瘤内注射脂质体IL-2基因复合物治疗实验性肝癌

利用瘤内注射法将治疗基因直接转入体内的肿瘤细胞并获得表达，一方面可以提高治疗基因对肿瘤细胞的针对性，减少对非靶细胞可能带来的毒副作用，另一方面也较简便，更适应临床应用的需要。本文初步探讨了瘤内注射脂质体-IL-2基因复合物在实验性肝癌基因治疗中的应用将IL-2基因克隆人真核表达载体pME18S，     

SA脂质体介导血管抑素和／或内皮抑素基因治疗Lewis肺癌小鼠的实验研究

 目的 观察SA脂质体介导血管抑素和／或内皮抑素基因对Lewis肺癌小鼠移植瘤生长、转移的抑制作用。方法 建立C57BL／6j小鼠肺癌模型，30只荷瘤鼠随机分空白对照组，SA脂质体对照组，血管抑素基因（pAng）治疗组，内皮抑素基因（pEnd）治疗组，血管抑素和内皮抑素基因联合治疗组，每组6只。以SA脂质体介导，将血管抑素和／或内皮抑素基因直接注入移植瘤内，每周2次，共6周，每周测瘤体大小2次，6周末处死所有小鼠，观察瘤体大小变化、肺表面转移灶数、生存期等。结果 各治疗组均能抑制肿瘤增长及肺内转移，与对照组比较有统计学意义（P＜0.01），小鼠活动能力、饮食、对外界刺激的反应能力均无明显改变，生存期明显长于对照组。结论 SA脂质体介导血管抑素和／或内皮抑素基因治疗可有效地抑制Lewis肺癌移植瘤的生长、转移，生存期明显长于对照组。     

联合自杀基因与IL-2基因转移疗法的抗肿瘤效果及其抗肿瘤免疫应答的诱导作用

单用自杀基因疗法或单用细胞因子基因疗法抗肿瘤效果不理想,本研究中我们观察了大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(CD)基因与白细胞介素2(IL-2)基因联合转移对荷瘤小鼠的治疗效果及其对抗肿瘤免疫的诱导作用。复制荷瘤小鼠模型后在荷瘤部位注射表达CD基因的重组腺病毒(AdCD)及表达小鼠IL-2基因的重组腺病毒(AdIL2),并连续10天、每天1次腹腔注射5氟胞嘧啶(5FC)对荷瘤小鼠进行治疗。结果表明,AdCD/5FC/AdIL2联合基因治疗能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长,并明显延长其生存期(P<0.01)。联合基因治疗组小鼠肿瘤细胞发生明显的坏死,瘤内及瘤周有大量的炎性细胞浸润,瘤内CD4~ 和CD8~ T细胞明显增加,脾细胞NK和CIL杀伤活性明显高于单用AdCD/5FC、对照病毒AdLacZ/5FC或PBS组。实验结果表明,联合应用自杀基因与细胞因子基因治疗可更有效诱导机体的抗肿瘤免疫反应,从而更显著地抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。     

人CD80基因的重组真核表达载体的构建及其在体内外的表达

构建了人ＣＤ８０ｃＤＮＡ重组真核表达载体ＰＣＤ－ＣＤ８０，并将这一重组表达载体用脂质体介导的基因转移技术转染至体外培养的小鼠黑素瘤Ｂ１６细胞系，并经直接注射浆裸露ＤＮＡ导入小鼠肌肉组织。     

IL-6基因转染的白血病细胞不同条件下体内外分泌IL-6水平的研究

我们将IL-6基因转染至FBL-3红白血病细胞,建立了高分泌IL-6的FBL-3-IL-6~ 细胞克隆株,并观察了不同照射剂量下其体外生长情况,IL-6分泌水平及不同途径接种人体内后血清和注射局部细胞培养上清中IL-6含量。将IL-6基因转染的FBL-3-IL-6~ 细胞调成1×10~5/ml浓度,分放于瓶中,置钴~(60)下分别照射不同剂量后,置5％CO_2中培养,观察其生长情况和半数死亡时间和全部死亡时间,并每日收集上清冻存待测IL-6。另外将高分泌IL-6的FBL-3-IL-6~ 细胞以2×10~5浓度分别通过腹腔和左股部皮下注入小鼠体内,并于不同时间取小鼠血清测IL-6含量(同时没对照组)。结果表明,当体外照射剂量<500Rad时,不能有效地控制白血病细胞的增殖能力,且于半个月中能保持较高水平的IL-6分泌量。所以当制备灭活的瘤苗时,以选用800Rad的钴~(60)照     

腹腔内注射IL-2重组腺病毒、IL-3重组腺病毒增强化疗药物抗白血病作用的研究

对实验性白血病小鼠模型大剂量化疗后,直接腹腔注射IL-2重组腺病毒(Ad-IL-2)和/或IL-3重组腺病毒(Ad-IL-3),发现腹腔注射对照腺病毒载体小鼠虽经大剂量化疗,仍有大量白血病细胞浸润至骨髓、血管、肝脏及脾脏。而腹腔注射Ad-IL-2或Ad-IL-3组小鼠肿瘤生长缓慢,注射Ad-IL-2组小鼠脾NK、CTL活性显著提高,注射Ad-IL-3组小鼠腹腔巨噬细胞数量及杀伤活性明显提高,联合应用Ad-IL-2,Ad-IL-3组小鼠抗白血病作用最为明显,骨髓中虽然仍见白血病细胞,但可见较多正常造血细胞,且肝、脾中未见白血病细胞浸润。表明腹腔内注射Ad-IL-2和Ad-IL-3可显著增强大剂量化疗对白血病的治疗效果。     

应用TNF基因转染细胞进行的肿瘤实验性免疫疗法

我们应用逆转录病毒载体pLXSN将人IL-2基因插入大鼠和人的肿瘤细胞，探讨了携带外源性IL-2基因的肿瘤细胞的体内外生物学特性及其意义。转基因缃胞在体外培养中的细胞形态、生长特性以及软琼脂集落形成能力未见明显改变，但对杀伤性免疫活性细胞的杀伤更为敏感，与淋巴细胞混合培养的上清中测得更高水平的IFN和TNF活性。大鼠肿瘤细胞WBT插入IL-2基因后，其体内成瘤性明显下降。腹腔接种WBT／IL-2细胞可使大鼠获得抗肿瘤免疫能力以抑制皮下野生型WBT细胞的生匠。携带IL-2基因的人和大鼠肿瘤细胞在裸鼠体内可以成瘤，但生长缓慢。具有高转移能力的Anip973细胞插入IL-2基因后，在裸鼠体内的转移性丧失。结果提示IL-2基因插入肿瘤细胞进行肿瘤基因治疗的有效性、可行性和发展潜能。     

巨噬细胞介导的对肿瘤细胞细胞毒的可能机制

作者在实验及复习文献的基础上,观察到激活的巨噬细胞与靶细胞共同培养6小时,即可抑制~(125)IUDR掺入到肿瘤细胞核的DNA内,但在对肿瘤靶细胞产生细胞毒之前,靶细胞仍有分裂现象。为此,作者以形态学及速流荧光技术(flow microfluorometry,FMF)进一步研究在有激活的巨噬细胞存在时,肿瘤靶细胞的增殖和DNA合成情况。作者用非整倍体的Lewis肺肿瘤细胞(LL)作靶细胞。经腹腔给C 57 BL/6J小鼠注射短小棒状杆菌(35—70毫克/公斤)或吡喃共聚物(25毫克/公斤),7天后收集腹腔激活的巨噬细胞;正常巨噬细胞由未经任何处理的小鼠或实验前四天腹腔注射0.5毫升2.5%牡蛎肝糖元Ⅱ的小鼠直接腹腔灌洗获得。     

瘤体内直接注射白介素2质粒复合物治疗小鼠肝癌

目的研究瘤体内直接注射白介素2质粒/阳离子脂质体复合物治疗小鼠肝癌的效果.方法将小鼠白介素2表达质粒(VR1110)与阳离子脂质体(Transfectam)按适当比例混合而形成复合物(VR1110/Transfectam).通过瘤体内直接注射此复合物治疗小鼠肝癌模型,并和卡介苗(BCG)的治疗相比较.结果瘤体内注射VR1110/Transfectam后,可在肿瘤组织中检测到小鼠IL-2 mRNA的表达.VR1110/Transfectam治疗组以及VR111/Transfectam/BCG治疗组肿瘤生长较其它组明显减慢,均显著提高小鼠的生存率(R＜0.05),但二者相差不明显.结论瘤体内直接注射VR1110/Transfectam复合物对小鼠肝癌的治疗作用明显,效果优于卡介苗,且方法简单,适合临床应用.     

重组腺病毒介导的细胞因子基因疗法的实验研究

IL-4是一种较强的巨噬细胞激活因子。将IL-4基因转染巨噬细胞可使其表达较高水平的IL-4并可使其抗肿瘤活性明显增强。M-CSF在体外能促进单核／巨噬细胞的生长。研究表明，重组IL-4及M-CSF在体外具有协同维持巨噬细胞生长的作用。因此，将IL-4基因及M-CSF基因同时转移至巨噬细胞，将有可能对其抗肿瘤活性产生一定的影响。     

B7-1基因转染小鼠EL-4淋巴瘤诱导带瘤宿主抗瘤效应的体内研究

本文研究了IL-2、IL-4、IL-6基因转染后B16黑色素瘤细胞表面MHCⅠ类抗原及ICAM-1的表达水平,并探讨了其在CTL诱导过程中的作用.结果表明,IL-2、IL-4、IL-6基因转染的B16黑色素瘤细胞表面MHCⅠ类抗原及ICAM-1表达均高于野生型B16黑色素瘤细胞及转染对照质粒的B16黑色素瘤细胞.体内接种后,小鼠脾脏CTL活性明显增强,CTL培养体系中IFN-γ、TNF-α的分泌水平也增高.在CTL诱导体系中加入抗ICAM-1单抗可以抑制CTL的活化,加入抗MHCⅠ类分子单抗后可使CTL的活化完全阻断.这提示细胞因子基因转染可能通过使肿瘤细胞表面MHCⅠ类抗原、ICAM-1的表达增加,从而增强瘤苗的免疫原性.     

pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体的构建及其抗肿瘤作用研究

目的:探索小鼠IL-18基因治疗肿瘤的方法和疗效。方法:构建pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体,并用其转染HT-29细胞,RT-PCR和ELISA检测IL-18表达情况;将转染pSecTag2B-mIL-18质粒的HT-29培养上清,加入到小鼠T淋巴细胞培养液,ELISA、RT-PCR检测T淋巴细胞分泌IFN-γ;脂质体包被的pSecTag2B-mIL-18裸质粒,采用肌肉注射法转入Balb/c小鼠,检测IL-18蛋白表达情况;在Balb/c小鼠接种小鼠co-lon-26肿瘤细胞的同时,将表达载体pSecTag2B-mIL-18转入,观察抑制肿瘤生长的情况。结果:1)经酶切和测序鉴定,pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体所表达的基因序列经比对完全正确。2)pSecTag2B-mIL-18转染HT-29细胞后,IL-18在mRNA和蛋白水平高表达。3)转染后的HT-29培养上清可刺激小鼠T淋巴细胞高水平分泌IFN-γ。4)用裸质粒肌肉注射法将pSecTag2B-mIL-18转入Balb/c小鼠,证明质粒均能够在小鼠肌肉中表达,且表达的蛋白均能分泌到外周血液循环中。5)接种co-lon26细胞的Balb/c小鼠,将pSecTag2B-mIL-18转入小鼠,结果表明IL-18单独应用能明显抑制肿瘤的生长。结论:pSecTag2B-mIL-18裸质粒肌肉注射具有显著的抗肿瘤作用。     

重组人白介素2梯度胶的肽图分析

白细胞介素17(IL-17)是一新近发现的由活化T淋巴细胞产生的细胞因子,初步研究表明它可能参与T淋巴细胞与造血系统的相互作用,由于IL-17的研究工作刚刚起步,对其确切功能并不完全清楚.为了进一步了解IL-17的生物学功能及可能机制,我们从活化的人外周血单个核细胞中克隆了人IL-17基因的编码序列,将其克隆至本室构建的克隆、表达、测序一体化载体 pLCM182中,经序列测定结果与报道基因序列一致后在大肠杆菌中进行表达,结果发现经诱导后其表达量可达30%以上.IL-17的表达产物在体外能刺激原代培养的人成纤维细胞分泌IL-6和GM-CSF,证明所表达的IL-17具有生物学活性.     

人白细胞介素17(IL-17)的克隆及其在大肠杆菌中的表达

树突状细胞(DC)是一类能特异性启动T淋巴细胞介导的免疫反应的抗原提呈细胞,与其它抗原提呈细胞不同的是,树突状细胞能激活初始型T淋巴细胞(naive T cells).近年来,人们试图通过刺激血液中的前体细胞以提高DC的量.最近,有学者通过GM-CSF、IL-4及MCM的培养单个核细胞中获得了DC.本研究对此法加以改良并从恒河猴血中获得了形态、表型及功能均与人成熟DC非常类似的DC.去除了T细胞的单个核细胞在含有1%人血清及GM-CSF和IL-4的培养基中培养,在第7天,50%的培养基换成单核细胞的条件培养基MCM.此培养基是获得成熟的具有免疫刺激作用的DC所必需的,这样可从2Oml血中获得0.5-1.0×10~6DC.对这些DC与在同样培养基中培养产生的巨噬细胞的比较表明,这些DC刺激同种异体T细胞的能力较巨噬细胞明显增强,而且这些DC的形态和表型很典型且能表达高水平的p55及与细胞内CD68.对比之下,贴壁的巨噬细胞表达非常低水平的p55及高水平的弥漫性CD68,用此方法制备的恒河猴     

经尿道灌注自杀基因治疗大鼠膀胱癌的实验研究

目的:探讨经尿道膀胱灌注脂质体和逆转录病毒载体介导的自杀基因(HSVtk),观察在羟基无环鸟苷(ganciclovir,GCV)作用下大鼠膀胱肿瘤的生长情况.方法:用N-甲基-亚硝基脲(MNU)膀胱灌注建立大鼠原位膀胱癌模型.经尿道膀胱灌注脂质体、逆转录病毒载体HSVtk基因,随后腹腔内注射GCV,连续6天.结果:经尿道膀胱灌注HSVtk基因后48h,RT-PCR检测出膀胱肿瘤中HSVtk基因表达.逆转录病毒组和脂质体组膀胱总重量与裸质粒组和对照组相比有显著差异,表明膀胱肿瘤的生长被抑制.TUNEL法原位检测肿瘤组织中凋亡细胞不仅出现在表层细胞,而且深层细胞大量凋亡,推测旁观者效应可能发挥了一定作用.结论:经尿道膀胱灌注脂质体DNA或重组逆转录病毒载体可以向肿瘤转导HSVtk基因.HSVtk/GCV系统能抑制大鼠原位膀胱肿瘤的生长,显示出抗肿瘤作用.     

转基因细胞SPC-A-1/IL-2的致突变性研究 *

目的：观察转基因细胞ＳＰＣ－Ａ－１／ＩＬ－２的致突变作用,为转基因肿瘤细胞作为瘤苗进行临床应用的安全性检测提供依据。方法：在人ＩＬ－２的ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ重组并完成ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ包装体系的基础上,将ＩＬ－２基因导入人肺腺癌胸膜转移细胞系ＳＰＣ－Ａ－１中并得到ＩＬ－２基因的稳定表达,然后通过遗传毒理学实验技术对转基因细胞ＳＰＣ－Ａ－１／ＩＬ－２的ＤＮＡ及培养上清液进行体内和体外的致突变性实验研究。结果：转基因细胞ＳＰＣ－Ａ－１／ＩＬ－２的ＤＮＡ及培养上清液均未显出致突变作用。结论：转基因细胞ＳＰＣ－Ａ－１／ＩＬ－２作为瘤苗应用可初步视为是安全可靠的。     

Aggressive non-Hodgkin's lymphoma: concomitant evaluation of interleukin-2, soluble interleukin-2 receptor, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-10 and correlation with outcome

The purpose of this study was to assess the prognostic value of a large panel of cytokines in aggressive non-Hodgkin's lymphoma (NHL) and to confront it to parameters of the International Prognostic Index (IPI). It investigated the concomitant determination of interleukin-2 (IL-2), soluble interleukin-2 receptor (sIL-2R), interleukin-4 (IL-4), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-10 (IL-10) on a uniform population of 116 previously untreated patients. Commercially available enzyme-linked immunoassay kits were used for cytokines measurements. Results were correlated with complete remission (CR), overall survival (OS) and failure free survival (FFS). In univariate analysis, sIL-2R and IL-6 demonstrated prognostic significance for CR (p = 0.016 and p = 0.048), OS (p = 0.0011 and p = 0.0387) and FFS (p = 0.0001 and p = 0.0363), but multi-variate analysis failed to demonstrate an independent prognostic significance. In the intermediate group risk defined by IPI, patients presenting high level of sIL-2R or IL-6 demonstrated lower CR rate and survival than those with low level. In conclusion, sIL-2R and IL-6 serum levels are elevated in high grade NHL and are correlated to CR, OS and FFS, but this study did not support their independent prognostic value. However, sIL-2R and IL-6 measurements may improve risk assignment by IPI and allow a better prognostic evaluation of patients with intermediate prognosis NHL.     

Increased expression of IL-6 mRNA in hepatocellular carcinoma cell lines correlates with biological characteristics

Background & aims: IL-6 has been implicated in both virus-associated and diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinomas (HCCs). Generally it is produced by immune cells such as Kupffer cells inthe liver. To understand mechanisms by which IL-6 might participate in the genesis of HCCs, the production of IL-6 by cell lines under different conditions was examined to determine inducing factors Methods: Expression of IL-6 mRNA in both hepatoma cell lines and a normal liver cell line L-02 was measured by quantitative RT-PCR. Biological molecules including liposome, dsRNA and cell debris were used to stimulate IL-6 mRNA expression in HepG2 cells and inhibition was effected by RNAi. Proliferation was assessed by MTT and clone formation and migration was determined by scratch assay. Results: All of the HCC cell lines observed expressed IL-6 mRNA, including HepG2, Bel-7402(7402), MHCC-97H and SMMC-7721.Normal liver cell line L-02 also expressed IL-6 mRNA. SiRNA to IL-6 specifically knockdowned IL-6 mRNA expression in HepG2, and liposome, dsRNA and cell debris increased it. Both proliferation and migration of HepG2 cells were related to the level of IL-6 HepG2 expressed. Conclusion: Both normal liver cell line and HCC cell lines can produce IL-6 so that Kupffer cells are noit the only source of the cytokine in the liver well as other immune cells. That the fact that HCC cells reacted to stimulation of biological molecules such as liposome, dsRNA or cell debris with increasing production of IL-6 indicates that the cytokine might play an important role not only in the period of tumor initiation but progression and recurrence as well.     

EGFR小分子多肽配体修饰提高阳离子脂质体对肿瘤细胞的转染效率

目的:用针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的小分子多肽配体D4修饰PEG化的阳离子脂质体,观察其提高质粒DNA和siRNA对肿瘤细胞转染效率的作用。方法:将D4连接在DSPE-PEG2000的末端以修饰PEG化的阳离子脂质体,检测该载体系统对高表达EGFR的人非小细胞肺癌细胞株H1299中质粒DNA转染效率的影响,Sirius照度仪检测质粒DNA转染后H1299细胞荧光素酶的表达,荧光显微镜观察转染FAM-siRNA后H1299细胞的荧光强度。结果:制备的脂质体/质粒DNA复合物随着电荷比的提高,复合物粒径逐渐减小,复合物Zeta电位逐渐升高。在质粒DNA的转染中,与无修饰的非靶向脂质体相比,D4修饰的脂质体可以显著提高H1299细胞中荧光素酶的表达(P<0.05或P<0.01);D4修饰的脂质体在各个电荷比处对H1299细胞的转染效率显著高于无修饰的非靶向脂质体(P<0.05或P<0.01)。在FAM-siRNA的转染中,荧光显微镜下可以观察到D4修饰的脂质体组有更高水平的FAM荧光强度。结论:D4修饰的阳离子脂质体提高高表达EGFR肿瘤细胞中质粒DNA和siRNA的转染效率。