepG2的生长抑制率达50％以上；流式细胞术分析证实p53AIP1使肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期；罗丹明染色、电镜观察以及凋亡相关蛋白PARP表达的检测均证实p53AIP1 能诱导肿瘤细胞发生明显凋亡。感染Adp53AIP1的肿瘤细胞体内成瘤受到非常明显的抑制（P<001）, Adp53AIP1瘤体注射对移植瘤生长也有明显的抑制作用（P<0.05）。Western blotting以及RTPCR检测证实Adp53AIP1对p53mRNA表达无影响，能下调mdm2 基因的表达；p53AIP1能上调P53蛋白的表达、下调MDM2蛋白的表达水平，同时还影响P21等细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达。结论：p53AIP1有明显的体内外抗肿瘤作用，其作用机制与其反向调控P53蛋白、调控多种细胞周期和细胞凋亡相关蛋白、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡有关，该基因在肿瘤基因治疗中具有潜在的应用前景。     

新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤的治疗

目的：寻求有效的肿瘤基因治疗方法，研究新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因在无胸腺裸鼠体内的抗肿瘤作用。方法：建立BALB/c裸小鼠荷人结肠癌模型，瘤内注射脂质体包裹的真核重组子pVHN和pVVP3。观测pVHN和pVVP3治疗荷HCT裸鼠的效果，免疫组化法检测肿瘤细胞Bcl2和PCNA的表达。结果:经HN基因和VP3基因联合治疗组的小鼠与荷瘤对照组小鼠相比，肿瘤体积明显缩小，抑瘤率可达70%。病理组织切片表明，治疗组裸鼠体内肿瘤细胞大量凋亡，局部地方可见细胞消失。免疫组化表明， Bcl2和PCNA蛋白在荷HCT裸鼠对照组与各治疗组均有表达，其中Bcl2表达在荷瘤对照组与pVHN治疗组差异有显著意义（P<0.05），PCNA表达在荷瘤对照组与pVHN+pVVP3治疗组差异极其显著（P<0.01）。结论: NDV HN基因与凋亡素VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤细胞的增殖有一定抑制作用，可诱导其凋亡,其凋亡可能与下调Bcl2表达有关。     

瘤内注射pSTbAT-脂质体复合物对裸鼠移植瘤抑制效应的实验研究

目的：构建血管生成抑制因子arresten基因的真核表达载体，并观察瘤内注射质粒DNA-脂质体复合物对裸鼠移植瘤生长的影响。方法：利用PCR方法，由重组质粒pGEM-Arr中扩增出基因；将该基因定向克隆于真核表达载体中。20只裸鼠皮下注射Hepp2细胞，成瘤后以成功构建的质粒DNA-脂质体复合物瘤内注射，治疗后采用免疫组化方法检测肿瘤血管密度，并利用arresten基因瘤内注射的方法对抑制肿瘤的效果进行分析。结果：我们成功构建arresten基因真核表达载体(psTbAT)。实验组肿瘤生长速度较对照组慢(实验组平均15．3个阳性血管／10个视野，对照组平均112．5个阳性血管／10个视野)。结论：瘤内注射arresten基因质粒-DNA复合物能抑制裸鼠移植瘤的血管生成，并能抑制移植瘤的生长。     

双基因（VP3、IL-18）联合致小鼠骨肉瘤S-180细胞凋亡的效应

目的探讨VP3、IL-18双基因抑制骨肉瘤S-180的联合抑瘤作用。方法将VP3、IL-18基因插入pVAX1表达载体的pCMV启动子之下的EcoRI位点，构建成pVVP3及pVVp3-IL18。将该重组质粒与单独表达凋亡素基因的重组质粒分别注射荷S-180肿瘤细胞的BALB／C小鼠，比较抑瘤趋势和抑瘤率。结果联合应用VP3基因和IL-18基因的重组病毒治疗组的抑瘤率（46．16％）高于单独应用VP3基因组的抑瘤率（19．56％），两组比较有统计学差异（P〈0．05）。结论凋亡素基因具有凋亡诱导效应及体内的抑瘤效应。凋亡素基因VP3与IL-18基因有协同抑瘤效应，联合基因治疗骨肉瘤可提高抑瘤效果。     

TIP30基因腺病毒载体的构建及体内外抑癌作用

目的 利用缺陷型腺病毒载体表达TIP30基因,观察其体内外抑瘤作用。方法 用Ad-Easy^TM系统,在大肠杆菌同源重组,构建Ad-TIP30腺病毒载体,经在293细胞内成功包装并鉴定后,感染p53基因型不同的肝癌细胞株HepG2(p53-wt)、PLC／PRL／5(p53-mut)和骨肉瘤细胞株Saos-2(p53-null)。用台盼蓝拒染法检测存活细胞,观察TIP30的体外抑瘤作用;用RT-PCR方法检测HepG2细胞p53基因的表达水平;通过裸鼠皮下肝癌移植瘤模型观察Ad-TIP30的体内抑瘤效果。结果 Ad-TIP30对3种肿瘤细胞的增殖均有抑制作用,但对p53基因野生型的肝癌细胞株HepG2抑制作用最明显。经Ad-TIP30感染后,HepG2细胞p53基因表达水平显著升高。Ad-TIP30可显著抑制裸鼠皮下肿瘤的生长,其抑瘤率达62．8％。结论 腺病毒载体表达TIP30基因可通过p53基因依赖性或非依赖性途径抑制肿瘤细胞的增殖,是一种潜在的肿瘤生物治疗手段。     

干细胞介导溶瘤腺病毒治疗脑胶质瘤研究进展

溶瘤腺病毒治疗具有肿瘤特异性、安全性和反复表达治疗基因等特点,通过溶瘤腺病毒治疗胶质细胞瘤已获得令人鼓舞的成果,但局部应用溶瘤腺病毒无法作用于散在分布的肿瘤细胞,影响了治疗效果.干细胞对脑胶质瘤具有内在趋化作用,介导溶瘤腺病毒治疗胶质瘤可进一步提高疗效.     

IL-2、IL-4基因转染后B16细胞表面ICAM-1的表达及其肿瘤细胞致瘤原性的变化

IL-2、IL-4基因转染的肿瘤细胞接种至体内后致瘤原性显著下降甚至消失，但是由于所染的细胞因子基因、肿瘤细胞、细胞因子表达水平及动物模型等方面的差异这些细胞因子基因修饰的肿瘤致瘤原性下降的免疫学机理也有不同，但均与这些肿瘤细胞体内接种后，机体肿瘤免疫功能的增强有关，     

肿瘤生物治疗新方法的研究

本文简述“九五”攻关项目间“肿瘤生物治疗新方法”且经协作攻关主要完成的研究工作有：重组人TNF、IL－2及B7重组腺病毒表达载体的构建及其包装体系的建立：腺病毒介导的人TNF－α基因转染对人肝癌细胞凋亡和MHC－Ⅰ类分子表达的影响;瘤体内／瘤周注射TNF－α重组腺病毒和（或）IL－2T重组腺病毒对肝癌小鼠的治疗作用及其免疫机理研究。粘附LAK细胞的制备、体外扩增、冻存及复苏;转染B7、IL－2、TNF－α基因重组腺病毒的肿瘤细胞及A－LAK的生物学特性研究;人肝癌组织中MAG基因的表达及MAGE基因修饰树突状细胞体外抗肿瘤作用;转基因瘤苗临床应用安全性的初步性的初步检测,这些研究工作的完成为肿瘤基因治疗的临床应用打下基础。     

腺病毒介导的FasL基因转移及对胃癌细胞生长和凋亡的影响

目的：探讨FasL基因对人胃癌的作用以及FasL基因治疗胃癌的可能性。方法：通过腺病毒载体介导FasL基因转移到低水平表达FasL的人胃癌细胞系SGC－7901,对FasL基因的表达,细胞生长的抑制与机制和对肿瘤生长模型的治疗效果进行分析。结果：外源性FasL基因在靶细胞高水平的表达,显著抑制了SGC－7901的生长和集落形成,流式细胞仪检测显示细胞G1期阻滞并发生了凋亡。瘤内注射Ad-FasL对裸鼠体内移植瘤有一定的抑瘤作用。结论：FasL基因参与了肿瘤细胞凋亡的诱导,能抑制胃癌细胞的生长,因此该基因在肿瘤的基因治疗上有着广泛的应用前景。     

光动力学疗法对小鼠Heps肝癌移植瘤COX-2表达的影响

目的 探讨光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)对Heps肝癌移植瘤环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表达的影响及意义.方法 采用免疫组化染色,观察PDT后Heps肝癌移植瘤COX-2表达的动态变化.结果 PDT后2～72 h内4个时间点,肿瘤细胞COX-2表达较对照组明显升高(P<0.01),治疗后72 h肿瘤细胞COX-2表达较2、6和24 h下降(P<0.05).结论 PDT可诱导残存肿瘤细胞COX-2表达增加.     

应用TNF基因转染细胞进行的肿瘤实验性免疫疗法

我们应用逆转录病毒载体pLXSN将人IL-2基因插入大鼠和人的肿瘤细胞，探讨了携带外源性IL-2基因的肿瘤细胞的体内外生物学特性及其意义。转基因缃胞在体外培养中的细胞形态、生长特性以及软琼脂集落形成能力未见明显改变，但对杀伤性免疫活性细胞的杀伤更为敏感，与淋巴细胞混合培养的上清中测得更高水平的IFN和TNF活性。大鼠肿瘤细胞WBT插入IL-2基因后，其体内成瘤性明显下降。腹腔接种WBT／IL-2细胞可使大鼠获得抗肿瘤免疫能力以抑制皮下野生型WBT细胞的生匠。携带IL-2基因的人和大鼠肿瘤细胞在裸鼠体内可以成瘤，但生长缓慢。具有高转移能力的Anip973细胞插入IL-2基因后，在裸鼠体内的转移性丧失。结果提示IL-2基因插入肿瘤细胞进行肿瘤基因治疗的有效性、可行性和发展潜能。     

联合自杀基因与IL-2基因转移疗法的抗肿瘤效果及其抗肿瘤免疫应答的诱导作用

单用自杀基因疗法或单用细胞因子基因疗法抗肿瘤效果不理想,本研究中我们观察了大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(CD)基因与白细胞介素2(IL-2)基因联合转移对荷瘤小鼠的治疗效果及其对抗肿瘤免疫的诱导作用。复制荷瘤小鼠模型后在荷瘤部位注射表达CD基因的重组腺病毒(AdCD)及表达小鼠IL-2基因的重组腺病毒(AdIL2),并连续10天、每天1次腹腔注射5氟胞嘧啶(5FC)对荷瘤小鼠进行治疗。结果表明,AdCD/5FC/AdIL2联合基因治疗能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长,并明显延长其生存期(P<0.01)。联合基因治疗组小鼠肿瘤细胞发生明显的坏死,瘤内及瘤周有大量的炎性细胞浸润,瘤内CD4~ 和CD8~ T细胞明显增加,脾细胞NK和CIL杀伤活性明显高于单用AdCD/5FC、对照病毒AdLacZ/5FC或PBS组。实验结果表明,联合应用自杀基因与细胞因子基因治疗可更有效诱导机体的抗肿瘤免疫反应,从而更显著地抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。